Công nghệ chế biến acid fumaric

Trong bài này ta sử dụng chất sinh trưởng là biotin, tham gia vào coenzyme của các phản ứng chuyển nhóm cacboxylic và CO2 có vai trò quan trọng trong chu trình Krebs... Rhizopus oryzae:

Mục lục:

PHẦN 1: NGUYÊN LIỆU: 3

1.1 Mơi trường: 3

1.2 Giống vi sinh vật: 6

1.2.1 Sơ lược chung về giống Rhizopus: 6

1.2.2 Rhizopus oryzae: 6

1.2.3 Tiêu chuẩn chọn giống vi sinh vật: 7

PHẦN 2: QUI TRÌNH SẢN XUẤT 8

2.1 Sơ đồ qui trình sản xuất: 8

2.2 Thuyết minh qui trình: 9

2.2.2 Tiệt trùng: 10

2.2.3 Nuơi cấy trên mơi trường thu nhận bào tử nấm mốc: 10

2.2.4 Lọc: 11

2.2.5 Lên men: 12

2.2.6 Hấp phụ: 14

2.2.7 Giải hấp phụ: 15

2.2.8 Kết tinh: 15

2.2.9 Ly tâm: 16

2.2.10 Sấy: 17

PHẦN 3: SẢN PHẨM 17

3.1 Giới thiệu chung: 17

3.2 Chỉ tiêu chất lượng sản phẩm: 18

3.3 Ứng dụng của acid fumaric: 18

PHẦN 4: THÀNH TỰU CƠNG NGHỆ 19

4.1 Sản xuất axit fumaric từ axit maleic bằng phản ứng đồng phân hĩa: 19

4.2 Sản xuất đồng thời axit fumaric và chitin từ một lọai vật liệu lignocellulosic giàu nitơ – phân bị sữa – sử dụng Rhizopus oryzae ATCC 20344 19

Danh mục bảng:

Bảng 1 Bảng 1.1: Chỉ tiêu chất lượng của MgSO 4 7H 2 O 3

Bảng 2 Bảng 1.2: Chỉ tiêu chất lượng của KH 2 PO 4 4

Bảng 3 Bảng 1.3: Chỉ tiêu chất lượng của ZnSO 4 7H 2 O 4

Bảng 4 Bảng 1.4: Môi trường nuôi cấy thu nhận bào tử nấm mốc 5

Bảng 5 Bảng 1.5: Môi trường lên men thu nhận acid fumaric 5

Bảng 6 Bảng 4.1: Các đặc điểm của phân bò sữa 20

Danh mục hình: Hình 2.1: Sơ đồ qui trình công nghệ 8

Hình 2.2: Thiết bị phối trộn 9

Hình 2.3: Thiết bị tiệt trùng dạng bản mỏng 10

Hình 2.4: Thiết bị nuôi cấy nấm mốc thu nhận bào tử 11

Hình 2.5: Thiết bị lọc ép sử dụng đĩa lọc 12

Hình 2.6: Rotating biological contactor 13

Hình 2.7: Con đường chuyển hóa glucose thành acid fumaric 13

Hình 2.8: Cột hấp phụ 15

Hình 2.9: Thiết bị phản ứng có cánh khuấy 16

Hình 2.10: Thiết bị lọc ly tâm 17

Hình 2.11: Thiết bị sấy khay 17

Hình 12 Hình 3.1: Công thức cấu tạo của acid fumaric 18

PHẦN 1: NGUYÊN LIỆU:

1.1 Môi trường:

 Nguồn C: glucose

Theo các nghiên cứu đã được công bố nguồn carbon có thể dùng để sản xuất acid fumaric

là glucose, fructose đường nghịch đảo, saccharose, mật rỉ, maltose, tinh bột Trong đó glucose

là nguồn được sử dụng rộng rãi nhất

Chỉ tiêu chất lượng của Glucose:

 Màu sắc: vàng nhạt hoặc không màu và trong suốt

Chỉ tiêu chất lượng của Urea:

 Hàm lượng Nitơ: ≥46.6%

 Biuret: ≤1%

 Độ ẩm: ≤1%

 Kích thước tinh thể: 0.85mm-2.8mm

 Khoáng: MgSO4.7H2O, KH2PO4, , ZnSO4.7H2O

Khoáng và ion kim loại có vai trò rất quan trọng trong lên men

 Các ion kim loại là cofactor của các enzyme

 P là thành phần của acid nucleic, nucleoprotein, phospholipid, coenzyme, ATP…

 S là thành phần của các aminoacid chứa S, một số vitamin

Chỉ tiêu chất lượng của khoáng:

 Chất sinh trưởng: biotin

Chất sinh trưởng ở vi sinh vật là những chất hữu cơ cần thiết cho hoạt động sống của vi sinh vật nhưng tự nó không thể tổng hợp được, chất sinh trưởng có hàm lượng rất nhỏ Chất được xem là chất sinh trưởng cho vi sinh vật này có thể không phải là chất sinh trưởng cho vi sinh vật khác Nhu cầu về chất sinh trưởng phụ thuộc vào môi trường sống, kiểu trao đổi chất của vi sinh vật

Trong bài này ta sử dụng chất sinh trưởng là biotin, tham gia vào coenzyme của các phản ứng chuyển nhóm cacboxylic và CO2 (có vai trò quan trọng trong chu trình Krebs)

Thành phần môi trường Glucose

 Loại : Rhizopus oryzae

1.2.1 Sơ lược chung về giống Rhizopus:

 Rhizopus là nấm sợi được tìm thấy nhiều trên đất, trái cây hoặc rau quả bị thối rửa phân động vật và trên bánh mì Rhizopus là loài gây bệnh phổ biến, chúng thường là nguyên

nhân gây ra các bệnh nhiễm trùng nguy hiểm thậm chí gây chết người, một vài loài thì gây bệnh cho cây trồng

 Giống Rhizopus gồm có một vài loài, trong đó phổ biến là Rhizopus oryzae, Rhizopus azygosporus, Rhizopus microsporus, Rhizopus schipperae, and Rhizopus stolonifer

 Một vài hình thái đặc trưng của loài này là chiều dài của sợi rễ giả và của cuống mang bao tử, đường kính của túi bào tử, hình dạng của cuống …

 Sợi nấm có vách hoặc không có vách, đường kính 6-15 µm, cuống mang bào tử có màu nâu và thường không phân nhánh Chúng có thể phát triển riêng lẻ hoăc thành từng cụm Bào tử có đường kính 40-350 µm nằm trên ngọn của cuống mang bào tử Cuống mang bào tử đường kính 4-11 µm cấu tạo đơn bào, trong suốt hoặc nâu, bề mặt nhẵn hoặc có nếp nhăn

 Loài Rhizopus phát triển nhanh chóng lấp đầy đĩa petri và trưởng thành sau 4 ngày, bề

mặt giống như những sợi bông Lúc đầu nó có màu trắng, sau đó chuyển sang màu xám rồi màu vàng nâu

 Nhiệt độ tối ưu thường 33oC- 40oC bắt đầu bị ức chế ở 45oC

 Rhizopus thường được nuôi cấy, phát triển trên môi trường dịch thể giàu dinh dưỡng

và có thông khí, hệ enzym amylase tương đối hoàn chỉnh, nên thường được dùng trong sản

xuất rượu theo phương pháp amilose

1.2.2 Rhizopus oryzae:

 Hình thái và kích thước:

 Khi phát triển mạnh trên môi trường thạch trong đĩa petri tạo thành một lớp như sợi bông lúc đầu màu trắng rồi nhanh chóng chuyển sang màu xám và phát triển thành những điểm nhỏ màu đen, khi trưởng thành sẻ tạo bào tử

 Sợi nấm trong suốt, đường kính 5-15 µm, giống như dải lụa, phân nhánh không có qui tắc, không có vách ngăn hoặc có vách ngăn nhưng thưa thớt

 Cuống mang bào tử và rễ giả trên thân của sợi nấm Cuống mang bào tử dài 500 -

3500 µm hầu như không phân nhánh, màu vàng nâu đến nâu đậm Bào tử có đường kính

50-200 µm với cuống bào tử hình ellipse Rễ giả có đường kính 150 - 300 µm có thể trong suốt hoặc màu nâu đậm, xuất hiện ở chổ giao giữa sợi nấm và cuống nấm mang bào tử

 Một vài tính chất sinh lí:

 Nhiệt độ tối ưu: 35o

C

 pH tối ưu: 5.0

 Rhizopus oryzae thể lên men nhiều loại đường như glucose, fructose đường nghịch

đảo, saccharose, maltose … và các nguyên liệu khác như mật rỉ, tinh bột…

 Sinh trưởng và phát triển bằng hình thức kí sinh hoặc hoại sinh

 Sinh sản dưới 2 hình thức: vô tính (hình thành bào tử qua quá trình giảm phân), hữu tính (hình thành giao tử đực và giao tử cái)

1.2.3 Tiêu chuẩn chọn giống vi sinh vật:

PHẦN 2: QUI TRÌNH SẢN XUẤT 2.1 Sơ đồ qui trình sản xuất:

Hình 2.1: Sơ đồ qui trình công nghệ

Sản phẩm Bào tử

2.2 Thuyết minh qui trình:

2.2.1 Chuẩn bị môi trường:

 Mục đích: chuẩn bị

Tạo ra hỗn hợp đầy đủ và cân đối các chất dinh dưỡng cần thiết cho VSV trong quá trình lên men

 Các nguyên tố cơ bản: C, H, O, N

 Yếu tố sinh trưởng: biotin

 Các loại khoáng: đa lượng, vi lượng

 Các biến đổi:

 Hóa học: có sự phân li thành các ion của các muối

 Hoá lý: sự hòa tan các chất vào môi trường tạo nên hệ đồng nhất

 Hòa tan các muối khoáng riêng sau đó bổ sung vào môi trường

 Trộn lẫn tất cả các thành phần dinh dưỡng với nhau theo tỉ lệ đã định, cho vào bồn phối trộn và thêm đủ thể tích nước cất

2.2.2 Tiệt trùng:

 Mục đích: bảo quản, chuẩn bị

Tiêu diệt các VSV có trong môi trường sao cho ít làm biến đổi các thành phần của môi trường nhất

 Các biến đổi:

 Vật lý: tạo gradient nhiệt độ, có sự thay đổi về thể tích, khối lượng, tỉ trọng

 Hóa học: các thành phần trong môi trường có thể phản ứng với nhau

 Hóa lý: có sự bốc hơi nước

 Sinh học: các VSV bị tiêu diệt

 Hoá sinh: các enzym bị vô hoạt

 Thiết bị:

 Thiết bị tiệt trùng dạng bản mỏng:

Hình 2.3: Thiết bị tiệt trùng dạng bản mỏng

 Thiết bị gồm những tấm bản được đặt sát vào nhau Độ dày của các tấm bản rất mỏng

và trên bề mặt của chúng có các khe lồi lõm nhằm mục đích làm tăng bề mặt và hệ số truyển nhiệt Khi ghép các tấm bản lại với nhau trên bộ khung của thiết bị sẽ tạo nên hệ thống đường dẫn vào và ra cho thực phẩm và chất tải nhiệt Tuỳ theo năng suất của thiết bị và nhiệt độ thanh trùng, tiệt trùng cần đạt mà các nhà sản xuất sẽ chọn phương án bố trí sơ đồ dòng chảy thực phẩm và tác nhân nhiệt trong hệ thống thiết bị

 Các biến đổi:

 Sinh học:

 Tế bào nấm mốc phát triển tăng sinh khối, các sợi nấm mọc dài ra sau đó hình thành bào tử (con đường sinh sản vô tính)

 Sự hoạt hóa và sinh tổng hợp enzym của nấm mốc

 Hóa sinh: các phản ứng xảy ra với sự tham gia của enzym do nấm mốc tổng hợp

 Vật lý: nhiệt độ tăng do quá trình trao đổi chất của nấm mốc

 Hóa lý: có sự bốc hơi nước do nhiệt độ tăng

 Thiết bị:

Hình 2.4: Thiết bị nuôi cấy nấm mốc thu nhận bào tử

 Thể tích của bình nuôi cấy: 3m3 với thể tích hoạt động là 2m3

 Cấy bào tử giống vào môi trường nuôi cấy

 Môi trường nuôi cấy được sục khí liên tục để đảm bảo điều kiện nuôi cấy hiếu khí

 Thông số công nghệ:

 Nhiệt độ: 35oC

 pH 5.0

 Hóa lý: có sự tách dịch nuôi cấy thành hai phần: phần lỏng là huyền phù bào tử, phần rắn là các sợi nấm trên màng lọc

 Thiết bị:

 Thiết bị: thiết bị lọc ép sử dụng đĩa lọc

1-cửa quan sát, 2-thân thiết bị, 3-đĩa lọc, 4-ống trung tân để thu hồi dịch lọc,

5-động cơ, 6-bộ phận truyền động, 7-khớp trục

Hình 2.5: Thiết bị lọc ép sử dụng đĩa lọc

 Nguyên tắc hoạt động: đầu tiên bơm dịch sau khi nuôi cấy vào thiết bị Các sợi nấm

có kích thước lớn sẽ được giữ lại trên bề mặt vách ngăn của các đĩa lọc Pha lỏng có chứa bào

tử sẽ chui qua vách ngăn vào kênh dẫn ở bên trong đĩa lọc rồi chảy tập trung về ống thu hồi (4) để thoát ra ngoài Trong quá trình lọc, ống thu hồi (4) và các đĩa lọc có thể xoay được nhờ động cơ (5)

 Vật lý: nhiệt độ tăng do quá trình trao đổi chất của VSV

 Hóa học: hàm lượng cơ chất (glucose) và các thành phần dinh dưỡng giảm xuống, hàm lượng acid fumaric và các sản phẩm phụ như acid malic, ethanol, glycerol … tăng lên

 Hóa sinh: xảy ra các phản ứng do enzyme xúc tác

 Sinh học: sinh khối của nấm mốc tăng lên

 Thiết bị:

 Thiết bị lên men: rotating biological contactor

Hình 2.6: Rotating biological contactor

 Là thiết bị lên men dạng hình trụ có thể tích 20m3

với 9m3 hoạt động, đường kính 2,7m, dài 3,5m

 Trên trục có gắn các đĩa plastic, trục quay đươc nhờ một động cơ

 Các đĩa plastic chế tạo từ polysulfone có tác dụng như là chất mang cho nấm mốc, khi đĩa quay thì một phần đĩa nằm trong môi trường lên men, một phần nằm trong không gian phía trên chứa không khí

 Cơ chế sinh tổng hợp acid fumaric từ glucose:

 Glucose được chuyển hóa thành pyruvic acid theo chu trình đường phân tạo ra 2 phân tử acid pyruvic và 2 ATP

 Theo nghiên cứu của Overman và Romano 1969, tiếp theo là tổng hợp acid oxaloacetic theo cơ chế C3 cộng C1 bằng cách gắn CO2 vào acid pyruvic nhờ xúc tác của enzyme pyruvate carboxylase Sau đó là sự chuyển hóa acid oxaloacetic thành acid malic NAD-malate dehydrogenase và sự chuyển hóa acid malic thành acid fumaric nhờ enzyme fumarase

 Cũng theo nghiên cứu trong quá trình tổng hợp acid fumaric đã xảy ra đồng thời theo 2 con đường: citrate cycle và reductive carboxylation (Kenealy et al (1986))

 Cách thực hiện:

 Dùng 1m3 huyền phù bào tử có nồng độ 106 bào tử/ml cho vào thiết bị lên men chứa 8m3 môi trường lên men

 pH 5.0 được giữ trong suốt quá trình lên men bằng CaCO3

 Điều kiện nuôi cấy hiếu khí: không khí vô trùng được thổi vào khoảng không gian phía trên của thiết bị lên men với tốc độ 1lít/lít/phút

 Sau khoảng thời gian nuôi cấy nấm mốc sẽ phát triển thành một lớp màng trên bề mặt của các đĩa, khi đó môi trường sẽ đươc chuyển sang môi trường giới han N giới hạn, và không bổ sung CaCO3, dịch lên men sau đó được bơm vào vào thiết bị hấp phụ

 Thông số công nghệ:

 Nhiệt độ nuôi cấy 35o

C

 pH 5.0

 Tốc độ quay của đĩa là 20 vòng/phút

 Thời gian nuôi cấy 60h

 Hóa học: phản ứng giữa acid fumaric và NaOH tạo thành muối natri fumarat

 Hóa lý: sự giải hấp phụ của acid fumaric

 Cách thực hiện: các cột bão hòa sau khi tháo ra sẽ được đưa vào hệ thống rửa, dung dịch NaOH(0.4M) được bơm vào cột theo hướng thẳng đứng từ trên xuống theo chiều của cột, dung dịch chảy ra từ cột sẽ được thu hồi trong bình phản ứng có cánh khuấy

 Thông số công nghệ:

 Cách thực hiện: cho từ từ dung dich HCl vào bình phản ứng có cánh khuấy, bật cánh khuấy phân bố đều HCl vào dung dịch để phản ứng diễn ra tốt hơn, tiếp tục cho thêm HCl từ

từ đến khi lượng kết tủa không tăng thêm thì kết thúc quá trình

 Hóa học: độ ẩm nguyên liệu giảm

 Hóa lí: có sự bốc hơi nước

 Thiết bị:

 Thiết bị: sử dụng thiết bị sấy khay

1-bộ phận gia nhiệt, 2-quạt, 3-tấm chặn để hiệu chỉnh lưu lượng tác nhân sấy,

4-khay đựng nguyên liệu, 5-cửa vào của dòng tác nhân sấy,

6-cửa thoát của dòng tác nhân sấy

Hình 2.11: Thiết bị sấy khay

 Thông số công nghệ:

 Thời gian sấy: 1-2 phút

 CTPT: C4H4O4

 Acid fumaric được sử dụng trong thực phẩm để điều chỉnh độ chua Trong danh sách phụ gia acid fumaric được ký hiệu là E297

 Acid fumaric được tìm thấy trong địa y, nấm tai trịn và các loại rêu

 Acid fumaric được sử dụng trong thực phẩm từ năm 1946 Nĩ thường được sử dụng trong đồ uống và các loại bánh nướng Sử dụng trong thực phẩm acid fumaric cần cĩ độ tinh khiết cao

 Acid fumaric có rất nhiều tiềm năng để ứng dụng trong công nghiệp Nó được xem như nguyên liệu mở đầu cho các phản ứng polimer hóa và các phản ứng ester hóa Đặc biệt là trong sản xuất nhựa polyester

3.3 Ứng dụng của acid fumaric:

o Với cấu trúc như vậy, acid fumaric có rất nhiều tiềm năng để ứng dụng trong công nghiệp Nó được xem như nguyên liệu mở đầu cho các phản ứng polimer hóa và các phản ứng ester hóa Đặc biệt là trong sản xuất nhựa polyester

o Acid fumaric lại có những tính năng mà các acid hữu cơ khác không có để thưc hiện các phản ứng polymer hóa Ngoài ra, cấu trúc của polymer được cải thiện đáng kể khi acid fumaric được sử dụng đặc biệt là về độ cứng của polymer

o Ngoài ứng dụng trong công nghệ sản xuất polymer, acid fumaric còn có 2 tiềm năng khác được ứng dụng với 2 mức độ tinh khiết khác nhau của acid fumaric

o Đầu tiên nó được sử dụng như dược phẩm để chữa trị bệnh vẩy nến, một bệnh về

da Bệnh nhân mắc phải chứng bệnh này cơ thể của họ không tự sinh tổng hợp

được acid fumaric Do đó người bệnh phải uống acid fumaric ở dạng acid fumaric monoethyl hoặc este dimethyl để chữa bệnh

o Tiềm năng thứ hai của acid fumaric là bổ sung vào trong thức ăn gia súc để giảm lượng khí thải metan (McGinn et al 2004) Những nghiên cứu gần đây cho thấy có thể giảm được lượng rất lớn khí thải từ các trang trại nếu acid fumaric được bổ sung trong khẩu phần ăn hằng ngày của vật nuôi (lean tới 70%) Theo thống ke lượng khí thải metan do các trang trại tạo ra chiếm khoảng 14% lượng khí thải metan từ hoạt động của con người Như vậy, acid fumaric có tiềm năng rất lớn để cải thiện ôi nhiễm môi trường

PHẦN 4: THÀNH TỰU CƠNG NGHỆ

4.1 Sản xuất axit fumaric từ axit maleic bằng phản ứng đồng phân hĩa:

 Phản ứng đồng phân hĩa tạo axit fumaric từ axit maleic là phản ứng hai chiều Tăng tốc

độ phản ứng tạo axit fumaric và hạn chế phản ứng tạo trở lại axit maleic là cần thiết để tăng hiệu xuất thu hồi axit fumaric từ axit maleic

 Enzyme thực hiện chuyển hĩa phản ứng đồng phân này là maleat isomerase (maleat isomerase-cis-trans), thực hiện đồng phân hĩa axit maleic tạo axit fumaric Tuy nhiên, maleat isomerase là enzyme khơng ổn định ngay ở nhiệt độ vừa phải Do đĩ cần maleat isomerase chịu nhiệt cao để tăng hiệu xuất thu hồi axit fumaric từ axit maleic

 Enzyme maleat isomerase ổn định ở nhiêt độ cao cĩ nguồn gốc từ Bacillus stearothermophilus, Bacillus brevis, và Bacillus sp MI-105 cĩ thể cải thiện quá trình sản xuất acid fumaric

 Trong một nghiên cứu gần đây đã sử dụng Pseudomonas alcaligenes XD-1 Chúng tạo

maleat isomerase chịu nhiệt khá tốt (khoảng 700C trong 1 giờ) và enzyme fumarase gần như

bị vơ hoạt Enzyme fumarase xúc tác phản ứng chuyển hĩa axit fumaric thành axit L- malic bị

vơ hiệu hĩa càng làm tăng hiệu suất thu hồi axit fumaric

 Nhiệt độ khơng ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính của isomerase maleat từ Pseudomonas alcaligenes XD-1 Ngồi ra, khi cation canxi đã được thêm vào trong quá trình đồng phân hĩa

thì sự ổn định về nhiệt độ của isomerase maleat tăng lên đáng kể

 Với việc sử dụng Pseudomonas alcaligenes XD-1, hiệu suất đồng phân hĩa tạo axit

fumaric từ axit maleic được cải thiện đáng kể và hiệu suất này cĩ thể đạt đến 95 %