nuôi cấy mô hoa hồng nhung

Đồ án tốt nghiệp Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA và NAA đến sự sinh trưởng và phát triển của giống hoa hồng Nhung (Rosa hybrida L) bằng phương pháp nuôi cấy Hoa hồng Nhung (Rosa hybrida L.) được chiết xuất, bào chế làm mỹ phẩm cho các thương hiệu mỹ phẩm trên thị trường hiện nay như kem dưỡng da, kem giữ ẩm, nước hoa hồng, các loại kem dưỡng và trị mụn…. ngoài công dụng làm đẹp chúng còn có tác dụng làm giảm đau các vết thương, giúp nhuận tràng và lợi tiểu, điều hòa kinh nguyệt, giảm rạn da, mờ sẹo….

DANH SÁCH CÁC BẢNG i

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT iii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu đề tài 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về cây hoa hồng 3

1.1.1 Nguồn gốc 3

1.1.2 Vị trí phân loại của cây hoa hồng 3

1.1.3 Đặc tính thực vật học của cây hoa hồng 4

1.1.4 Giá trị sử dụng và giá trị kinh tế của cây hoa hồng 5

1.1.4.1 Giá trị sử dụng 5

1.1.4.2 Giá trị kinh tế 5

1.2 Tình hình nghiên cứu và sãn xuất hoa hồng trong nước và trên thế giới 6

1.2.1 Tình hình nghiên cứu và sãn xuất hoa hồng trên thế giới 6

1.2.2 Tình hình nghiên cứu và sãn xuất hoa hồng trong nước 7

1.3 Khái quát về nuôi cấy mô 8

1.3.1 Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật 8

1.3.2 Tính toàn năng của nuôi cấy mô tê bào 9

1.3.3 Tính ưu việt của phương pháp nhân giống in vitro 9

1.3.4 Các giai đoạn của quá trình nuôi cấy mô 9

1.3.5 Một số kết quả về nhân giống hoa hồng bằng phương pháp nuôi cấy mô trong nước và trên thế giới 11

1.3.5.1 Một số kết quả ở nước ngoài 11

1.3.5.2 Một số kết quả trong nước 12

CHƯƠNG 2 14

ĐỐI TƯỢNG, NÔI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Đối tượng nghiên cứu 14

2.2 thời gian, địa điểm nghiên cứu 14

2.3 Nội dung nghiên cứu 14

2.4 Phương pháp nghiên cứu 14

2.4.1 Điều kiện nuôi cấy 14

2.4.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 15

2.4.3 Các chỉ tiêu theo dõi 17

2.4.4 Xử lý số liệu 17

CHƯƠNG 3 18

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 18

3.1 Thí nghiệm 1 18

3.2 Thí nghiệm 2 21

3.2.1 Sự gia tăng số chồi 21

3.2.2 Sự gia tăng chiều cao chồi 22

3.2.3 Sự gia tăng số lá 24

3.3 Thí nghiệm 3 26

3.3.1 Số rễ và chiều dài rễ 26

3.3.2 Sự gia tăng chiều cao chồi 27

3.3.3 Sự gia tăng số lá 29

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

PHỤ LỤC 1 36

PHỤ LỤC 2 38 Y

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Diện tích, giá trị kinh tế hoa cắt và cây trang trí của một số nướctrồng chính trên thế giới năm 2003 6Bảng 3.1: Tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu chết và tỷ lệ mẫu nhiễm dưới ảnh hưởngcủa nước javen , HgCl2 và thời gian khử trùng sau 3 tuần nuôi cấy 18Bảng 3.2 Số chồi gia tăng dưới ảnh hưởng của các nồng độ BA qua các thờiđiểm sau cấy 21Bảng 3.3 sự gia tăng chiều cao chồi qua các thời điểm sau khi cấy 23Bảng 3.4 sự gia tăng số lá của chồi hoa hồng dưới ảnh hưởng của các nồng độ

BA qua các thời điểm sau khi cấy 24Bảng 3.5 số rễ và chiều dài rễ của chồi cây hoa hồng dưới ảnh hưởng củanồng độ NAA qua 4 tuần sau khi cấy 27Bảng 3.6 Chiều cao chồi gia tăng dưới ảnh hưởng của nồng độ NAA qua cácthời điểm sau khi cấy 28Bảng 3.7 sự gia tăng số lá dưới ảnh hưởng của nồng độ các nồng độ NAAqua các thời điểm sau khi cấy 29

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

Đồ thị 3.1 Thời gian và nồng độ chất khử trùng đến hiệu quả khử trùng của đếhoa hồng Nhung (21 NSKC) 19

Đồ thị 3.2 Động thái gia tăng số chồi hoa hồng dưới ảnh hưởng của nồng độ

BA qua các thời điểm sau cấy 22

Đồ thị 3.3 Động thái gia tăng chiều cao chồi cây hoa hồng dưới ảnh hưởngcủa các nồng độ BA qua các thời điểm sau cấy 23

Đồ thị 3.4 Động thái gia tăng số lá của chồi hoa hồng dưới ảnh hưởng củanồng độ BA qua các thời điểm 25

Đồ thị 3.5 Động thái gia tăng chiều cao chồi dưới ảnh hưởng của các nồng độNAA qua các thời điểm sau khi cấy 28

Đồ thị 3.6 Động thái gia tăng số lá của chồi hoa hồng dưới ảnh hưởng của cácnồng độ NAA qua các thời điểm sau khi cấy 30

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

ABA : Acid abscicic

ADN : Acid Deoxyribo Nucleid

ARN : Acid ribonucleid

BA : 6-benzyl adenine

cs : Cộng sự

ĐC : Đối chứng

CT : Công thức

GA3 : Gibberellic acid

IAA : Indolylacetic acid

IBA : Indolyl butyric

acid lux : Đơn vị đo cường độ ánh sáng

MS : Môi trường Murashige và Skoog

NAA : α-Naphthylacetic acid

ppm : Đơn vị minigam/lít

2,4-D : Diclorophenoxy acetic acid

NSKC : Ngày sau khi cấy

CV% : Hệ số biến động

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Hoa hồng là một trong những loài hoa được ưa chuộng trên thế giới, cómàu sắc đa dạng, hương thơm nhẹ; là biểu tượng cho hòa bình, của tình yêu,hạnh phúc, lòng chung thủy và tình hữu nghị… Ngoài ra, hoa hồng còn đượcdùng để chưng cất dầu thơm và là một loại dược liệu có giá trị (Nguyễn XuânLinh, 1998)[1] Hoa hồng có giá trị kinh tế cao và thị trường tiêu thụ rộng lớnnên nhiều nước trên thế giới đã đầu tư vào sản xuất hoa hồng trên qui mô lớn

Hoa hồng Nhung (Rosa hybrida L.) được chiết xuất, bào chế làm mỹ

phẩm cho các thương hiệu mỹ phẩm trên thị trường hiện nay như kem dưỡng

da, kem giữ ẩm, nước hoa hồng, các loại kem dưỡng và trị mụn… ngoài côngdụng làm đẹp chúng còn có tác dụng làm giảm đau các vết thương, giúpnhuận tràng và lợi tiểu, điều hòa kinh nguyệt, giảm rạn da, mờ sẹo…

Ở Việt Nam, hoa hồng được trồng chủ yếu ở Đà Lạt, Sa Đéc, ngoại thành

Hà Nội và một số vùng khác Những năm gần đây, do điều kiện kinh tế xã hộiphát triển, nhu cầu thưởng thức hoa ngày càng tăng cao và từ đó nghề trồnghoa có nhiều khởi sắc và có những bước tiến đáng kể Việc sản xuất hoa hồngdựa vào kinh nghiệm và các biện pháp chiết, ghép cành cho chất lượng giốngchưa cao, dễ bị thoái hóa, làm giảm chất lượng hoa

Nhân giống bằng nuôi cấy mô đã khắc phục được các nhược điểm trên,đồng thời có thể ứng dụng công nghệ mới để tạo ra cây giống với chất lượng

cao Trên thế giới, nhân giống in vitro cây hoa hồng đã được đưa vào thị

trường sản xuất do có thể nhân số lượng lớn cây giống trong thời gian tươngđối ngắn, đồng thời tạo được cây khoẻ mạnh và sạch bệnh cùng khả năng táisinh cây con trong vòng 1 năm (Dhawan và Bhojwani, 1986)[29] Chính vì

những lý do trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “ Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA và NAA đến sự sinh trưởng và phát triển

của giống hoa hồng Nhung (Rosa hybrida L) bằng phương pháp nuôi cấy

mô” nhằm tìm ra nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho sự

nhân chồi và ra rễ hoa hồng Nhung để đáp ứng nhu cầu giống hiện nay

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Kết quả nghiên cứu góp phần hoàn thiện quy trình nhân giống cây hoahồng Nhung bằng phương pháp nuôi cấy mô nhằm cung cấp nhanh giống đãđược tuyển chọn cho sản xuất

Kết quả nghiên cứu góp phần khẳng định vai trò của chất điều hòa sinhtrưởng BA và NAA trong nuôi cấy mô

Kết quả nghiên cứu làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo

về chọn tạo giống và ứng dụng kỹ thuật di truyền đối với cây hoa hồngNhung Là nguồn tài liệu tham khảo cho công tác giảng dạy, học tập vànghiên cứu khoa học, trong lĩnh vực công nghệ sinh học, công nghệ sản xuấtgiống và kỹ thuật trồng hoa chậu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về cây hoa hồng

2 Nguồn gốc

Cây hoa hồng Nhung có tên khoa học là Rosa hybrida l,thuộc: HọRosaceae Cây hoa hồng có nguồn gốc ôn đới và á nhiệt đới vùng bắc báncầu Theo Nguyễn Xuân Linh (1998)[1] hoa hồng xuất hiên trên trái đất cáchnay vài chục triệu năm, nhưng thật sự đã được nuôi trồng từ vài ngàn năm nay

và mới được lai tạo từ vài trăm năm nay Người ta cho rằng, chắc chắn hoahồng được trồng đầu tiên ở Trung Quốc và Ấn Độ Sau đó mới du nhập vào

Hà Lan, Pháp, Đức, Bungary, và chính người Châu Âu có công tạo ra cácgiống hoa hồng hiện đại ngày nay Các giống hoa hồng được nhâp vào ViệtNam theo hai nguồn đó là từ Châu Âu vào Đà Lạt rồi phổ biến ra các tỉnhmiền Nam và miền Bắc hoặc từ Thái Lan vào miền Nam rồi lan ra Bắc

3 Vị trí phân loại của cây hoa hồng

Cây hoa hồng Nhung được phân loại như sau:

Lớp: Dycotyledoneae ( Hai lá mầm)

Phân lớp : Rosidae (Phụ hoa hồng)

Bộ: Rosales (Hoa hồng)

Họ: Rosaceae (Hoa hồng)

Chi: Rosa L(Hoa hồng)

Theo Peter Beales (1990), [30] và Võ Văn Chi (2003) [2] chi Rosa có 4chi phụ là:

Hulthemia; Rosa (Eurosa); Platyrhodon và Hesperhodon

Nhiều nhà khoa học đã chia hoa hồng thành 10 nhóm lớn, với 115 loàiphân bố ở 8 vùng chủ yếu trên thế giới gồm Đông Á, Châu Á, Châu Âu, Bắc

Mỹ, Tây Á, Ethiopia, Nam âu [31], [32]

4 Đặc tính thực vật học của cây hoa hồng

Hoa hồng thuộc loại thân gỗ, dạng cây bụi hoặc cây leo, đa số cácloài hoa hồng đều có thân rỗng ở giữa khi thân đã hóa gỗ Cây hoahồng có khả

năng phân cành rất mạnh, trên thân có gai hoặc không có gai [33]

Rễ hồng thuộc loại rễ chùm, phân nhánh mạnh, phân bố nông trên lớpđất mặt từ 5 - 30cm Bộ rễ hoa hồng không chịu được ngập úng, ưa đất ẩmsong phải thông thoáng, thoát nước

Lá hoa hồng có dạng kép lông chim với 3, 5, 7, 9, 11, 13 lá chét và cóđính lá kèm ở gốc; lá chét có răng cưa ở mép lá và thường có những gai nhỏ ởtrên gân lá Chiều dài lá của hầu hết các loài hoa hồng là từ 5-15cm, tuỳ theogiống mà lá có màu sắc xanh đậm hay xanh nhạt, răng cưa nông hay sâu [2] Gai hoa hồng giống như hình dáng của cái móc câu, thường là một gai

hoặc bụi gai Một số loài như Rosa rugosa và Rosa pimpinellifolia có mật độ

gai dầy, nhọn sắc Gai giúp cho cây hoa hồng có khả năng chống chịu tốt vớicôn trùng đồng thời giúp cho câythích nghi với điều kiện hạn hán

Cây hoa hồng thường có hoa khá lớn, hoa lưỡng tính, phân hóa đài hoa

rõ rệt Nhị hoa xếp nhiều vòng, tâm bì nhiều, rời nhau và cùng đính trên 1 đếchung Hoa hồng có cấu tạo và màu sắc rất đa dạng, đa số các dạng hoang dại

và bán hoang dại có màu hoa trắng, 1 vòng cánh hoặc 2-3 vòng cánh (sốlượng cánh hoa ít, sắp xếp cũng đơn giản)

Quả hoa hồng là quả hạch, thường gọi là rose hip Quả hoa hồng là quả

hạch, thường gọi là rose hip Mỗi quả hoa hồng bao gồm một tầng cùi phíangoài, bên trong chứa từ 5 – 25 hạt bao bọc trong noãn mịn nhưng cứng và cólông nhỏ

Trên vỏ hạt thường có lông, vỏ hạt rất dày (vỏ sừng) chính vì vậy khảnăng nảy mầm của hạt rất kém Phôi và nội nhũ hạt có chứa nhiều axítasbcicic (ABA) đã kìm hãm quá trình nảy mầm

5 Giá trị sử dụng và giá trị kinh tế của cây hoa hồng

6 Giá trị sử dụng

Hoa hồng có rất nhiều màu sắc khác nhau, mỗi màu sắc biểu hiệncho những cảm xúc, mục đích khác nhau Có một số quan niệm củangười á Đông về sự lựa chọn khi tặng, hoặc chơi hoa hồng như sau:Hoa hồng màu đậm biểu hiện cho sự nồng thám, say đắm, tình yêunồng cháy.Hoa hồng màu đỏ tươi biểu hiện sự yêu đời, một tình yêuđậm đà Hoa hồng màu đỏ nhưng biểu hiện sự dịu dàng trìu mến Hoahồng màu phấn hồng tượng trưng cho sự may mắn, vinh dự, sự thànhcông Hoa hồng màu cam thể hiện sự vui tươi, kiêu hãnh và trang trọng.Hoa hồng màu trắng tượng trưng cho sự tinh khiết, cho mốì tình trongtrắng (thường dùng để kết hoa cưới) Hoa hồng màu vàng biểu hiện sựhuy hoàng, tươi sáng kính trọng Trong những dịp lễ hội, hội nghị, khaitrương… biểu tượng hoa hồng màu đỏ tươi, kèm theo cành lá để càitrước ngực là một hình thức lễ nghi rất được coi trọng

7 Giá trị kinh tế

Theo Nguyễn Xuân Linh (2000) [3], tổng giá trị hoa cắt tiêu thụtrên thị trường thế giới là 42 tỷ USD, trong đó hoa hồng chiếm 15 tỷUSD còn lại là cúc, cẩm chướng thơm, lay ơn và các loài hoa khác Dựkiến trong những năm tới nhu cầu hoa cắt sẽ tăng lên rất nhiều, riênghoa hồng sẽ chiếm tỷ trọng khoảng 30 tỷ USD [11], tỷ lệ nhập khẩu hoatrên thế giới tăng hàng năm là 10% trong đó hoa cắt tăng 6 -9% [4].Nghề trồng hoa hồng mang lại hiệu quả sản xuất lớn hơn so vớicác loại cây trồng khác đặc biệt là so với lúa Nếu so sánh với lúa hai

vụ thì hiệu quả trồng hồng gấp 6 lần, cẩm chướng gấp lúa 2 lần, loa kèngấp lúa 3 lần, layơn gấp lúa 4 lần, cúc gấp lúa 7 -8 lần [4]

7.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất hoa hồng trong nước và trên thế giới

Hoa hồng là một trong những loài hoa trồng phổ biến nhất trên thếgiới và được ưa chuộng bởi sự đa dạng về chủng loại và phong phú vềmàu sắc Chính vì thế, hoa hồng được nhiều nước trên thế giới trồngtheo hướng hàng hóa đầu tư thâm canh cao và trở thành một ngànhthương mại lớn Sản xuất hoa hồng mang lại những lợi ích to lớn chonền kinh tế của các nước trồng hoa trên thế giới

8 Tình hình nghiên cứu và sản xuất hoa hồng trên thế giới

Tình hình sản xuất kinh doanh hoa kiểng trên thế giới ngày càngphát triển một cách mạnh mẽ Kim ngạch mậu dịch về hoa kiểng tiếptục gia tăng.Theo thống kê của Trung tâm Thương mại Quốc tế thìnhững năm 50 của thế kỷ 20, kim ngạch mậu dịch hoa kiểng trên thếgiới chưa đến 3 tỷ USD nhưng đến năm 1985 đã lên đến 15 tỷ USD vàtiếp tục tăng nhanh đến năm 1990 là 30,5 tỷ USD Đến nay đã xấp xỉ

100 tỷ USD và tiếp tục tăng 10%/năm Dự kiến những năm đầu thế kỷ

21, kim ngạch mậu dịch hoa kiểng thế giới có thể đạt 200 tỷ USD/năm[5]

Bảng 1.1 Diện tích, giá trị kinh tế hoa cắt và cây trang trí của một số nước trồng chính trên thế giới năm 2003.

Tên nước Diện tích (1000 ha) Giá trị (triệu Euro)

(Nguồn: Hiệp hội hoa Hà Lan 2004 [34]).

Diện tích trồng hoa của Châu Á khoảng 134.000 ha, chiếm khoảng60% tổng diện tích hoa của thế giới trong đó các nước có diện tích lớn

nhất là: Trung Quốc 30.000 ha, Malaysia 1.028 ha, Srilanca 500 ha,Việt Nam 1.500 ha [7] Tỷ lệ thị trường hoa của các nước đang pháttriển chỉ chiếm 20% thị trường hoa của thế giới Hoa của Châu Áthường được trồng ở điều kiện tự nhiên, ngoài đồng ruộng và chủ yếuphục vụ thị trường nội địa [6].

Năm 1979 người ta đã tạo ra giống có khả năng chịu rét tới - 3 0

C Bằng việc lai giữa giống chống rét và giống không chống rét thì đờisau sẽ có giống chống rét trung bình [34] Nếu lấy giống chống rét làm

mẹ thì sự chống rét của đời sau sẽ cao hơn so với lấy giống chống rétlàm bố Tác giả Trương Vĩ-Trung Quốc (2000) [34], dùng phương pháp

đo sự phục hồi của bố mẹ và đời con sau khi xử lý lạnh kết quả là tínhchống rét của bố không dễ chuyển cho đời sau

Thế kỷ XXI là thời đại của mùi vị, người ta rất quan tâm đến việcnghiên cứu ảnh hưởng của mùi hương tới thần kinh đại não và cơ năngcủa cơ thể, vì vậy, việc nghiên cứu để tạo ra những giống hoa có hươngthơm sẽ được phát triển mạnh Những năm gần đây, các nhà tạo giống

ở Hà Lan, Mỹ đã tạo ra rất nhiều giống hoa hồng chống bệnh, chốngrét, đồng thời hoa to, màu đẹp, tươi lâu, có mùi thơm và hoa nở tậptrung Đây chính là những giống hồng đang được trồng hiện nay

9 Tình hình nghiên cứu và sản xuất hoa hồng trong nước

Hiện nay, tổng diện tích trồng hoa hồng ở nước ta ước tính khoảng3.000 - 4.000 ha, sản lượng đạt khoảng 3 tỷ cành hoa mỗi năm trong đó

Hà Nội 1.156 ha, Mê Linh 300 ha, Đà Lạt 230 - 300ha, Thành phố HồChí Minh 1.000 ha, còn lại các tỉnh khác Tổng giá trị sản lượng thuđược hàng năm từ 700 - 1.000 tỷ đồng Việt Nam [5] Trong số các loạihoa ở Việt Nam, hoa hồng chiếm tỷ lệ nhiều nhất (45% diện tích) Hoahồng được trồng chủ yếu ở vùng đồng bằng sông Hồng, diện tích vàsản lượng hoa hồng từ năm 1995 trở lại đây tăng lên một cách rõ rệt.Theo Nguyễn Xuân Linh và cộng tác viên [4] Kết quả điều tra năm

1997 trong 10 loại hoa ở Hà Nội thì đáng chú ý nhất là hoa hồng, diệntích trồng hoa tăng nhanh từ 80 ha (năm 1995) lên 196 ha (năm 1997)

và đã du nhập vào Hà Nội nhiều giống mới có chất lượng cao như hồng

Đà Lạt, hồng Pháp, hồng Hà Lan, hồng Mỹ

Từ các trung tâm sản xuất chính này hoa hồng được cung cấp chocác thị trường của tất cả các thành phố lớn trong nước Thành phố HồChí Minh mỗi ngày tiêu thụ 300.000 cành hồng trong khi 2 vùng hoachuyên canh là Sa Đéc và Gò Vấp mỗi ngày chỉ cung cấp được 100.000

- 150.000 cành vì thế vẫn phải nhập hoa từ Đà Lạt, Hà Lan, Đài Loan

và các tỉnh miền Bắc Hà Nội mỗi ngày tiêu thụ khoảng 150.000 200.000 cành Tổng sản lượng hoa hồng trong cả nước chiếm khoảnghơn 1 tỷ cành/năm [8] [11] [10]

-Những kết quả nghiên cứu về thu thập và bảo tồn nguồn gen ởMiền bắc Việt Nam tác giả Nguyễn Xuân Linh và cộng sự (1998) báocáo:Vùng Đông bắc: nguồn gen cây hoa hồng được tìm thấy ở rừngcấm quốc gia Cát bà Vùng Tây bắc: nguồn gen hoa hồng được tìm thấy

ở vùng Lai Châu, Sơn La, Hòa Bình Vùng đồng bằng bắc bộ: đã pháthiện thấy nguồn gen cây hoa hồng ở các tỉnh như Hải Phòng, tháiBình, NamHà, Ninh Bình, Vùng Bắc Trung Bộ: Vùng sinh thái nôngnghiệp Bắc Trung Bộ gồm các tỉnh Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh,Quảng Bình, ở khu vực sinh thái bắc trung bộ còn giữ được dải rừngphía tây vùng biên giới Việt – Lào nguồn hoang dại cây hoa hồng.[9] Viện di truyền nông nghiệp đã nhập nội và thu thập một tập đoàngiống hoa hồng mới và một số con lai F1 đưa vào khảo nghiệm đánhgiá và chọn lọc, bước đầu cho kết quả tốt [7]

Năm 2006 – 2008 Viện di truyền nông nghiệp đã nghiên cứu, chọntạo giống hoa mới (hoa hồng, loa kèn) bằng kỹ thuật chiếu xạ đột biến

in vitro.Kết quả xác định được liều chiếu xạ 0,5 krad chiếu ở giai đoạn

callus, hoa hồng cho tỷ lệ đột biến mầu sắc lớn nhất

9.1 Khái quát về nuôi cấy mô

10 Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật

Vi nhân giống là việc nhân đúng kiểu cây (true-to-type) của một kiểu gen

được tuyển chọn bằng cách sử dụng kỹ thuật in vitro Kỹ thuật này nhằm mục

đích nhân giống với hệ số nhân cao trong khoảng thời gian ngắn và tạo ra cácdòng cây con đồng nhất về mặt di truyền [12]

11 Tính toàn năng của nuôi cấy mô tê bào

Haberland lần đầu tiên đã quan niệm rằng: mỗi một tế bào bất kỳ củamột cơ thể sinh vật đa bào đều mang toàn bộ thông tin di truyền (ADN) củasinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triểnthành một cá thể hoàn chỉnh Tính toàn năng của tế bào là cơ sở khoa học củaphương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật (dẫn theo [13])

Như vậy, từ một tế bào (mô) bất kỳ trên cây có thể điều khiển để pháttriển thành một cơ thể hoàn chỉnh, khi được nuôi cấy trong một môi trườngthích hợp có đầy đủ các điều kiện cần thiết cho tế bào thực hiện các quá trìnhphân hóa, phản phân hoá

12. Tính ưu việt của phương pháp nhân giống in vitro

- Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng khắc phục được nhiều trở

ngại mà những phương pháp nhân giống khác thường gặp như: cây con đượctrẻ hóa và sạch bệnh; tạo cây con đồng nhất về mặt di truyền, bảo tồn đượccác tính trạng đã chọn lọc; có khả năng sản xuất quanh năm; có thể nhânnhanh nhiều cây không kết hạt trong những điều kiện sinh thái nhất định hoặchạt nảy mầm kém; hệ số nhân giống cao,

- Hạn chế của phương pháp nuôi cấy in vitro là đòi hỏi trang thiết bị đắt

tiền và kỹ thuật cao nên chỉ có hiệu quả đối với những cây có giá trị cao hoặckhó nhân giống bằng phương pháp khác (Nickell, 1973) Ngoài ra, phươngpháp này còn có những bất lợi: số lượng cây giống thu được có thể rất caonhưng cây con có kích thước nhỏ, cây có thể có những đặc tính không mongmuốn, khả năng tạo đột biến tăng, cây giống có thể bị nhiễm bệnh đồngloạt,

13 Các giai đoạn của quá trình nuôi cấy mô

Theo Ngô Xuân Bình và cs (2003)[14]: Trong nuôi cấy mô, tế bào gồm

5 giai đoạn sau:

- Giai đoạn 1 : Giai đoạn chuẩn bị

Đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quy trình nhân giống in

vitro.Mục đích của giai đoạn này là phải tạo được nguyên liệu thực vật vô

trùng để đưa vào nuôi cấy

Mẫu đưa từ bên ngoài vào phải đảm bảo các yêu cầu sau: tỷ lệ nhiễmthấp; tỷ lệ sống cao; tốc độ sinh trưởng nhanh Kết quả của giai đoạn này phụthuộc vào cách lấy mẫu, nồng độ và thời gian xử lý diệt khuẩn Vật liệuthường được chọn và đưa vào nuôi cấy là: Đỉnh sinh trưởng, chồi nách, hoa,đoạn thân, mảnh, lá, rễ

- Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy

Mục đích của giai đoạn này là tái sinh một cách định hướng sự phát triểncủa mô nuôi cấy Quá trình này được điều khiển chủ yếu bằng các chất điềuhòa sinh trưởng (tỷ lệ Auxin/Cytokinin) đưa vào môi trường nuôi cấy

Tuy nhiên bên cạnh đó cũng phải quan tâm đến tuổi của mẫu đem vàonuôi cấy Thường các mô non, chưa phân hóa có khả năng tái sinh cao hơnnhững mô đã chuyển hóa

- Giai đoạn 3: Giai đoạn nhân nhanh chồi

Mục đích của giai đoạn này là tạo hệ số cao nhất.Chính vì thế giai đoạnnày được coi là giai đoạn then chốt của quá trình nuôi cấy Để tăng hệ sốngười ta thường đưa vào môi trường nuôi cấy các chất điều hòa sinh trưởng(Auxin,Cytokinin,…), các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấmmen,…,kết hợp với các yếu tố ánh sang, nhiệt độ thích hợp Tùy thuộc vàođối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng cách kích thích sự hìnhthành các cụm chồi(nhân cụm chồi), hay kích thích sự phát triển của các chồinách hoặc thông qua việc tạo thành cây từ phôi vô tính

- Giai đoạn 4 : Tạo cây hoàn chỉnh

Khi đạt được kích thước nhất định các chồi được chuyển sang môitrường ra rễ Thường sau 2- 3 tuần, các chồi riêng lẻ này sẽ ra rễ và trở thànhcây hoàn chỉnh Ở giai đoạn này người ta bổ sung vào môi trường nuôi cấycác chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm Auxin, là nhóm hormone thực vậtquan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy Trong nhóm này các chấtIAA, IBA, NAA, 2.4- D được nghiên cứu và sử dụng nhiều chất để tạo rễ chochồi.

- Giai đoạn 5 : Giai đoạn đưa cây ra đất

Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình và nó quyết định khả năng ứng

dụng của quá trình nhân giống in vitro trong thực tiễn sản xuất Đây là giai

đoạn chuyển cây từ môi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng hoàntoàn Do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh thích hợp để cây có thểđạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như trong ruộng sản xuất

14 Một số kết quả về nhân giống hoa hồng bằng phương pháp nuôi cấy mô trong nước và trên thế giới

15 Một số kết quả ở nước ngoài

Theo Valles và Boxus, (1987) Gibberellin có thể một mình làmtăng số lượng cơ quan được tạo ra, sự tái sinh chồi từ mô sẹo Rosahybrida có thể được cảm ứng bởi BAP (1-5mg/l) nhưng khi có bổ sungthêm GA3 (0,3-1 mg/l) thì số lượng chồi hình thành sẽ tăng lên (tríchdẫn bởi Nguyễn Thị Kim Hằng, 2005) [15]

Theo kết quả nghiên cứu của Roy và cộng tác viên (2004)[36], khi sửdụng 1mg/l và 0.5 mg/l IAA để tạo rễ cho cây Rosa sp thì sau 4 tuần đã chokết quả cao (85% rễ của cây Rosa sp thành lập)

Kết quả nghiên cứu của Arif và cộng tác viên (1991), giai đoạn nhânchồi bổ sung thêm 3 mg/l BA và 0,05 mg/l NAA có tác dụng làm chồi cây hoahồng mini tăng cao nhất Al-Khalifah và cộng tác viên (2005), khi sử dụng 3,0mg/l BA kết hợp với 0,2 mg/l kinetin thì cây thì cây Rosa hybrid L có tỷ lệchồi tăng 71,1%

Theo Soomro và cộng tác viên (2003), để tạo rễ của cây Rosa indica đã

sử dụng 0,6 mg/l IBA và 0,1 mg/l NAA sau khoảng thời gian 12 tuần thì rễ sẽtăng 50%; để tạo chồi của cây Rosa indica đã sử dụng 2,0 mg/l IBA và 2,0mg/l IAA sau khoảng 12 tuần tỷ lệ chồi tăng 70%

Hamed và cộng tác viên (2006)[35], để tạo chồi của cây Rosa indica L

đã được sử dụng 1,5 mg/l BAP sau 7 ngày đã cho kết quả cao (100% chồihình thành) Còn khi sử dung,5 mg/l BAP và 0,5 mg/l kinetin thì sau 10 ngày

có 98% chồi hình thành

Theo kết quả nghiên cứu của Khosravi và cộng tác viên (2007)[37], trêncây Rosa hybrid sử dụng 4 µM BAP kết hợp với 0,5 µM NAA cho hệ số nhânchồi cao nhất

16 Một số kết quả trong nước

Nguyễn Thị Kim Thanh (2005)[16], đã công bố kết quả nhân giống cây

hoa hồng đỏ và cây hoa hồng trắng bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro, sử dụng

môi trường cơ bản MS+20 g/l sucrose+ 5,6 g/l agar, với các kết quả cho từngcông đoạn:

Tạo vật liệu khởi đầu: khử trùng mắt ngủ bằng HgCl2 0,5% trong 5phút, hoặc dùng Haiter 10% trong 10 phút cho tỷ lệ mẫu sạch trên 60% Mẫunày được cấy vào môi trường bổ sung BA hoặc Kinetin 1mg/l, mẫu sẽ bậtchồi 100% sau 14 ngày nuôi cấy

Nhân chồi (sau 4 tuần nuôi cấy): sử dụng 2 mg/l BA đối với giống hồng

đỏ cho hệ số nhân cao nhất là 3,47 và 1,5 mg/l đối với giống hồng trắng cho

hệ số nhân cao nhất là 5,94; sử dụng được cả môi trường đặc và lỏng chonhân chồi hoa hồng đỏ, riêng hoa hồng trắng thì chỉ nên sử dụng môi trườnglỏng; pH=6 là thích hợp cho cả hai loại hoa hồng

Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh: môi trường bổ sung 2 mg/l NAA hoặc 2 mg/lIBA cho hiệu quả tạo rễ trên 60%

Theo Nguyễn Kim Hằng (2005)[15], trên cây hoa hồng (Rosachinensis) sử dụng 1,5 mg/l BA cho hệ số nhân chồi cao nhất; sử dụng NAA

riêng lẽ (1mg/l) hoặc NAA (2mg/l) kết hợp với than hoạt tính (2g/l) để tạo câyhoàn chỉnh là tốt nhất.

Hồ Tân (2006)[17], giai đoạn khởi đầu: môi trường bổ sung 3 mg/l BAcho tỷ lệ tạo chồi từ mầm ngủ cao nhất; giai đoạn nhân chồi: môi trường bổsung 1 mg/l BA cho số chồi tăng cao nhất; giai đoạn tạo rễ: môi trường bổsung 2 mg/l NAA tạo rễ là tốt nhất Theo Lê Minh Lý (2007)[18], trong giaiđoạn nhân chồi của giống hoa hồng Rosa hybrid bổ sung thêm 1-2 mg/l BA làthích hợp để nhân chồi

Nguyễn Hữu Tính (2008)[19], đối với cây hoa hồng Nhung (Rosachinensis L): sử dụng 1,5 mg/l BA kết hợp với 0,15 mg/l NAA cho hệ số nhânchồi cao nhất; sử dụng 0,5 mg/l NAA kết hợp với 2 mg/l than hoạt tính để tạocây hoàn chỉnh là tốt nhất

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NÔI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17.1 Đối tượng nghiên cứu

Sử dụng giống hoa hồng Nhung (Rosa hybrida l.) có nguồn gốc tại làng

hoa Vạn Thạch Đà Lạt để nuôi cấy

Bộ phận đưa vào nuôi cấy: đoạn thân

Hình 2.1 Vật liệu nuôi cấy ban đầu 17.2 thời gian, địa điểm nghiên cứu

Thời gian: Từ tháng 1/2017 – tháng 5/2017

Địa điểm: Thí nghiệm được tiến hành tại phòng Nuôi cấy mô tế bàotrường Đại học Quy Nhơn

17.3 Nội dung nghiên cứu

Khảo sát nồng độ chất khử trùng và thời gian khử trùng đến tỷ lệ sốngsót của mẫu cấy

Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tạo chồi của cây

hoa hồng Nhung trong môi trường in vitro.

Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự sinh trưởng và khả

năng tạo rễ của cây hoa hồng Nhung trong điều kiện in vitro.

17.4 Phương pháp nghiên cứu

18 Điều kiện nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy: Sử dụng môi trường dinh dưỡng khoáng cơ bảnMurashige và Skoog (1962) [38], ký hiệu MS Tùy từng thí nghiệm cụ thể mà

bổ sung thêm các chất điều hòa sinh trưởng BA và NAA với các nồng độ khácnhau

Đề tài nghiên cứu được thực hiện bao gồm 3 thí nghiệm sau:

Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ chất khử trùng và thời gian khử

trùng đến tỷ lệ sống sót của mẫu cấy

Sử dụng chất khử trùng chủ yếu là nước javen thương phẩm 5% đượcpha loãng và HgCl2 0,1% trong khoảng thời gian khác nhau

Thí nghiệm được bố trí theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 9công thức mỗi công thức lặp lại 3 lần mỗi lần 10 mẫu

Công thức Tên chất khử

trùng Nồng độ (%)

Thời gian xử lý(phút)CT1

Phương pháp xử lý mẫu: chọn những đoạn thân của những cây khỏe,

đang trong thời kỳ sinh trưởng sinh dưỡng, rửa dưới vòi nước chảy trong

vòng 10 phút sau đó rửa bằng xà phòng rửa chén pha loãng trong vòng 10-15phút, đem mẫu rửa sạch bằng nước máy rồi tráng qua nước cất vô trùng 3-5lần Đem mẫu ngâm trong nước cất vô trùng sau đó tráng lại bằng nước cất vôtrùng trong tủ cấy vô trùng Ngâm mẫu trong dung dịch cồn 70O trong vòng 1phút, vừa ngâm vừa lắc đều, sau đó rửa sạch bằng nước cất vô trùng Sau đókhử trùng bằng nước javen và HgCl2 ở những nồng độ và thời gian khác nhau.

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng hình thành

chồi của chồi hoa hồng trong môi trường in vitro.

Mục đích: Xác định được nồng độ BA có ảnh hưởng tốt nhất đến hệ sốnhân chồi và sinh trưởng của chồi

Mẫu cấy là các chồi ngọn với thân có một mắt lá có kích thước từ 1,5cm được cấy vào trong môi trường có nồng độ BA khác nhau để tiến hànhtheo dõi

1-Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 5 công thức, mỗicông thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 bình, mỗi bình 4 mẫu cấy

Số liệu được ghi nhận 1 tuần một lần, theo dõi trong vòng 4 tuần

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự sinh

trưởng và khả năng ra rễ của chồi cây hoa hồng trong điều kiện in vitro.

Mục đích: Xác định được nồng độ NAA có ảnh hưởng tốt nhất đến sự ra

rễ và sinh trưởng của chồi cây hoa hồng Nhung trong điều kiện in vitro.

Mẫu cấy: Chọn những chồi cao từ 1-2 cm để tiến hành thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 5 công thức, mỗicông thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 bình, mỗi bình 4 mẫu cấy.

Số liệu được ghi nhân 2 tuần/lần và được theo dõi trong vòng 4 tuần

20 Các chỉ tiêu theo dõi

Các chỉ tiêu được ghi nhận qua các thời điềm 14,21,28,35 ngày sau khicấy

 Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) =

 Tỷ lệ mẫu sống (%) =

 Tỷ lệ mẫu chết (%) =

 Số chồi: Đếm số chồi gia tăng qua các thời điểm

 Số lá: Đếm số lá gia tăng qua các thời điểm

 Chiều cao chồi: Tính từ mặt agar đến lá cao nhất

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 21.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ chất khử trùng và thời gian khử trùng đến tỷ lệ sống sót của mẫu cấy

Việc đưa mẫu từ bên ngoài vào nuôi cấy có ý nghĩa quan trọng quyếtđịnh thành công của quá trình nuôi cấy mô Vì vậy, giai đoạn khử trùng có ýnghĩa quyết định và nâng cao hiệu quả kinh tế của kỹ thuật nuôi cấy

Nghiên cứu hiệu quả của phương pháp khử trùng mẫu bằng nước Javen

ở các nồng độ và thời gian khác nhau trên cơ quan nuôi cấy là đoạn thân đểxác định được thời gian và hoạt chất khử trùng tối ưu Sau 3 tuần theo dõi, kếtquả được trình bày ở Bảng 3.1

Bảng 3.1: Tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu chết và tỷ lệ mẫu nhiễm dưới ảnh hưởng của nước javen , HgCl2 và thời gian khử trùng sau 3 tuần nuôi cấy.

Công thức Nồng độ(%) Thời gian(phút)

Tỷ lệ (%)Mẫu

sống

Mẫuchết

Mẫunhiễm

(Trong cùng một cột các chữ theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê;

*: khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%).

Số liệu ở Bảng 3.1 và Đồ thị 3.1 cho thấy, khi khử trùng bằng các chấtkhử trùng khác nhau ở những khoãng thời gian khác nhau thì hiệu quả khửtrùng khác nhau và có sự khác biệt qua phân tích thống kê ở mức ý nghĩa5,00% Khi tiến hành tăng thời gian khử trùng đối với nước javen ở 2 nồng độ

và HgCl2 0,1% cho thấy tỷ lệ mẫu sống tăng dần (43,33% đối với nước javen2,00%, 58,33% đối với nước javen 2,5% và 65% đối với HgCl2 0,1%) Tỷ lệmẫu sống ở công thức 1 (8,33%) và công thức 4 (13,33%) là thấp nhất Khácbiệt có ý nghĩa thống kê so với các công thức còn lại Khi tiến hành tăng nồng

độ nước javen mà vẫn giữ nguyên thời gian khử trùng thì tỷ lệ mẫu sống tănglên

Đồ thị 3.1 Thời gian và nồng độ chất khử trùng đến hiệu quả khử

trùng của đế hoa hồng Nhung (21 NSKC)

Khi nồng đồ chất khử trùng và thời gian khử trùng tăng lên thì tỷ lệmẫu nhiễm giảm dần Tỷ lệ mẫu nhiễm cao nhất ở công thức 1 (91,67%) khácbiệt có ý nghĩa thống kê so với các công thức khác Do xử lý với chất khửtrùng trong thời gian ngắn và nồng độ thấp nên không đủ khả năng tiêu diệt visinh vật tạp nhiễm làm cho tỷ lệ nhiễm cao Khi tăng nồng độ cũng như thờigian khử trùng thì tỷ lệ mẫu nhiễm giảm dần Tỷ lệ mẫu nhiễm thấp nhất đốivới Nước javen 2,50% là 5%, đối với HgCl2 là 3,33%

Tỷ lệ mẫu chết tăng dần khi tăng nồng độ và thời gian khử trùng, tỷ lệchết thấp nhất ở công thức 1 (0%) khác biệt có ý nghĩa thống kê so với cáccông thức khác Tỷ lệ mẫu chết cao nhất ở công thức 9 (31,67%)

Nước javen và HgCl2 là chất khử trùng mạnh, tỷ lệ chết của mẫu thâncây hoa hồng khi đưa vào nuôi cấy đều tăng tỷ lệ thuận với mức tăng về nồng

độ và thời gian khử trùng Điều này có thể do đoạn thân của cây hoa hồng cònnon nên khi khử trùng ở nồng độ cao và thời gian lâu thì các tế bào mô bị tổnthương làm cho tỷ lệ chết cao Một số mẫu còn sống thì cũng yếu và khó táisinh được Ngược lại khi ngâm trong chất khử trùng nồng độ thấp và thời gianngắn thì không loại bỏ được các vi sinh vật bám trên bề mặt lá làm cho tỷ lệnhiễm cao

Hình 3.1 Mẫu hoa hồng Nhung khi khử trùng bằng nước HgCl2 trong 12

phút (21 NSKC)

Từ kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi nhận thấy rằng: Để tạo nguồn vậtliệu khởi đầu trong nhân giống cây hoa hồng Nhung, khử trùng mẫu bằngHgCl2 ở nồng độ 0,10% trong vòng 12 phút cho hiệu quả tốt nhất, tỷ lệ sốngđạt 65%

21.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng hình thành

chồi của cây hoa hồng trong môi trường in vitro

22 Sự gia tăng số chồi

Các chồi được tạo thành ở thí nghiệm 1 được tách ra và cấy chuyền sangcác môi trường nhân chồi để tạo ra số lượng chồi nhiều, chất lượng tốt, làm

tăng hiệu quả của quy trình nhân giống in vitro Nghiên cứu ảnh hưởng riêng