A. PHƯƠNG PHÁP KHỐI PHỔI. TỔNG QUAN VỀ KHỐI PHỔ: Khối phổ (mass spectrometry – MS): là một kỹ thuật quang phổ do nhà vật lí học người Anh Joseph John Thomson phát minh ra vào năm 1897. Chính nhờ kĩ thuật này đã giúp Thomson phát hiện ra các đồng vị của nguyên tố và chứng minh sự tồn tại hai đồng vị của khí Neon. Với phát minh này đã giúp Thomson giành được giải thưởng Nobel năm 1906.1. Khối phổ là gì?Là một kỹ thuật phân tích hóa học giúp xác định hàm lượng và loại chất hóa học có trong một mẫu bằng cách đo tỷ lệ khối lượng trên điện tích và số lượng của các ion pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Dùng thiết bị chuyên dụng là khối phổ kế. Kĩ thuật này có nhiều ứng dụng, thường được kết hợp với một số sinh học phân tử khác như:•Khối phổ kết hợp với sắc ký khí.•Khối phổ kết hợp với sắc ký lỏng.•Khối phổ kết hợp điện di2. Nguyên lý của phương pháp khối phổ:Là kỹ thuật phân tích đo phổ về khối lượng của các phân tử tích điện khi chúng di chuyển trong điện trường. Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phận phân tích khối phổ trước khi đến detector. Tất cả các quá trình này diễn ra trong hệ thiết bị chân không.Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp lại thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối. Dữ liệu phổ khối được tự động ghi lại và sử dụng để nhận dạng mẫu bằng các công cụ tin sinh học. Đồng thời, có thể xác định cấu trúc cũng như là định lượng các chất trong mẫu mà ta phân tích http:www.biomedia.vnreviewphuongphapkhoiphoms.html3. Sự hình thành khối phổ (sự ion hóa): Để có thể nghiên cứu các chất bằng pp khối phổ thì các phân tử chất nghiên cứu ở dạng khí hoặc hơi phải được ion hóa bằng phương pháp thích hợp. Phương pháp ion hoá bằng va chạm điện tử (dùng phổ biến nhất)•Trong buồng ion hoá, các điện tử phát ra từ cathode (làm bằng vonfram hoặc reni) bay về anode với vận tốc lớn. •Các phân tử chất nghiên cứu ở trạng thái hơi sẽ va chạm với điện tử trong buồng ion hoá, có thể nhận năng lượng điện tử và bị ion hoá. Phương pháp ion hóa bằng trường điện từ (dùng khá phổ biến)4. Máy khối phổ: là một thiết bị dùng cho phương pháp khối phổ, cho ra phổ khối lượng của một mẫu, để tìm ra thành phần của nó. Có thể ion hóa mẫu và tách các ion của nó với các khối lượng khác nhau và lưu lại thông tin dựa vào việc đo đạc cường độ dòng ion. Tùy theo loại điện tích của ion đem nghiên cứu mà người ta phân biệt máy khối phổ ion dương hoặc ion âm. Một khối phổ kế thông thường gồm 3 phần:•phần nguồn ion•phần phân tích khối lượng•phần đo đạc.
Trang 1TOPIC 9:
SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP
KHỐI PHỔ VÀ DẤU PHÓNG XẠ TRONG NGHIÊN CỨU SINH HỌC
THỰC NGHIỆM
TOPIC 9:
SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP
KHỐI PHỔ VÀ DẤU PHÓNG XẠ TRONG NGHIÊN CỨU SINH HỌC
THỰC NGHIỆM
Giảng viên hướng dẫn : PGS.TS Lê Thị Phương Hoa
TS Đào Văn Tấn Học viên : Nguyễn Thị Ngọc Liên
Mã học viên: K27 0257
Giảng viên hướng dẫn : PGS.TS Lê Thị Phương Hoa
TS Đào Văn Tấn Học viên : Nguyễn Thị Ngọc Liên
Mã học viên: K27 0257
Trang 3A Phương pháp khối phổ:
I Tổng quan về phương pháp khối phổ:
1 Khối phổ là gì?
2 Nguyên lý của phương pháp khối phổ
3 Sự hình thành khối phổ (sự ion hóa)
4 Máy khối phổ
II ứng dụng:
1 Ứng dụng của máy khối phổ trong phân tích protein
2 Sự kết hợp các phương pháp sinh học phân tử khác_ ứng dụng
2.1 Sắc kí khí kết hợp khối phổ2.2 Sắc kí lỏng kết hợp khối phổ2.3 Điện di kết hợp khối phổ
Trang 4• Khối phổ (mass spectrometry – MS): là một kỹ thuật
quang phổ do nhà vật lí học người Anh Joseph John
Thomson phát minh ra vào năm 1897
• Chính nhờ kĩ thuật này đã giúp Thomson phát hiện ra các đồng vị của nguyên tố và chứng minh sự tồn tại hai đồng
vị của khí Neon
• Với phát minh này đã giúp Thomson giành được giải
thưởng Nobel năm 1906
1 Khối phổ là gì?
Trang 5• Là một kỹ thuật phân tích hóa học giúp xác định hàm
lượng và loại chất hóa học có trong một mẫu bằng cách đo
tỷ lệ khối lượng trên điện tích và số lượng của các ion pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu
• Dùng thiết bị chuyên dụng là khối phổ kế
• Kĩ thuật này có nhiều ứng dụng, thường được kết hợp với một số sinh học phân tử khác như:
– Khối phổ kết hợp với sắc ký khí.
– Khối phổ kết hợp với sắc ký lỏng.
– Khối phổ kết hợp điện di
1 Khối phổ là gì?
Trang 6- Là kỹ thuật phân tích đo phổ về khối lượng của các phân tử tích
- Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phận phân tích khối phổ trước khi đến detector
- Tất cả các quá trình này diễn ra trong hệ thiết bị chân không.
- Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp lại thành một khối phổ đồ
hoặc phổ khối
- Dữ liệu phổ khối được tự động ghi lại và sử dụng để nhận dạng mẫu bằng các công cụ tin sinh học Đồng thời, có thể xác định cấu trúc cũng như là định lượng các chất trong mẫu mà ta phân tích
2 Nguyên lý của phương pháp khối phổ:
Trang 7http://www.biomedia.vn/review/phuong-phap-khoi-pho-ms.html
Trang 8- Để có thể nghiên cứu các chất bằng pp khối phổ thì các phân
tử chất nghiên cứu ở dạng khí hoặc hơi phải được ion hóa bằng phương pháp thích hợp
* Phương pháp ion hoá bằng va chạm điện tử
(dùng phổ biến nhất)
• Trong buồng ion hoá, các điện tử phát ra từ cathode (làm
bằng vonfram hoặc reni) bay về anode với vận tốc lớn
• Các phân tử chất nghiên cứu ở trạng thái hơi sẽ va chạm
với điện tử trong buồng ion hoá, có thể nhận năng lượng
điện tử và bị ion hoá
3 Sự hình thành khối phổ (sự ion hóa):
Trang 9•
3 Sự hình thành khối phổ (sự ion hóa):
Trang 10•là một thiết bị dùng cho phương
pháp khối phổ, cho ra phổ khối lượng
của một mẫu, để tìm ra thành phần
của nó
•Có thể ion hóa mẫu và tách các ion
của nó với các khối lượng khác nhau
và lưu lại thông tin dựa vào việc đo
đạc cường độ dòng ion
•Tùy theo loại điện tích của ion đem
nghiên cứu mà người ta phân biệt
máy khối phổ ion dương hoặc ion âm
4 Máy khối phổ:
http://www.biomedia.vn/revi ew/phuong-phap-khoi-pho- ms.html
Trang 11Một khối phổ kế thông thường gồm 3 phần:
Trang 12Cấu tạo:
• Bất kỳ máy khối phổ nào cũng có bốn khối chức năng sau đây:
+ Hệ thống nạp mẫu: Đưa mẫu vào máy, nếu mẫu ở dạng lỏng hoặc rắn cần phải chuyển sang dạng hơi bằng các biện pháp thích hợp.
+ Buồng ion hoá: Ion hóa các phân tử, nguyên tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc hơi.
+ Bộ phân tích: Tách các ion theo tỉ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) Các ion được gia tốc và tách riêng nhờ tác dụng của từ trường , điện trường để đi đến detector.
+ Bộ ghi tín hiệu: chuyển các ion đã đến thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ
- Tín hiệu điện từ detector được khuếch đại trước khi chuyển thành tín hiệu số phục vụ xử lí dữ liệu theo những yêu cầu khác nhau: ghi phổ khối, so sánh với dữ liệu phổ trong thư viện phổ hay định lượng mẫu.
3 Máy khối phổ:
Trang 13Hỏi: Theo bạn bộ phận nào là quan trọng nhất?
21
http://omnisci.com.vn/bvct/may-sac-ky-long-may-sac-ky-khoi-pho-thiet-bi-thinghiem-noi-that-thi-nghiem/11/ly-thuyet-khoi-pho.html
Trang 14Nguyên lý hoạt động của máy khối phổ:
• Mẫu chất cần phân tích sẽ được chuyển thành trạng thái
hơi, sau đó mới bắt đầu quá trình đo khối phổ
• Để đo được đặc tính của các phân tử cụ thể, máy khối phổ
sẽ chuyển chúng thành các ion, kiểm soát chuyển động của chúng bởi các điện từ trường bên ngoài
• quá trình được thực hiện trong môi trường chân không
4 Máy khối phổ:
Trang 15• Trong khi áp suất khí quyển vào khoảng 760 mmHg, áp
suất môi trường xử lý ion thường từ 10-5 đến 10-8 mmHg
(thấp hơn một phần tỉ của áp suất khí quyển)
• Ion sau khi được tạo thành sẽ được phân tách bằng cách gia tốc và tập trung chúng thành một dòng tia mà sau đó sẽ bị uốn cong bởi một từ trường ngoài
• Các ion sau đó sẽ được thu nhận bằng đầu dò điện tử và
thông tin tạo ra sẽ được phân tích và lưu trữ trong một máy
vi tính
4 Máy khối phổ:
Trang 16http://www.biomedia.vn/review/phuong-phap-khoi-pho-ms.html
Trang 17-Phương pháp khối phổ có thể dùng để nghiên cứu tất cả các nguyên tố hay hợp chất có thể biến thành dạng khí hay hơi.
+ Đối với hợp chất vô cơ: PPKP dùng để nghiên cứu thành phần đồng vị hoặc để xác định vết các chất nghiên cứu
+ Đối với hợp chất hữu cơ: PPKP thường dùng trong quá trình đồng nhất chất hoặc phân tích cấu trúc
Trang 18-Xác định các loại vitamin, hoocmon kích thích sinh
trưởng
-Phân tích dư lượng của các loại thuốc kháng sinh, thuốc trừ sâu
-Xác định được các hợp chất chưa biết dựa vào khối lượng
và thành phần của các nguyên tố trong hợp chất đó
-Xác định cấu trúc của các đồng vị trong hợp chất
Trang 19• Protein được tinh chế rồi cắt bằng enzyme pepsin Enzyme pepsin cắt polypeptide tại những điểm nhất định trên chuỗi
=> Ta có thể dự đoán được các mảnh (fragments)
polypeptide sau khi bị cắt
• Đưa mẫu đã xử lý pepsin vào đĩa và cho máy chạy Laser ion hoá các fragments làm cho chúng tích điện dương và bật ra bay vào ống Ống này có chiều dài nhất định, 4 phía gắn 2 loại điện cực (+) và (-)
1 Ứng dụng của máy khối phổ trong phân tích protein:
Trang 20• Có 2 loại hệ thống hay được sử dụng chính trong proteomics là MALDI-TOF và ESI-MS/MS Chúng bổ sung cho nhau để nhận dạng protein.
1 Ứng dụng của máy khối phổ trong phân tích protein:
http://www.biomedia.vn/review/phuong-phap-khoi-pho-ms.html
Trang 211 Ứng dụng của máy khối phổ trong phân tích protein:
http://www.biomedia.vn/review/phuong-phap-khoi-pho-ms.html
Trang 22• ống có thể xoay tròn, do đó các cực điện đổi chiều liên tục làm cho các mảnh polypeptide không bám được vào thành
mà bay theo chiều xoắn ốc
• Vận tốc bay của 1fragment phụ thuộc 2 yếu tố
1 Ứng dụng của máy khối phổ trong phân tích protein:
13
Trang 23• Với máy MS/MS (tandem MS) thì đây mới là lần MS thứ nhất, cho phép hiển thị các fragment của một polypeptide bị cắt bằng pepsin Lần MS thứ 2 cho phép khẳng định chắc chắn 1 fragment nhất định nhờ hệ thống lọc
1 Ứng dụng của máy khối phổ trong phân tích protein:
Figure : Schematic of a MALDI-TOF Mass Spectrometer
Trang 24Phân tích kết quả:
• Vì protein bao gồm 20 amino acid có khối lượng khác nhau do đó khối lượng của một trình tự đủ nhỏ cũng nói lên được trình tự của nó
VD: Giả sử + Valin có khối lượng là 3
+ Methionin có khối lượng là 5
Hỏi: Một fragment có khối lượng là 8, theo bạn sẽ có trình
tự như thế nào?
1 Ứng dụng của máy khối phổ trong phân tích protein:
Trang 252.1 Khối phổ kết hợp với sắc kí khí(Gas Chromatography Mass Spectometry)
• Phương pháp Sắc ký khí kết hợp với Khối phổ (viết tắt là GC-MS hoặc GCMS) là một phương pháp mạnh mẽ với độ nhạy cao được sử dụng trong các nghiên cứu về thành phần các chất trong không khí
• Bản chất GC-MS là sự kết hợp của Sắc ký khí (Gas
Chromatography) và Khối phổ (Mass Spectometry)
Ngưỡng phát hiện của phương pháp này là 1 picogram
2 Sự kết hợp các phương pháp sinh học phân tử khác_
ứng dụng
Trang 262.1 Khối phổ kết hợp với sắc kí khí(Gas Chromatography Mass Spectometry):
* Cấu tạo của GC-MS:
– Sắc ký khí (GC): phân tách hỗn hợp hóa chất thành một mạch theo từng
chất tinh khiết
– Khối phổ (MS): ) xác định định tính và định lượng
Nguồn http://www.biomedia.vn/review/lua-chon-thiet-bi-gcms-may-sac-ky-khi-ghep-noi-khoi-pho.html#
Trang 27Công dụng:
+ Phân tách: GC-MS có thể phân tách các hỗn hợp hóa chất phức tạp trong không khí hay trong nước
+ Định lượng: GC-MS có thể định lượng một chất bằng cách so sánh với mẫu chuẩn ( mẫu chuẩn là chất biết trước và đã được định lượng chuẩn bằng GC-MS).
+ Nhận dạng: Nếu trong mẫu có một chất lạ xuất hiện, khối phổ có thể nhận dạng cấu trúc hóa học độc nhất của nó Cấu trúc của chất này sau đó được so sánh với một thư viện cấu trúc của các chất đã biết
Trang 28Máy sắc kí khí kết hợp với khối phổ nhiều lần(GC/MSn)
Trang 292.2 Sắc lí lỏng kết hợp khối phổ(LS/MS/MS)
• Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ là phương pháp được hiểu là mẫu được phân tách và tinh sạch qua sắc ký, sau đó mẫu được đưa qua máy khối phổ để tiếp tục xác định khối lượng
nguyên tử của nó.
• Kết thúc quá trình ta thu được lượng mẫu nhất định và cấu trúc của nó
http://case.vn/vi-VN/87/88/129/details.case
Trang 302.3 Điện di kết hợp khối phổ
• Thường được dùng để xác định protein Phương pháp này cho phép ta quan sát và nhận dạng sự hiện diện tất cả các protein
• Khối phổ là phương pháp mang lại năng suất và độ chính xác cao trong quá trình nhận biết những protein đã phân tách bằng điện di 2 chiều
di trên gel polyacrylamide?
Trang 31• Độ nhạy cao.
• Giới hạn phát hiện nhỏ
• Độ đặc hiệu cao do tính phân mảnh riêng biệt của các ion
• Thời gian phân tích nhanh
• Độ phân giải cao
• Có thể định lượng đồng thời các chất có thời gian lưu giống nhau
Trang 32B Phương pháp dánh dấu phóng xạ:
I Tổng quan về phương pháp đánh dấu phóng xạ:
1 Khái niệm:
2 Nguyên lý của phương pháp đánh dấu phóng xạ
3 Yêu cầu của các đồng vị phóng xạ
II ứng dụng:
1 Trong nghiên cứu sinh học và trong công nông nghiệp
2 Trong y học
3 Trong khảo cổ
Trang 33hóa của hệ thống thông
qua hệ máy đo phóng xạ
mà không cần dừng hoạt
động của hệ thống
1 Khái niệm :
hinh-gen-va-phan-tu-kha-nang-dong-gop-lon- cua-y-hoc-hat-nhan-cho-y-hoc-phan-tu.html
Trang 34http://ungthubachmai.vn/y-hoc-hat-nhan/ghi-2 Nguyên lý:
Đánh dấu đồng vị phóng xạ O18 trong quang hợp ở cây xanh phát hiện oxi trong O2 giải phóng trong pha sáng có nguồn gốc từ H2O
https://hoc24.vn/ly-thuyet/bai-8-quang-hop-o-thuc-vat.611/
Trang 35- Tất cả các vật chất thông thường được cấu tạo bởi sự liên kết của các nguyên tố hóa học, mỗi nguyên tố có một số nguyên
tử đặc trưng cho số proton trong hạt nhân nguyên tử Thêm
vào đó, các nguyên tố có thể tồn tại ở một vài dạng đồng vị, mỗi đồng vị khác nhau về số lượng neutron trong hạt nhân
Ngoài các đồng vị thường các nguyên tố còn có các đồng vị phóng xạ
- Các đồng vị phóng xạ là đồng vị không ổn định Theo thời gian nguyên tử của các đồng vị phóng xạ này sẽ biến đổi
thành một đồng vị khác Sự biến đổi này có thể diễn ra với
nhiều các khác nhau như phân rã phóng xạ, hoặc là phát ra các hạt (thường là các điện tử (phân rã bêta), positron hoặc hạt
alpha) hoặc bằng sự phân hạch tự nhiên, và hấp thu điện tử
2 Nguyên lý:
Trang 36- Đồng vị là hiện tượng các nguyên tử có cùng số proton nhưng khác nhau về số nơtron, do đó số khối A của chúng khác nhau.
•Các đồng vị của nguyên tố Hidro
- Số khối: A = Z + N
- Số khối A và số proton (số đơn vị điện tích hạt nhân) Z là
2 đại lượng đặc trưng cho nguyên tử
2 Nguyên lý:
Trang 37- Đồng vị phóng xạ của một nguyên tố có cùng tính chất hóa học giống đồng vị bền.
- Do đó nếu trộn một lượng nhỏ đồng vị phóng xạ với đồng
vị bền của một nguyên tố rồi theo dõi sự thay đổi hoạt động của đồng vị phóng xạ trong quá trình vật lý, hóa học…mà nguyên tố đó tham gia, người ta có thể biết được một số tính chất của quá trình đó
2 Nguyên lý:
Trang 38-Chu kỳ bán rã phải phù hợp với thời gian tiến hành thực nghiệm, phải phù hợp với khoảng cách giữa nơi sản xuất đồng vị phóng xạ đến vị trí làm việc.
-Cường độ đủ lớn cho sự pha loãng và tách dòng mà vẫn còn đủ cho sự phát hiện bức xạ khi đo dòng xuống
-Chất mang đồng vị phóng xạ đánh dấu phải xâm nhập và đồng nhất với môi trường nghiên cứu, phải tồn tại bền vững với môi trường nghiên cứu trong suốt quá trình thực nghiệm
-Chất mang đồng vị phóng xạ phải giống với môi trường đánh dấu để không làm nhiễu loạn môi trường đánh dấu
3 Yêu cầu của các đồng vị phóng xạ:
Trang 39 Trong nghiên cứu di truyền học, giải mã gen, tìm hiểu sự vận chuyển các aa trong cơ thể sinh vật
Tạo giống ra các đột biến gen
Theo dõi sự di chuyển của nước mặt, nước ngầm, kiểm tra tốc độ thấm qua đê, đập, thăm dò dầu khí, nghiên cứu
cơ chế các phản ứng phức tạp và đo đạc các hằng số hoá lí…
II ứng dụng:
1 Trong nghiên cứu sinh học và công nông nghiệp:
Trang 40Đánh dấu đồng vị phóng xạ N15 trong phát hiện cấu tạo DNA theo nguyên tắc bán bảo tồn:
1 Trong nghiên cứu sinh học :
https://www.slideshare.net/nhido3192/bi-ging-sinh-hc-phn-t-ts-v-minh-tr
Trang 41Đánh dấu đồng vị phóng xạ P32 trong giải trình tự gen
bằng phương phương pháp phân giải hóa học (do Allan
Maxam và Walter Gilbert, năm 1977)
1 Trong nghiên cứu sinh học :
Đánh dấu
đồng vị
phóng xạ
Trang 42Đánh dấu đồng vị phóng xạ P32 trong giải trình tự gen
bằng phương phương pháp phân giải hóa học (do Allan
Maxam và Walter Gilbert, năm 1977)
Trang 43Đánh dấu đồng vị phóng xạ P32 trong giải trình tự gen bằng phương phương pháp enzym (do Frederick Sanger
đề xuất, năm 1977)
1 Trong nghiên cứu sinh học :
Trang 44Đánh dấu đồng vị phóng xạ P32 trong giải trình tự gen bằng phương phương pháp enzym (do Frederick Sanger đề xuất, năm 1977).
Trang 45Phóng xạ tự ghi
Hình ảnh điện di DNA
có đánh dấu 32 P trên polyacrylamide gel
ở phim X-quang.
Trang 46 Trong nghiên cứu, chẩn đoán và điều trị Các hợp chất đánh dấu hoá phóng xạ cung cấp các thông tin giải phẫu học về nội tạng con người, về hoạt động của các
cơ quan riêng biệt, phục vụ cho chẩn đoán bệnh
Tia phóng xạ được sử dụng trong các phương pháp chụp cắt lớp Từ lâu người ta đã sử dụng đồng vị 131I trong chẩn đoán và điều trị bệnh tuyến giáp
2 Trong y học:
Trang 47co-huong-dan-bang-chat-danh-dau-phong-xa-moi/
Trang 48https://phauthuatungthu.wordpress.com/2015/02/07/ky-thuat-phau-thuat-u-nao- Định tuổi cổ vật có nguồn gốc thực vật:
Trong không khí luôn tồn tại 1 lượng nhất định đồng vị
14C, đồng vị này phóng xạ với chu kỳ bán rã vào khoảng
5730 năm.Thực vật hấp thụ đi 14CO2 trong không khí nên cũng hấp thụ luôn 14C
+ Ở thực vật khi còn sống, tỉ lệ 14C và 12C là không thay đổi Sau khi chết sự trao đổi bị ngừng và hàm lượng 14C bắt đầu giảm dần do sự phân rã phóng xạ
Bằng cách đo tỉ lệ 14C và 12C trong các di vật cổ ta có thể tính ra tuổi của chúng Phép định tuổi cổ vật này cho phép đo được tuổi các cổ vật từ 500 năm đến 5500 năm
3 Trong khảo cổ:
Trang 49Tài liệu tham khảo
- wikipedia.org
- biomedia.vn
- baigiang.violet.vn