Nghiên cứu thủy phân bã mía bằng hỗn hợp enzyme làm nguyên liệu để sản xuất cồn sinh học

Đây là những cơ sở có ý nghĩa khoa học và ứng thực tế để chúng tôi đề xuất đề tài: Nghiên cứu thủy phân bã mía bằng hỗn hợp enzyme làm nguyên liệu để sản xuất cồn sinh học... Thành phần

BỘ GIÁO D VI

LUCHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGH

THủY PHÂN BÃ MÍA BằNG HỗN HợP ENZYME LÀM NGUYÊN LIệU Để SảN XUấT CồN SINH HọC

NGUYỄN HỒNG TRANG

HÀ NỘI, 2017

P ENZYME

BỘ VI

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan, đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi dưới sự

hướng dẫn của Tiến sĩ Đỗ Hữu Nghị Các số liệu, kết quả trong luận văn là

trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Học viên

Nguyễn Hồng Trang

cô chú, các anh các chị đang công tác tại phòng SHTN luôn nhiệt tình giúp đỡ, tạo cho tôi môi trường nghiên cứu và làm việc nghiêm túc

Tôi xin gửi lời biết ơn tới ban lãnh đạo trường Viện Đại học Mở Hà Nội đã luôn tạo điều kiện tốt cho tôi học tập và phát triển Đồng thời tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô bộ môn đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi học tập tại trường

Và cuối cùng, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè, người thân, những người đã luôn sát cánh cùng tôi, chia sẻ và động viên tôi không ngừng

nỗ lực vươn lên trong học tập cũng như trong cuộc sống

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Nguyễn Hồng Trang

MỤC LỤC

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3

1.1 Tình hình sản xuất và sử dụng bã mía trên thế giớivà ở Việt Nam 3

1.1.1 Tình hình sản xuất bã mía ở Việt Nam 3

1.1.2 Hiện trạng sử dụng bã mía ở Việt Nam 4

1.2 Thành phần cấu trúc của sinh khối thực vật và chuyển hóa sinh khối bởi enzyme thủy phân 5

1.2.1 Thành phần cấu trúc của sinh khối thực vật 5

1.2.2 Hỗn hợp enzyme thủy phân 15

1.3 Tình hình nghiên cứu và sản xuất Bioethanol trên thế giới và ở Việt Nam 17

1.3.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất bioethanol trên thế giới 17

1.3.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất bioethanol ở Việt Nam 19

CHƯƠNG II MỤC TIÊU, ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Mục tiêu nghiên cứu 21

2.2 Đối tượng nghiên cứu 21

2.3 Nội dung nghiên cứu 22

2.4 Vật liệu nghiên cứu 22

2.4.1 Thiết bị 22

2.4.2 Hóa chất 22

2.5 Các phương pháp nghiên cứu 23

2.5.1 Tối ưu tiền xử lý bã mía bởi hỗn hợp enzyme thủy phân bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm 23

2.5.2 Tiền xử lý bã mía bằng phương pháp hóa học, kết hợp sử dụng

hỗn hợp enzyme thủy phân để nâng cao hiệu suất chuyển hóa đường 24

2.5.3 Phương pháp định lượng đường khử bằng acid dinitrosalicylic (DNS) 25

2.5.4 Phương pháp kiểm tra thành phần các đường có trong mẫu (TLC, HPLC) 27

2.5.5 Xác định hàm lượng cồn bằng phương pháp chuẩn độ 28

2.5.6 Phương pháp nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men 30

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Khảo sát nguồn cơ chất giàu lignocellulose cho chuyển hóa thành các đường đơn bằng xúc tác sinh học 32

3.2 Tối ưu tiền xử lý bã mía bằng hỗn hợp enzyme thủy phân 33

3.3 Tiền xử lý bã mía bằng phương pháp hóa học, kết hợp sử dụng hỗn hợp enzyme thủy phân để nâng cao hiệu suất chuyển hóa đường 40

3.3.1 Tiền xử lý bằng NaOH kết hợp sử dụng hỗn hợp enzyme thủy phân 40

3.3.2 Tiền xử lý bằng H2SO4 kết hợp sử dụng hỗn hợp enzyme thủy phân 43

3.4 Đánh giá hiệu quả chuyển hóa sử dụng hệ HPLC 45

3.5 Lên men sinh tổng hợp bioethanol 46

3.4.1 Khảo sát môi trường lên men 46

3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên quá trình lên men 48

3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình lên men 51

3.4.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men 53

3.4.5 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ nấm men đến quá trình lên men 55

3.4.6 Quy trình sản xuất Bioethanol từ bã mía Error! Bookmark not defined.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Thành phần chính của một số nguyên liệu giàu lignocellulose 6 Bảng 2 Công thức môi trường A và môi trường B 30 Bảng 3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng đường khử trong phản ứng chuyển hóa bã mía bằng hỗn hợp enzyme thủy phân 33 Bảng 4 Kế hoạch trực giao bậc hai Box – Wilson 37 Bảng 5 Kết quả thí nghiệm theo kế hoạch trực giao bậc hai Box – Wilson

37

Bảng 6 Ma trận kế hoạch và kết quả thực nghiệm 38 Bảng 8 Hàm lượng đường khử sau khi tiền xử lý bằng NaOH và

enzyme cocktail 40 Bảng 9 Hàm lượng đường khử sau khi tiền xử lý bằng H2SO4 và enzyme cocktail 43 Bảng 10 Sản phẩm carbohydrate từ bã mía sau xúc tác chuyển hóa bằng

“enzyme cocktail” 46 Bảng 11 Hàm lượng đường khử còn lại và lượng ethanol tạo thành ở hai môi trường A và B 46 Bảng 12 Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng đường khử còn lại và nồng độ ethanol tạo thành 49 Bảng 13 Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng đường khử còn lại và lượng ethanol tạo thành 51 Bảng 14 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng đường khử còn lại và

lượng ethanol tạo thành 53 Bảng 15 Ảnh hưởng của nồng độ nấm men đến hàm lượng đường khử còn lại và lượng ethanol tạo thành 55

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Hiện trạng sản xuất mía đường các vùng của Việt Nam 4

Hình 2 Cấu trúc của lignocellulose 6

Hình 4 Mô hình Fringed fibrillar và mô hình chuỗi gập 8

Hình 5 Các đơn vị cơ bản của lignin 10

Hình 6 Cấu trúc lignin trong gỗ mềm với các nhóm chức chính 12

Hình 7 Hệ enzyme cellulase tham gia thủy phân mạch cellulose 15

Hình 8 Cấu trúc xylan được tấn công bởi những enzyme thủy phân khác nhau 16

Hình 9 Bã mía 21

Hình 10 Phương trình phản ứng tạo màu của đường khử với dung dịch DNS 26

Hình 11 Sắc ký bản mỏng (TLC) trên 5 cơ chất rơm rạ (M1), bã mía (M2), bã cà phê( M3), mùn gỗ (M4), rong túi (M5) Các chất chuẩn là các đường khử có khả năng lên men: glucose (Rf (Glu) = 0,34), galactose (Rf(Gla)= 0,28), xylose (Rf(Xyl) = 0,48) và mannose (Rf(Man) = 0,325) 32

Hình 12 So sánh hàm lượng đường khử sau khi thủy phân bởi NaOH (GD1) và sau khi xử lý phối hợp với hỗn hợp enzyme (GD2) 41

Hình 13 Bã mía sau khi tiền xử lý bằng NaOH 42

Hình 14 Các mẫu bã mía sau khi tiền xử lý được bổ sung hỗn hợp enzyme thủy phân 42

Hình 15 Đồ thị so sánh hàm lượng đường khử sinh ra tại các mẫu GD1 và GD2 43

Hình 16 Bã mía sau khi tiền xử lý bằng H 2 SO 4 44

Hình 17 Các mẫu bã mía sau khi tiền xử lý được bổ sung hỗn hợp enzyme 45 Hình 18 Đồ thị so sánh hàm lượng đường khử và ethanol tạo thành giữa hai công thức môi trường 47 Hình 19 Hai môi trường A và B trước khi lên men 48 Hình 20 Đồ thị biểu diễn hàm lượng đường khử còn lại và lượng ethanol tạo thành theo thời gian 49 Hình 21 Đồ thị biểu diễn hàm lượng đường khử còn lại và lượng ethanol tạo thành theo pH 52 Hình 22 Thí nghiệm sau lên men ở các điều kiện pH khác nhau 53 Hình 23 Đồ thị biểu diễn hàm lượng đường khử và ethanol tạo thành theo nhiệt độ 54 Hình 24 Thí nghiệm sau lên men ở các nhiệt độ khác nhau 55 Hình 25 Đồ thị biểu diễn hàm lượng đường khử và ethanol tạo thành theo nồng độ nấm men 56 Hình 26 Thí nghiệm sau lên men ở các nồng độ nấm men khác nhau 57

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT RR: Rơm rạ

Alternariatenuissima

CMCase/Xyl: Chế phẩm cellulose/xylanase từ nấm Trichoderma reesei

ĐC: Đối chứng

DNS: Acid Dinitrosalicylic

U Unit (đơn vị enzyme)

Vmax Maximum velocity of an enzymatic reaction (tốc độ tối đa của phản ứng enzyme)

MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

1 Khảo sát nguồn cơ chất giàu lignocellulose cho chuyển hóa thành các đường đơn bằng xúc tác sinh học

2 Tối ưu tiền xử lý bã mía bằng hỗn hợp enzyme thủy phân

3 Tiền xử lý bã mía bằng phương pháp hóa học, kết hợp sử dụng hỗn hợp enzyme thủy phân để nâng cao hiệu suất chuyển hóa đường

4 Lên men sinh tổng hợp bioethanol

1

MỞ ĐẦU

Sự phát triển và ứng dụng các sản phẩm sinh học cũng như công nghệ sinh học vào cuộc sống của con người đang là rất quan trọng và cần thiết, đặc biệt là trong tương lai, nhằm bảo vệ môi trường và bảo tồn các nguồn tài nguyên Ngành công nghệ sinh học trên thế giới cũng như ở Việt Nam, đang có

xu hướng sản xuất nhiên liệu sinh học (biofuel) từ các vật liệu có thành phần giàu lignocellulosic Mặc dù vật liệu giàu lignocellulosic rất phong phú và giá thành rẻ nhưng thách thức lại nằm ở việc chuyển đổi sinh khối này cần các hóa chất đắt tiền Chính vì vậy mà các chính sách và nghiên cứu mở rộng đang được thực hiên trên khắp thế giới nhằm giải quyết vấn đề này Trong đó, liên minh châu âu (EU) đã chấp thuận các luật về giảm thiểu các loại vật liệu có hại cho môi trường và bắt đầu nỗ lực tìm kiếm các loại vật liệu thân thiện với môi trường dựa trên tài nguyên thiên nhiên Hiện nay, Việt Nam cũng đã bắt đầu thực hiện Đề án “Phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015, tầm nhìn đến năm 2025” Theo đề án này, trong giai đoạn 2011 - 2015, Việt Nam sẽ xây dựng

và phát triển các cơ sở sản xuất và sử dụng nhiên liệu sinh học trên phạm vi cả nước Đến năm 2025, sản lượng ethanol và dầu thực vật đạt 250.000 tấn, đủ sức pha trộn 5 triệu tấn xăng, dầu E5, B5, đáp ứng 1% xăng dầu cả nước Việc sử dụng vật liệu giàu lignocellulosic để sản xuất nhiên liệu sinh học không những nâng cao giá trị của quá trình sản xuất nông nghiệp mà còn góp phần bảo vệ môi trường Theo nhận định của nhiều chuyên gia, ngoài rơm, rạ, gỗ được xem

là nguyên liệu phổ biến, thì bã mía là lựa chọn mới sản xuất nhiên liệu sinh học, phù hợp với nền nông nghiệp Việt Nam Hướng nghiên cứu này phù hợp với tình hình sản xuất nông nghiệp Việt Nam vì lượng bã mía hiện thải bỏ khá lớn Đơn cử tại Nhà máy Đường Bourbon (Tây Ninh), với công suất chế biến 8.000 tấn mía/ngày, nhà máy thải ra lượng bã mía khoảng 2.800 tấn/ngày Trong khi

đó, Công ty Đường Biên Hòa (Đồng Nai) có 3 nhà máy, trong đó 2 nhà máy sử dụng mía làm nguyên liệu với tổng công suất 5.000 tấn mía/ngày Mỗi năm, sản lượng mía cây là 600.000 - 750.000 tấn, tương đương 174.000 - 217.500 tấn bã

2

(bã mía chiếm khoảng 29% khối lượng mía cây) Nếu tính tổng thể hơn 40 nhà máy đường hiện có ở cả nước, việc sử dụng toàn bộ lượng bã mía thải bỏ sẽ góp phần giảm bớt áp lực cho các loại nguồn nguyên liệu sinh học từ bắp, khoai mì…

Vì vậy, những nguyên liệu phế phẩm, đặc biệt là bã mía sẽ góp phần vừa đảm bảo vừa xây dựng nền nông nghiệp bền vững, vừa giải quyết nhu cầu nhiêu liệu sinh học Đây là những cơ sở có ý nghĩa khoa học và ứng thực tế để chúng

tôi đề xuất đề tài: Nghiên cứu thủy phân bã mía bằng hỗn hợp enzyme làm nguyên liệu để sản xuất cồn sinh học

3

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tình hình sản xuất và sử dụng bã mía trên thế giớivà ở Việt Nam

Mía là cây trồng phổ biến tại rất nhiều nước trên thế giới, như: Brasil, Ấn

Độ, Trung Quốc, Pakistan, Mexico, Thái Lan, Colombia Ở ngành mía đường,

cứ 100 tấn mía cây đưa vào sản xuất chỉ thu được 10 - 12 tấn đường còn lại là

23 - 28 tấn bã mía; 3 - 4 tấn mật rỉ; 1,5 - 3,0 tấn bùn lọc [1] Như vậy chỉ riêng

cứ 1 triệu tấn đường sẽ để lại 2,3 triệu đến 2,8 triệu tấn bã mía

Để tận dụng các nguồn phế liệu này, ở nhiều nước trên thế giới, bã mía đã được nghiên cứu sử dụng theo nhiều cách khác nhau Bã mía được dùng làm nhiên liệu, giấy, bìa, ván ép, sản xuất fufural, α-cellulose, ethanol, cho lên men

để làm thức ăn cho gia súc, làm tấm phủ đất để chống xói mòn, làm giá thể trồng hoa hồng môn [2]

Thân cây mía chứa khoảng 80 - 90% nước dịch, trong nước dịch đó chứa khoảng 16 - 18% đường vào thời kì mía chín già Bã mía chiếm 25 - 30% trọng lượng mía đem ép

Thành phần trung bình của bã mía: Nước khoảng 40-50%, xơ khoảng 45- 48% (trong đó 45 - 55% là cellulose), chất hoà tan (đường): 2,5% Tùy theo loại mía và đặc điểm nơi trồng mía mà thành phần hoá học các chất có trong bã mía khô (xơ) có thể biến đổi Thành phần của bã mía sau khi rửa sạch và sấy khô gồm: Cellulose khoảng 45 - 55%, Hemicellulose khoảng 20 -25%, Lignin khoảng 18 - 24%, Tro: 1 - 4%, Sáp: <1% [3]

1.1.1 Tình hình sản xuất bã mía ở Việt Nam

Theo Hiệp hội Mía đường Việt Nam, hiện nay mỗi năm các nhà máy đường

ép trên 15 triệu tấn mía, phát sinh ra 4,5 triệu tấn bã mía Tại Nhà máy Đường Bourbon (Tây Ninh), với công suất chế biến 8.000 tấn mía/ngày, nhà máy thải

ra lượng bã mía khoảng 2.800 tấn/ngày Trong khi đó, Công ty Đường Biên Hòa (Đồng Nai) có 3 nhà máy, trong đó 2 nhà máy sử dụng mía làm nguyên liệu với

4

tổng công suất 5.000 tấn mía/ngày Mỗi năm, sản lượng mía cây là 600.000 - 750.000 tấn, tương đương 174.000 - 217.500 tấn bã (bã mía chiếm khoảng 29% khối lượng mía cây).Theo ông Phạm Hồng Dương, Giám đốc Nhà máy Đường Bourbon, một phần bã mía mang đốt tạo điện cho hoạt động của nhà máy, phần còn lại vẫn không sử dụng hết Nếu tính tổng thể hơn 40 nhà máy đường hiện có

ở cả nước, việc sử dụng toàn bộ lượng bã mía thải bỏ sẽ góp phần giảm bớt áp lực cho các loại nguồn nguyên liệu sinh học từ bắp, khoai mì…[4]

Hình 1 Hiện trạng sản xuất mía đường các vùng của Việt Nam[5]

1.1.2 Hiện trạng sử dụng bã mía ở Việt Nam

Từ năm 2006, Nhà máy Đường Ninh Hòa (Công ty TNHH MTV Đường Biên Hòa - Ninh Hòa) đã sản xuất điện sinh khối từ phụ phẩm nông nghiệp là bã mía Với năng lực chế biến đường 1.800 tấn mía/ngày, nhà máy đã đưa vào vận hành tổ hợp gồm 2 lò hơi (25 tấn hơi/lò) và turbine 3MW, chủ động nguồn điện phục vụ sản xuất của nhà máy Năm 2010, nhà máy nâng công suất chế biến đường lên 3.000 tấn mía/ngày, lò hơi và turbine công suất lên 60 tấn hơi và 6MW; lúc này nhà máy đã dư thừa công suất và bắt đầu phát điện lên lưới điện quốc gia Với năng lực này, công suất điện của nhà máy đã đạt 7 triệu

5

KWh/năm, bình quân 1 giờ sản xuất 2,5MW Năm 2013, năng lực chế biến đường nâng lên 5.200 tấn mía/ngày, lượng bã dư thừa rất lớn, Tập đoàn TTC - đơn vị chủ quản đã quyết định thành lập một đơn vị mới, chuyên kinh doanh điện sinh khối là Công ty TNHH MTV Nhiệt điện Ninh Hòa Năm 2014, công

ty đi vào hoạt động, vận hành hệ thống lò hơi 170 tấn hơi/giờ, lò cao áp suất 6,8Mpa, turbine máy phát công suất 30MW, hệ thống đường dây 110kV truyền tải điện dài 5,7km, tổng vốn đầu tư gần 350 tỷ đồng, chủ động phát điện và đấu nối vào lưới điện quốc gia Theo ông Hồ Nhẫn - Tổng Giám đốc Công ty TNHH MTV Nhiệt điện Ninh Hòa, nguyên lý sản xuất điện sinh khối rất đơn giản, phế phẩm là bã mía sau khi chế biến đường được đưa vào đốt sinh công chạy máy phát điện Với dây chuyền hiện tại, bình quân 1 tấn mía sản xuất được 55KWh (sau khi đã trừ sản lượng điện cho sản xuất), nếu công suất chế biến đường tăng thì công suất điện tăng Từ đầu vụ mía 2016 - 2017 đến nay, nhà máy đã chế biến được 625.000 tấn mía, công suất phát điện xấp xỉ 34,6 triệu KWh [6]

Tương tự, Nhà máy Đường Khánh Hòa (Công ty TNHH Đường Khánh Hòa) cũng sản xuất điện sinh khối từ bã mía từ nhiều năm nay, nhằm cung cấp điện và hơi nước cho sản xuất đường Lò hơi của nhà máy hiện nay có công suất

260 tấn hơi/giờ, cùng với 2 tổ máy turbine phát điện bằng hơi nước có tổng công suất 60MW Sau khi cân đối đủ cho dây chuyền sản xuất đường của nhà máy, phần công suất điện dư ra đã được phát lên lưới điện quốc gia, tối thiểu 8MW/giờ [6]

1.2 Thành phần cấu trúc của sinh khối thực vật và chuyển hóa sinh khối bởi enzyme thủy phân

1.2.1 Thành phần cấu trúc của sinh khối thực vật

Lignocellulose là một phức hợp polyme thành tế bào được quang tổng hợp ở thực vật, chiếm 60% tổng sinh khối thực vật trên trái đất, bao gồm các thành phần chủ yếu là các polyme carbohydrate (cellulose, hemicellulose), và

6

một polyme thơm (lignin), trong đó cellulose và hemicellulose chiếm tỉ lệ cao Cellulose chiếm phần lớn, khoảng từ 40% - 50%, còn hai hợp chất hemicellulose và lignin lần lượt chiếm khoảng 20 - 40% và 20 - 35% khối lượng

khô của cơ thể thực vật

Bảng 1 Thành phần chính của một số nguyên liệu giàu lignocellulose

Nguyên

liệu

Thành phần (% chất khô) Cellulose Hemicellulose Lignin

Hình 2 Cấu trúc của lignocellulose

Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thực vật thân gỗ và các thực vật khác như cỏ, lúa, ngô…Trong tự nhiên, chúng ta có thể tìm thấy lignocellulose ở thực vật hay các chất thải nông nghiệp, lâm nghiệp và các chất thải rắn trong thành phố Thành phần chủ yếu của lignocellulose là cellulose, hemicellulose và lignin Cellulose và hemicellulose là các đại phân tử cấu tạo từ các gốc đường khác nhau, trong khi lignin là một polymer dạng vòng được tổng

7

hợp từ tiền phenylpropanoid Thành phần cấu tạo và phần trăm của các polymer này là khác nhau giữa các loài Hơn nữa, thành phần cấu tạo trong cùng một cây hay các cây khác nhau là khác nhau dựa vào độ tuổi, giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cây và các điều kiện khác.Lượng lớn lignocellulose được thải ra từ các ngành lâm nghiệp, nông nghiệp, công nghiệp giấy và gây ra ô nhiễm môi trường Tuy nhiên, lượng lớn các sinh khối thực vật dư thừa được coi là rác thải

có thể được biến đổi thành nhiều sản phẩm có giá trị khác nhau như nhiên liệu sinh học, hóa chất, các nguồn năng lượng rẻ cho quá trình lên men, bổ sung chất dinh dưỡng cho con người và thức ăn cho động vật

- Cellulose

Cellulose là hợp chất hữu cơ có công thức cấu tạo (C6H10O5)n, và là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật, gồm nhiều cellobiose liên kết với nhau, 4-O- (β-D-Glucopyranosyl)-D-glucopyranose (Hình 3) Cellulose cũng là hợp chất hữu cơ nhiều nhất trong sinh quyển, hàng năm thực vật tổng hợp được khoảng 1011 tấn cellulose (trong gỗ, cellulose chiếm khoảng 50% và trong bông chiếm khoảng 90%)

Hình 3 Công thức hóa học của cellulose

Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và liên kết van Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là tinh thể và vô định hình Trong vùng tinh thể, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị tấn công bởi enzyme cũng như hóa chất Ngược lại, trong vùng vô định hình, cellulose liên kết không chặt với nhau nên dễ bị tấn công Có hai mô hình

8

cấu trúc của cellulose đã được đưa ra nhằm mô tả vùng tinh thể và vô định hình như hình 4 dưới đây

Hình 4 Mô hình Fringed fibrillar và mô hình chuỗi gập

Trong mô hình Fringed Fibrillar: phân tử cellulose được kéo thẳng và định hướng theo chiều sợi Vùng tinh thể có chiều dài 500 Å và xếp xen kẽ với vùng vô định hình

Trong mô hình chuỗi gập: phân tử cellulose gấp khúc theo chiều sợi Mỗi đơn vị lặp lại có độ trùng hợp khoảng 1000, giới hạn bởi hai điểm a và b như trên hình vẽ Các đơn vị đó được sắp xếp thành chuỗi nhờ vào các mạch glucose nhỏ, các vị trí này rất dễ bị thủy phân Đối với các đơn vị lặp lại, hai đầu là vùng vô định hình, càng vào giữa, tính chất kết tinh càng cao Trong vùng vô định hình, các liên kết β - glycoside giữa các monomer bị thay đổi góc liên kết, ngay tại cuối các đoạn gấp, 3 phân tử monomer sắp xếp tạo sự thay đổi 180o cho toàn mạch Vùng vô định hình dễ bị tấn công bởi các tác nhân thủy phân hơn vùng tinh thể vì sự thay đổi góc liên kết của các liên kết cộng hóa trị (β - glycoside) sẽ làm giảm độ bền của liên kết, đồng thời vị trí này không tạo được liên kết hydro

Cellulose có cấu tạo tương tự carbohydrate phức tạp như tinh bột và glycogen Các polysaccharide này đều được cấu tạo từ các đơn phân là glucose

9

Cellulose là glucan không phân nhánh, trong đó các gốc glucose kết hợp với nhau qua liên kết β-1 4- glycoside, đó chính là sự khác biệt giữa cellulose và các phân tử carbohydrate phức tạp khác Giống như tinh bột, cellulose được cấu tạo thành chuỗi dài gồm ít nhất 500 phân tử glucose Các chuỗi cellulose này xếp đối song song tạo thành các vi sợi cellulose có đường kính khoảng 3,5 nm Mỗi chuỗi có nhiều nhóm OH tự do, vì vậy giữa các sợi ở cạnh nhau kết hợp với nhau nhờ các liên kết hidro được tạo thành giữa các nhóm OH của chúng Các vi sợi lại liên kết với nhau tạo thành vi sợi lớn hay còn gọi là bó mixen có đường kính 20 nm, giữa các sợi trong mixen có những khoảng trống lớn Khi tế bào còn non, những khoảng này chứa đầy nước, ở tế bào già thì chứa đầy lignin

và hemicellulose

Cellulose có cấu trúc rất bền và khó bị thủy phân Người và động vật không có enzyme phân giải cellulose (cellulase) nên không tiêu hóa được cellulose, vì vậy cellulose không có giá trị dinh dưỡng Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy cellulose có thể có vai trò điều hòa hoạt động của hệ thống tiêu hóa Vi khuẩn trong dạ cỏ của gia súc, các động vật nhai lại và động vật nguyên sinh trong ruột của mối sản xuất enzyme phân giải cellulose Nấm đất cũng có thể phân hủy cellulose Vì vậy chúng có thể sử dụng cellulose làm thức

ăn

- Lignin

Lignin là một phức hợp chất hóa học phổ biến được tìm thấy trong hệ mạch thực vật, chủ yếu là giữa các tế bào, trong thành tế bào thực vật Lignin là một trong các polymer hữu cơ phổ biến nhất trên trái đất Lignin có cấu trúc không gian 3 chiều, phức tạp, vô định hình, chiếm 17% đến 33% thành phần của gỗ Lignin không phải là carbohydrate nhưng có liên kết chặt chẽ với nhóm này để tạo nên màng tế bào giúp thực vật cứng chắc và giòn, có chức năng vận chuyển nước trong cơ thể thực vật (một phần là để làm bền thành tế bào và giữ cho cây không bị đổ, một phần là điều chỉnh dòng chảy của nước), giúp cây

10

phát triển và chống lại sự tấn công của côn trùng và mầm bệnh Thực vật càng già, lượng lignin tích tụ càng lớn Hơn nữa, lignin đóng vai trò quan trọng trong chu trình carbon, tích lũy carbon khí quyển trong mô của thực vật thân gỗ lâu năm, là một trong các thành phần bị phân hủy lâu nhất của thực vật sau khi chết,

để rồi đóng góp một phần lớn chất mùn giúp tăng khả năng quang hợp của thực vật

Lignin là một polyphenol có cấu trúc mở Trong tự nhiên, lignin chủ yếu đóng vai trò chất liên kết trong thành tế bào thực vật, liên kết chặt chẽ với mạng cellulose và hemicellulose Rất khó để có thể tách lignin ra hoàn toàn

Lignin là polymer, được cấu thành từ các đơn vị phenylpropene, vài đơn

vị cấu trúc điển hình là: guaiacyl (G), trans-coniferyl alcohol; syringyl (S), trans-sinapyl alcohol; p-hydroxylphenyl (H), trans-p-courmary alcohol (Hình 5)

Hình 5 Các đơn vị cơ bản của lignin

Cấu trúc của lignin đa dạng, tùy thuộc vào loại gỗ, tuổi của cây hoặc cấu trúc của nó trong gỗ Ngoài việc được phân loại theo lignin của gỗ cứng, gỗ mềm và cỏ, lignin có thể được phân thành hai loại chính: guaicyl lignin và guaicyl-syringyl lignin

Gỗ mềm chứa chủ yếu là guaiacyl, gỗ cứng chứa chủ yếu syringyl Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng guaiacyl lignin hạn chế sự trương nở của xơ sợi và vì vậy loại nguyên liệu đó sẽ khó bị tấn công bởi enzyme hơn syringyl lignin

11

Những nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng lignin hoàn toàn không đồng nhất trong cấu trúc Lignin dường như bao gồm vùng vô định hình và các vùng có cấu trúc hình thuôn hoặc hình cầu Lignin trong tế bào thực vật bậc cao không

có vùng vô định hình Các vòng phenyl trong lignin của gỗ mềm được sắp xếp trật tự trên mặt phẳng thành tế bào Ngoài ra, cả cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của lignin đều bị ảnh hưởng bởi mạng polysaccharide Việc mô hình hóa động học phân tử cho thấy rằng nhóm hydroxyl và nhóm methoxyl trong các oligomer tiền lignin sẽ tương tác với vi sợi cellulose cho dù bản chất của lignin là kỵ nước

12

Hình 6 Cấu trúc lignin trong gỗ mềm với các nhóm chức chính

Các nhóm chức ảnh hưởng đến hoạt tính của lignin bao gồm nhóm

phenolic hydroxyl tự do, methoxyl, benzylic hydroxyl, ether của benzylic với

các rượu mạch thẳng và nhóm carbonyl (Hình 6) Guaicyl lignin chứa nhiều

nhóm phenolic hydroxyl hơn syringyl

Lignin tạo liên kết hóa học với hemicellulose và ngay cả với cellulose

(nhưng không nhiều) Độ bền hóa học của những liên kết này phụ thuộc vào bản

chất liên kết, cấu trúc hóa học của lignin và các gốc đường tham gia liên

kết.Carbon alpha (Cα) trong cấu trúc phenyl propane là nơi có khả năng tạo liên

13

kết cao nhất với khối hemicellulose Ngược lại, các đường nằm ở mạch nhánh như arabinose, galactose, và acid 4-O-methylglucuronic là các nhóm thường liên kết với lignin Các liên kết có thể là ether, ester (liên kết với xylan qua acid 4-O-methyl-D-glucuronic), hay glycoside (phản ứng giữa nhóm khử của hemicellulose và nhóm OH phenolic của lignin)

Cấu trúc hóa học của lignin rất dễ bị thay đổi trong điều kiện nhiệt độ cao

và pH thấp như điều kiện trong quá trình tiền xử lý bằng hơi nước Ở nhiệt độ phản ứng cao hơn 200oC, lignin bị kết khối thành những phần riêng biệt và tách

ra khỏi cellulose Những nghiên cứu trước đây cho thấy đối với gỗ cứng, nhóm ether β-O-4 aryl bị phá hủy trong quá trình nổ hơi Đồng thời, đối với gỗ mềm, quá trình nổ hơi làm bất hoạt các nhóm hoạt động của lignin ở vị trí α như nhóm hydroxyl hay ether, các nhóm này bị oxy hóa thành carbonyl hoặc tạo cation benzylic, cation này sẽ tiếp tục tạo liên kết C-C

Trong dinh dưỡng động vật, lignin rất đáng quan tâm vì nó không bị tiêu hóa bởi enzyme của cơ thể vật chủ Lignin còn liên kết với nhiều polysaccharide

và protein màng tế bào ngăn trở quá trình tiêu hóa các hợp chất gỗ Gỗ, cỏ khô

và rơm rất giàu lignin nên tỷ lệ tiêu hóa thấp trừ khi được xử lý hóa học làm cho các liên kết giữa lignin với các carbohydrate khác bị bẻ gãy

- Hemicellulose

Hemicellulose là một loại polymer phức tạp và phân nhánh, độ trùng hợp khoảng 70 đến 200 đơn phân Hemicellulose chứa cả đường 6 carbon gồm glucose, mannose và galactose và đường 5 gồm xylose và arabinose Thành phần cơ bản của hemicellulose là β– D xylopyranose, liên kết với nhau bằng liên kết β-(1 4)

Cấu tạo của hemicellulose khá phức tạp và đa dạng tùy vào nguyên liệu, tuy nhiên có một vài điểm chung gồm:

- Mạch chính của hemicellulose được cấu tạo từ liên kết β-(1 4)

14

- Xylose là thành phần quan trọng nhất

- Nhóm thế phổ biến nhất là nhóm acetyl O – liên kết với vị trí 2 hoặc 3

- Mạch nhánh cấu tạo từ các nhóm đơn giản, thông thường là disaccharide hoặc trisaccharide Sự liên kết của hemicellulose với các polysaccharide khác và với lignin là nhờ các mạch nhánh này Cũng vì hemicellulose có mạch nhánh nên tồn tại ở dạng vô định hình và vì thế

dễ bị thủy phân

Hemicellulose là polysaccharide trong màng tế bào tan trong dung dịch kiềm và có liên kết chặt chẽ với cellulose, là một trong ba sinh khối tự nhiên chính Cùng với cellulose và lignin, hemicellulose tạo nên thành tế bào vững chắc ở thực vật Về cấu trúc, hemicellulose có thành phần chính là D-glucose, D-galactose, D-mannose, D-xylose và L-arabinose liên kết với các thành phần khác và nằm trong liên kết glycoside Hemicellulose còn chứa cả axit 4-O-methylglucuronic, axit D-galacturonic và axit glucuronic Trong đó, đường D-xylose, L-arabinose, D-glucose và D-galactose là phổ biến ở thực vật thân cỏ và ngũ cốc Tuy nhiên, khác với hemicellulose thân gỗ, hemicellulose ở thực vật thân cỏ lại có lượng lớn các dạng liên kết và phân nhánh phụ thuộc vào các loài

và từng loại mô trong cùng một loài cũng như phụ thuộc vào độ tuổi của mô đó Tùy theo trong thành phần của hemicellulose có chứa monosaccharide nào mà nó sẽ có những tên tương ứng như manan, galactan, glucan và xylan Các polysaccharide như manan, galactan, glucan hay xylan đều là các chất phổ biến trong thực vật, chủ yếu ở các thành phần của màng tế bào của các cơ quan khác nhau như gỗ, rơm rạ, v.v…

Trong các loại hemicellulose, xylan là một polymer chính của thành tế bào thực vật trong đó các gốc D-xylopyranose kết hợp với nhau qua liên kết β-1,4-D-xylopyranose, là nguồn năng lượng dồi dào thứ hai trên trái đất Đa số phân tử xylan chứa nhiều nhóm ở trục chính và chuỗi bên Các gốc thay thế chủ yếu trên khung chính của xylan là các gốc acetyl, arabinosyl và glucuronosyl

15

Các nhóm này có đặc tính liên kết tương tác cộng hóa trị và không hóa trị với lignin, cellulose và các polymer khác

1.2.2 Hỗn hợp enzyme thủy phân

1.2.2.1 Hệ enzyme thủy phân cellulose

Hệ enzyme cellulase bao gồm endo-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4) có nhiệm vụ làm trương hoặc hydrat hóa các liên kết trong mạch cellulose, exo-1,4-glucanase (EC 3.2.1.91), β-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.21) thủy phân các liên kết mạch phía ngoài giải phóng các đơn vị glucose Từ những nghiên cứu riêng rẽ

về ba loại enzyme cellulase kể trên, nhiều tác giả đều đưa ra kết luận chung là các loại enzyme cellulase sẽ thay phiên nhau phân huỷ cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là đường glucose [7]

Hình 7 Hệ enzyme cellulase tham gia thủy phân mạch cellulose

1.2.2.2 Hệ enzyme thủy phân hemicellulose

Hệ thống enzyme thủy phân hemicellulose là đặc biệt quan trọng, xylan chiếm khoảng 30% vật liệu của thành tế bào của thực vật sống lâu năm, từ 15-30% đối với gỗ cứng và 7-10% đối với gỗ mềm để chuyển hóa chúng cần một số enzyme như: endo-1,4-β-xylanase (EC 3.2.1.8) thủy phân ngẫu nhiên khung xylan tạo ra các oligosaccharide sau đó exo-β-1,4-D-xylosidase (EC 3.2.1.37) xúc tác thủy phân β-1,4-D-xylo-oligosaccharide bằng cách cắt phân tử đường xylose từ đầu không khử thành các monomer Các nhóm bên có mặt trong xylan

16

được giải phóng bởi exo-β-mannosidase (EC 3.2.1.25), α-L arabinofuranosidase

(EC 3.2.1.55), α-D-glucuronidase (EC 3.2.1.1), galactosidase (EC 3.2.1.139) và acetyl(xylan) esterase [8] Enzyme α-arabinofuranosidase thủy phân nhóm cuối cùng không khử α-L-arabinofuranosyl của arabinan, arabinoxylan và arabinogalactan Enzyme α-D-glucuronidase thủy phân liên kết α-1,2-glycosidic

giữa xylose và D-glucuronic axit hoặc liên kết ete với 4-O-methyl Sự thủy phân

liên kết α-1,2 bền vững đóng vai trò quan trọng trong thủy phân xylan

Ngoài ra để thủy phân hemicellulose cần một enzyme rất quan trọng trong hệ enzyme mannan là endo-β-1,4- mannanase (EC 3.2.1.78 ) là enzyme thủy phân liên kết 1,4-β-manopyranozit trong mạch chính của mannan và heteropolysaccharide có chứa đường mannanose Sự thủy phân mannan từ polysaccharide bằng enzyme β-mannanase tạo ra các mano-oligosaccharide và một chuỗi các oligosaccharide chứa D-manose, D-glucose và D-galactose β- mannanase phân cắt liên kết β-1,4-mannosit trong mạch mannan do vậy nó xúc tác thủy phân mannan, glucomannan, galactomannan và galatoglucomannan tạo thành mannobiose, mannotriose và hỗn hợp các oligosaccarit khác [9] Chính vì vậy nó là mắt xích quan trọng trong việc phân tách lignin ra khỏi lignocelluloses

Hình 8 Cấu trúc xylan được tấn công bởi những enzyme thủy phân khác nhau

17

1.2.2.3 Hệ enzyme thủy phân carbohydrate esterase (CE)

Các enzyme thủy phân carbohydrate esterase (CE) bao gồm: acetyl esterase (EC 3.1.1.6), feruloyl esterase (EC 3.1.1.73) hoạt động trên các chuỗi nhánh của cấu trúc polysaccharide thành tế bào để phân cắt liên kết cầu nối giữa các chuỗi xylan và giữa xylan với lignin để tách riêng phần lignin ra khỏi cấu trúc lignocelluloses Chúng đóng một vai trò quan trọng ở giai đoạn đầu quá trình thủy phân lignocelluloses [10].Các enzyme thủy phân CE gần đây nhận được nhiều sự quan tâm bởi vai trò của chúng trong các ứng dụng trong công nghiệp giấy và bột giấy [11].Các enzyme CE liên quan đếnchuyển hóa xylan là công cụ quan trọng trong nghiên cứu cơ chế và cấu trúc thành tế bào thực vật Các liên kết giữa lignin và polymer cacbohydrate tự nhiên trong cấu trúc phức hợp thành tế bào vẫn đang được xác định và cần những nghiên cứu sâu hơn Các xylan acetyl-hóa là những dạng polymer khó chuyển hóa trong dạ dày và kìm hãm hoạt động của các cellulose và hemicellulose tùy thuộc vào mức độ acetyl hóa Khi sử dụng phối hợp xúc tác của xylan và các enzyme thủy phân xylan khác trong sản xuất bột giấy và tẩy trắng giấy, các esterase (feruloyl esterase, acetyl esterase) có thể phá vỡ 1 phần cấu trúc và loại bỏ một phần thành tế bào thực vật [12] Do đó, phức hợp lignin - cacbohydrate có thể trở nên dễ bị tấn công bởi hoạt độ xúc tác của enzyme và sự hòa tan sản phẩm chuyển hóa tốt hơn Việc tăng hiệu quả chiết xuất lignin dẫn đến giảm được sử dụng chlorin ở các bước tẩy trắng tiếp theo và tăng độ trắng sáng của bột giấy và giấy [13]

1.3 Tình hình nghiên cứu và sản xuất Bioethanol trên thế giới và ở Việt Nam

1.3.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất bioethanol trên thế giới

Ethanol sinh học (bio-ethanol) là một loại nhiên liệu sinh học dạng cồn, được sản xuất bằng con đường sinh học, chủ yếu bằng phương pháp lên men và chưng cất các loại ngũ cốc chứa tinh bột có thể chuyển hóa thành đường đơn, thường được sản xuất từ các loại cây nông nghiệp hàm lượng đường cao như

rạ bởi chủng nấm Aspergillus niger đã được nghiên cứu bởi Aderemi và cộng sự

(2008) cho thấy năng suất glucose tăng từ 43% đến 87% sau nghiền vật liệu rơm với kích thước giảm từ 425 đến 75 µm, trong khi nhiệt độ và pH tối trong phạm vi lần lượt là 45-500C và pH: 4,5-5 Nghiên cứu này cho thấy nồng độ và tốc độ sản sinh glucose phụ thuộc vào tiền xử lý rơm, trong khi đó việc tiền sử

lý rơm đa phần phụ thuộc vào phương pháp hóa học dẫn đến những hệ lụy về vấn đề môi trường Hiệu suất thuỷ phân lignocellulose tăng khi có sự kết hợp của các enzyme như cellulase, xylanases và pectinase nhiều hơn là chỉ dùng cellulase [14] [15] nhưng chi phí của quá trình tăng mạnh

Punnapayak và Emert (1986) [16] nghiên cứu quá trình đường hóa đồng

thời với quá trình lên men của kiềm trước khi được xử lý rơm với nấm Candida

brassicae và Pachysolen tannophilus dẫn đến kết quả sản lượng ethanol cao hơn Candida brassicae trong tất cả các thử nghiệm Tuy nhiên, chỉ có ít hơn 30

% sản lượng ethanol lý thuyết

Thủy phân riêng biệt enzyme và lên men gạo bằng chủng nấm Mucor

indicus, Rhizopus oryzae , và Saccharomyces cerevisiae đã được nghiên cứu bởi

Abedinifar và cộng sự (2009) [17] Nghiên cứu trên kết luận rằng chủng nấm

Mucor indicus có thể để sản xuất ethanol từ pentoses và việc sử dụng loài nấm này trong sản xuất bioethanol từ lignocelluloses, đặc biệt là đối với rơm rất hiệu quả

19

1.3.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất bioethanol ở Việt Nam

Ở Việt Nam, công nghiệp sản xuất ethanol đã được hình thành từ rất lâu.Phần lớn ethanol được sản xuất từ rỉ đường mía, dùng làm ethanol cho thực phẩm và công nghiệp Tổng cộng năng suất là 25 triệu lít/năm, trong đó có 3 nhà máy sản xuất 15000 – 30000 lít/ngày là nhà máy đường Lam Sơn, nhà máy đường Hiệp Hoà và nhà máy rượu Bình Tây và hàng trăm cơ sở sản xuất 3000 –

5000 lít/ngày Cho đến thời điểm này, ethanol nhiên liệu vẫn chưa được tiêu thụ phổ biến trên thị trường.Tuy nhiên, có rất nhiều nghiên cứu được thực hiện trong lĩnh vực này [18]

Để giải quyết vấn đề ethanol nhiên liệu, ethanol sinh học (bio-ethanol) là một loại nhiên liệu sinh học dạng cồn, được sản xuất bằng con đường sinh học

đã ra đời với với việc sản xuất bioethanol từ nguồn tinh bột (bắp) và đường (mía), bioethanol có thể được sản xuất từ lignocellulose Lignocellulose là loại biomass phổ biến nhất trên thế giới Vì vậy sản xuất bioethanol từ biomass cụ thể là từ nguồn lignocellulose là một giải pháp thích hợp đặc biệt là với các quốc gia với nền nông nghiệp là chủ đạo như Việt Nam

Việt Nam hàng năm tạo ra một lượng lớn các phụ phẩm công-nông nghiệp chủ yếu là lignocellulose từ các vụ mùa Tận dụng nguồn nguyên liệu này, cụ thể là rơm rạ, bã mía… để sản xuất bioethanol sinh học là phương pháp sử dụng các nguyên liệu trên một cách hiệu quả đồng thời góp phần giải quyết vấn đề năng lượng cho nước ta

Đến nay, hầu hết nghiên cứu của các nhà khoa học Việt Nam trên đối tượng lignocellulose cũng như các phụ phẩm công-nông nghiệp là sử dụng phương pháp hóa-lý, các vi sinh vật phân giải cellulose hay enzyme của chúng để chuyển hóa những vật liệu thô này thành nhiên liệu sinh học (bioethanol), phân hữu cơ hoặc là thành phần cho thức ăn chăn nuôi Có nhiều nghiên cứu của các nhà khoa học trong nước đối với các enzyme thủy phân (cellulase, xylanase) và enzyme oxidoreductase (laccase, peroxidase) [19][20][21], những nghiên cứu

20

này hiện chỉ sử dụng enzyme thương mại hoặc enzyme thô từ dịch nuôi cấy nấm dùng để sản xuất bioethanol tuy nhiên những nghiên cứu này chưa đi sâu nghiên cứu hệ enzyme thủy phân tinh sạch từ nấm Hiện nay chưa có công bố nào về các enzyme CE liên quan đến quá trình quá trình chuyển hóa lignocellulose và đặc biệt là hệ enzyme thủy phân tham gia vào quá trình chuyển hóa vật liệu trên thành các loại đường lên men (hexose & pentose) để phục vụ cho những mục đích khác nhau đặc biệt là lên men thu nhiên nhiên liệu sinh học (bioethanol) Vai trò của acetyl esterase, feruloyl esterase từ một số loài nấm trong quá trình phân hủy lignocellulose từ phụ phẩm công-nông nghiệp đã được đánh giá bởi

(Nghị et al., 2012) [22]

Trong nghiên cứu của Phan Đình Tuấn (2008) [21] với đề tài: “Nghiên cứu sản xuất ethanol nhiên liệu từ rơm rạ” mới chỉ tập trung về công nghệ lên men chưa đề cập nhiều đến hệ enzyme thủy phân và quá trình tiền xử lý nguyên liệu đầu vào nên hiệu suất quá trình thủy phân cũng như thủy phân và lên men đồng thời chỉ đạt đến ngưỡng 80% Nghiên cứu chưa nêu được quy trình lên men triệt

để đường hexose và pentose dẫn đến giảm hiệu suất của quá trình lên men

21

CHƯƠNG II MỤC TIÊU, ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, VẬT LIỆU

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu thử nghiệm và tối ưu thành phần và các điều thích hợp cho tiền

xử lý sinh khối bã mía sử dụng hỗn hợp enzyme thủy phân (“enzyme cocktail”) thành các đường khử cho quá trình lên men sinh tổng hợp ethanol sinh học

2.2 Đối tượng nghiên cứu

- Bã mía, rơm rạ , bã cà phê, mùn gỗ, rong túi được lấy từ Đông Anh, Hà Nội và được xử lý bằng cách nghiền nhỏ bằng hệ thống nghiền bi (thiết bị

Fritsch, Oberstein, CHLB Đức)

Hình 9 Bã mía

- Hệ enzyme thủy phân: enzyme feruloyl esterase được tinh sạch từ chủng

Alternaria tenuissima (ký hiệu AltFAE) và acetyl (xylan) esterase từ chủng nấm Xylaria polymorpha (XpoAE) tại phòng sinh học thực nghiệm, Viện

Hóa học các hợp chất thiên nhiên cellulose Chế phẩm cellulose/xylanase từ

nấm Trichoderma reesei (Cell/Xyl)được mua từ nguồn thương mại (AB

Enzyme, Darmstadt, CHLB Đức)

22

- Các chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae được cung cấp bởi phòng

Vi sinh môi trường - Viện công nghệ môi trường và phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên

2.3 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu đề ra, các nội dung nghiên cứu chính dự kiến bao gồm:

- Nghiên cứu tiền xử lý bã mía bằng phương pháp hóa-lý và kết hợp thủy phân bằng hỗn hợp enzyme (“enzyme cocktail” hoạt tính cellulose, xylanase và esterase)

- Tối ưu tiền xử lý bã mía

- Khảo sát các điều kiện lên men ethanol để tìm ra điều kiện tối ưu

2.4 Vật liệu nghiên cứu

23

nghiệm – Viện các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn Lâm khoa học và công nghệ Việt Nam

2.5 Các phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Tối ưu tiền xử lý bã mía bởi hỗn hợp enzyme thủy phân bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm

Quy hoạch thực nghiệm được thực hiện theo mô tả của Nguyễn Minh Tuyền (2007) [23], là thủ tục chọn số lượng thí nghiệm, các điều kiện tiến hành thí nghiệm cần và đủ để giải quyết nhiệm vụ đặt ra với độ chính xác cần thiết, chọn các phương pháp toán học xử lý kết quả thực nghiệm và thừa nhận kết quả

đó Theo định nghĩa trên, nhờ có vị trí tối ưu của các điểm trong không gian yếu

tố và phép biến đổi tuyến tính của tọa độ mà ta có thể khắc phục được những nhược điểm của phương pháp phân tích hồi quy cổ điển (thực nghiệm thụ động, thay đổi lần lượt từng biến số) Kết quả là số lượng thí nghiệm giảm đi đáng kể, thông tin nhận được chính xác hơn, và do đó hiệu quả quá trình thực nghiệm cao hơn (tiết kiệm thời gian, công sức, chi phí cho thí nghiệm) Trong phương pháp này sử dụng hai kế hoạch sau:

Kế hoạch bậc một 2k (Phạm Hồng Hải, 2007; Nguyễn Minh Tuyển, 2007): Với k là số yếu tố ảnh hưởng (nhiệt độ, pH, thời gian, nồng độ,…) và mỗi yếu

tố Zj (j =1 ,k) thay đổi trong khoảng 2 mốc từ Zmin

Z Z

Z1 , 2, , ) gọi là tâm

kế họach

Kế hoạch trực giao bậc hai Box – Wilson: Khi mô hình bậc 1 không phù

hợp với thực nghiệm, người ta tiến hành những thí nghiệm bổ sung tiến về vùng tối ưu (gần dừng) hoặc trên cơ sở phân tích số liệu mà tiến hành kế hoạch trực giao bậc 2 Box – Wilson Phương trình hồi quy trong trường hợp này có dạng:

bj – các hiệu ứng tuyến tính

buj– các hiệu ứng tương tác đôi

bjj – các hiệu ứng bình phương

Mô tả quá trình xác định thông số tối ưu của “enzyme cocktail”: Quá

trình thủy phân nguyên liệu giàu liglocellulose thành các đường lên men sử

dụng hỗn hợp ba enzyme thủy phân (AltFAE, XpoAE và Cell/Xyl) với các yếu

tố ảnh hưởng như thời gian (h), nhiệt độ phản ứng (0C), pH, lượng nguyên liệu (%), hoạt tính enzyme (U) Thông số tối ưu hóa được tổng hợp bằng hàm lượng đường khử Y (mg/g cơ chất khô) Bằng cách khảo sát một số các thông số ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa để tìm hiệu suất tối ưu (y) thông qua các điều kiện tối ưu cho hỗn hợp “enzyme cocktail” Do vậy, mục đích chính của quy hoạch thực nghiệm nhằm tìm ra các giá trị tối ưu (nhiệt độ, pH, thời gian) và tỷ

lệ “enzyme cocktail”/cơ chất của hỗn hợp “enzyme cocktail” trong cùng một phản ứng thủy phân vật liệu giàu lignocellulose trên cơ sở mô hình thực nghiệm thống kê mô tả tương hợp kết quả thực nghiệm Bằng việc bố trí các thí nghiệm với lượng cơ chất thay đổi từ 3,2% đến 6,4% và thể tích mỗi enzyme thủy phân

biến đổi trong khoảng: Cell/Xyl 0,45ml - 1ml; AltFAE: 0,12 - 0,7 ml; XpoAE:

0,14 – 0,6ml, nhiệt độ: 35 – 450C, pH: 4,5 – 5,5 và thời gian: 24 – 72h Mỗi thí nghiệm đều được tiến hành lặp lại 3 lần, kết quả phân tích hàm lượng đường khử theo phương pháp DNS được tính bằng trung bình của 3 lần thí nghiệm độc

lập

2.5.2 Tiền xử lý bã mía bằng phương pháp hóa học, kết hợp sử dụng hỗn hợp enzyme thủy phân để nâng cao hiệu suất chuyển hóa đường

Phương pháp sử dụng kiềm

25

Bã mía sau khi nghiền nhỏ được ngâm trong dung dịch NaOH ở các nồng

độ khác nhau (0.05M, 0.1M, 0.15M, 0.2M, 0.25M, 0.3M, 0.35M, 0.4M, 0.45M, 0.5M) và ủ ở điều kiện 850C trong vòng 2.5 giờ (hàm lượng cơ chất là 4.8%) Sau đó làm nguội, chuẩn pH dung dịch về pH = 5 và bổ sung hỗn hợp enzyme theo tỉ lệ nhất định Đem ủ ở điều kiện 400C trong 48 giờ

Tiến hành xác định hàm lượng đường khử của dung dịch mẫu trước và sau khi ủ với hỗn hợp enzyme

Tiến hành xác định hàm lượng đường khử của dung dịch mẫu trước và sau khi ủ với hỗn hợp enzyme

2.5.3 Phương pháp định lượng đường khử bằng acid dinitrosalicylic (DNS)

- Nguyên lý

Glucose hay đường khử nói chung phản ứng tạo màu với thuốc thử DNS Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường Glucose trong một phạm vi nhất định Sản phẩm sau phản ứng được xác định bằng phương pháp so màu ở bước sóng 540nm Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS ta sẽ dễ dàng tính được hàm lượng đường của mẫu nghiên cứu [24]