NGHIÊN CỨU BƯỚC ĐẦU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC LOẠI TINH DẦU LI TRÍCH TỪ CÂY HÚNG QUẾ (OCIMUM BASILICUM L) VÀ CÂY HÚNG CÂY (MENTHA ARVENSIS L)

  BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU BƯỚC ĐẦU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC LOẠI TINH DẦU LI TRÍCH TỪ CÂY HÚNG QUẾ (OCIMUM BASILICUM L) VÀ CÂY HÚNG CÂY (MENTHA ARVENSIS L) Họ tên sinh viên : HỒ THỊ ÁNH Ngành : CHẾ BIẾN BẢO QUẢN NƠNG SẢN THỰC PHẨM Niên khố : 2005-2009 Tháng 7/ 2009     NGHIÊN CỨU BƯỚC ĐẦU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC LOẠI TINH DẦU LY TRÍCH TỪ CÂY HÚNG QUẾ (Ocimum Basilicum L) VÀ HÚNG CÂY (Mentha Arvensis L) Tác giả HỒ THỊ ÁNH Khóa luận đệ trình để đáp ứng u cầu cấp Kỹ Sư ngành Chế Biến Bảo Quản Nông Sản Thực Phẩm Giáo viên hướng dẫn: TS Phan Thế Đồng Tháng 08/2009   -i-   LỜI CẢM ƠN Với tất chân thành, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới : Quý thầy cô Khoa Công Nghệ Thực Phẩm, Đại Học Nông Lâm TP HCM tận tâm truyền đạt kiến thức khoa học cho em suốt khóa học TS Phan Thế Đồng, trưởng Khoa Công Nghệ Thực Phẩm, trường Đại Học Nông Lâm TP HCM nhiệt tình hướng dẫn bảo cho em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp Q thầy phòng thí nghiệm Hóa Sinh, Vi Sinh thuộc Khoa Công Nghệ Thực Phẩm Trung Tâm Phân Tích Hóa Lý, Đại Học Nơng Lâm TP HCM tận tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để em sử dụng thiết bị máy móc cần thiết cho việc thực đề tài Gia đình, người thân bạn bè động viên, giúp đỡ suốt thời gian học đại học Hồ Thị Ánh   - ii -   TĨM TẮT Đề tài « Nghiên cứu bước đầu khả kháng khuẩn loại tinh dầu li trích từ húng quế (Ocimum basilicum L) húng (Mentha arvensis L) » thực nhằm tìm hiểu khả ức chế tinh dầu phát triển số vi sinh vật gây bệnh Nguyên liệu sử dụng nghiên cứu húng quế húng trồng Tiền Giang Tinh dầu li trích phương pháp chưng cất nước Những kết thu hàm lượng tinh dầu húng quế đạt 0,239 % tính trọng lượng tươi, tương ứng với tỉ lệ 0,164 % tính trọng lượng chất khô Đối với tinh dầu húng 0,259 % trọng lượng tươi 1,386 % trọng lượng khô Liên quan đến khả kháng khuẩn, tinh dầu húng quế ức chế tất chủng vi khuẩn thử nghiệm ngoại trừ Pseudomonas aeruginosa ATTC 27853 Trong tinh dầu húng ức chế chủng vi khuẩn Escherichia coli ATTC 25922, Salmonella typhmurium, Shigella, Bacillus cereus, Bacillus subtilis ATTC 6633, Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA) ATTC 43300 dãy nồng độ thử nghiệm Nhưng chủng Klebsiella, Proteus, Staphylococcus aureus ATTC 29213, Streptococcus faecalis ATTC 29212, 29212 dãy nồng độ sử dụng khơng có tác dụng Tinh dầu húng khơng có tác dụng chủng Pseudomonas aeruginosa ATTC 27853   - iii -   MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN i TÓM TẮT ii MỤC LỤC .iii DANH SÁCH CÁC BẢNG vii DANH SÁCH CÁC HÌNH viii Chương GIỚI THIỆU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái quát chung tinh dầu 2.1.1 Định nghĩa tinh dầu 2.1.2 Lịch sử phát triển tinh dầu 2.1.3 Nguyên liệu sản xuất tinh dầu 2.1.4 Phương pháp sản xuất tinh dầu 2.1.4.1 Phương pháp chưng cất 2.1.4.2 Những phương pháp sản xuất tinh dầu 2.1.5 Vai trò tinh dầu đời sống thực vật 2.1.5.1 Nhiệm vụ dẫn dụ 2.1.5.2 Nhiệm vụ bảo vệ 2.1.5.3 Nhiệm vụ hỗ trợ phát triển 2.1.5.4 Dung môi hữu 10 2.1.5.5 Hoạt tính kháng sinh 10 2.1.6 Hoạt tính sinh học tinh dầu 10 2.1.6.1 Hoạt tính kháng khuẩn 10 2.1.6.2 Hoạt tính kháng nấm 11   - iv -   2.2 Khái quát loại nghiên cứu 12 2.2.1 Khái quát húng quế (Ocimum basilicum) 12 2.2.1.1 Thành phần hoá học húng quế 14 2.2.1.2 Các số hố lí tinh dầu húng quế 15 2.2.1.3 Dược tính húng quế 15 2.2.1.4 Các sản phẩm từ húng quế 17 2.2.2 Tổng quan húng (Mentha arvensis) 18 2.3 Khái quát chủng vi sinh vật nghiên cứu 20 2.3.1 Escherichia coli 20 2.3.2 Klebsiella 20 2.3.3 Samonella 21 2.3.4 Proteus 21 2.3.5 Shigella 21 2.3.6 Pseudomonas aeruginosa 22 2.3.7 Bacillus subtilis 23 2.3.8 Bacillus cereus 23 2.3.9 Staphylococcus aureus 23 2.3.10 Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus 24 2.3.11 Enterococcus feacalis 24 2.4 Khái quát phương pháp nghiên cứu khả kháng khuẩn 25 2.4.1 Phương pháp khuếch tán thạch 25 2.4.2 Phương pháp hoà tan thạch 25 2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng lên kết 25 2.4.3.1 Mật độ vi khuẩn 25 2.4.3.2 Môi trường nuôi cấy pH 26   -v-   2.4.3.3 Nhiệt độ thời gian ủ 26 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 27 3.1 Thời gian địa điểm 27 3.2 Vật liệu 27 3.3 Thiết bị 27 3.4 Các chủng vi khuẩn thử nghiệm 27 3.5 Môi trường nuôi cấy 28 3.6 Phương pháp nghiên cứu 28 3.6.1 Xác định độ ẩm nguyên liệu 28 3.6.2 Phương pháp li trích tinh dầu 29 3.6.3 Nghiên cứu khả kháng khuẩn tinh dầu húng quế húng 30 3.6.3.1 Thử nghiệm định tính khả kháng khuẩn 31 3.6.3.2 Xác định số MIC phương pháp hoà tan thạch 32 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 4.1 Hàm lượng nước nguyên liệu 34 4.2 Hàm lượng tinh dầu nguyên liệu 34 4.3 Kết định tính khả kháng khuẩn tinh dầu húng quế húng 35 4.4 Kết phép thử định lượng tìm số MIC 37 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41 5.1 Kết luận 41 5.2 Đề nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 PHỤ LỤC 46   - vi -   DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các số hố lí tinh dầu húng quế 14 Bảng 4.1 Hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu húng quế húng vi khuẩn gram âm .35 Bảng 4.2 Hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu húng quế húng vi khuẩn gram dương 35 Bảng 4.3 Chỉ số MIC loại tinh dầu vi khuẩn gram âm .37 Bảng 4.4 Chỉ số MIC loại tinh dầu vi khuẩn gram dương 37   - vii -   DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Húng quế 13 Hình 2.2 Hoa húng quế 13 Hình 2.3 Hạt é 14 Hình 2.4 Thức uống làm từ hạt é 14 Hình 2.5 Tinh dầu húng quế 19 Hình 2.6 Húng 19 Hình 2.7 Tinh dầu húng 19 Hình 2.8 Hoa húng 19 Hình 3.1 Sơ đồ trình xác định độ ẩm nguyên liệu 29 Hình 3.2 Sơ đồ trình chưng cất tinh dầu 30 Hình 3.3 Mơ hình phép kiểm tra định tính khả kháng khuẩn phương pháp khuếch tán thạch 31 Hình 3.5 Sơ đồ xác định số MIC 32 Hình 3.5 Sơ đồ tiến trình thực 33   - viii -   Chương GIỚI THIỆU Tinh dầu xuất phát triển với phát triển văn minh nhân loại Ngày nay, chúng sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực : Trong công nghiệp mĩ phẩm để sản xuất nước hoa, son, phấn…Trong công nghệ thực phẩm để gia hương cho sản phẩm bánh kẹo, thuốc lá, rượu,…Trong công nghiệp sản xuất hàng tiêu dùng để sản xuất xà bơng, dầu gội đầu,… Chính li trích tinh dầu lĩnh vực quan trọng số quốc gia Các chất có nguồn gốc chủ yếu từ thực vật Nguồn gốc chúng phong phú đa dạng Đặc tính quan trọng thay so với hợp chất tổng hợp chúng vơ hại cho môi trường bị phân hủy dễ dàng Ngày nay, với phát triển kinh tế, mức sống người dân ngày nâng cao, người tiêu dùng ngày quan tâm đến chất lượng thực phẩm nhằm đảm bảo sức khỏe Vì lí sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên hữu thường ưu tiên lựa chọn Từ lâu, tinh dầu sử dụng không nhờ mùi hương chúng mà nhờ khả điều trị số bệnh nhiễm khuẩn Trong năm gần đây, vấn đề đề kháng kháng sinh vi sinh vật gây bệnh ngày nghiêm trọng, nhiên việc phát triển kháng sinh hạn chế Chính vậy, sản phẩm từ tự nhiên có tính kháng khuẩn trở thành đối tượng nhiều nghiên cứu khoa học Nhiều tinh dầu chứng minh khả kháng lại vi khuẩn, nấm men, nấm mốc Những đặc tính áp dụng nhiều lĩnh vực Trong sản xuất dược phẩm mĩ phẩm, tinh dầu sử dụng không yếu tố gia hương cho sản phẩm mà thành phần dược liệu Trong sản xuất thực phẩm, vai trò tăng cường hương vị cho sản phẩm, chúng đóng vai trò chất chống oxy hóa chất bảo quản nhằm ức chế phát triển vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm   -1-   Trong số chủng vi khuẩn thử nghiệm, phát triển P aeruginosa không bị tác động Điều khẳng định lần tinh dầu húng quế húng khơng có tác động chủng vi khuẩn Với tinh dầu húng quế : Các nồng độ ức chế phát triển vi khuẩn gram âm : 1024 µg/ml, 2048 µg/ml, 4096 µg/ml Đối với vi khuẩn gram dương : 4096 µg/ml 8192 µg/ml Từ kết này, thấy nồng độ vi khuẩn gram dương bị ức chế cao vi khuẩn gram âm Tuy nhiên, Prasad cộng (1986) ghi nhận tác động kháng khuẩn tinh dầu húng quế vi khuẩn gram dương mạnh vi khuẩn gram âm Điều khác biệt giải thích khác lồi húng quế sử dụng nghiên cứu Húng quế trồng nơi khác thành phần hố học khác Theo Jansen cộng (1986), tinh dầu húng quế có khả ức chế vi khuẩn : Echesrichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Tuy nhiên, nghiên cứu Ndounga Ouamba (1997) tinh dầu khơng có tác động lồi vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa Enterococcus feacalis Những tác giả ghi nhận tinh dầu húng quế có khả ức chế loài vi khuẩn : Staphylococcus aureus, Echesrichia coli, Samonella sp, Klebsiella pneumoniea Proteus vulgaris Hơn nữa, người ta tìm số MIC tinh dầu loài vi khuẩn thử nghiệm thay đổi từ 1250 đến 5000 µg/ml So với kết thu được, tác dụng kháng khuẩn húng quế Việt Nâm yếu Điều tái khẳng định đặc tính kháng khuẩn loại tinh dầu phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện trồng trọt Đối với tinh dầu húng : - Các vi khuẩn gram âm Shigella, Salmonella typhi, E.coli bị ức chế nồng độ 4096 µg/ml, 8192 µg/ml 4096 µg/ml Ngược lại, dãy nồng độ thử nghiệm khơng có tác dụng loài Klebsiella Proteus   - 38 -   - Đối với vi khuẩn gram dương Bacillus cereus, Bacillus subtilis, MRSA bị ức chế nồng độ cao 8192 µg/ml Dãy nồng độ thử nghiệm khơng có tác dụng Staphylococcus aureus Enterococcus feacalis - Chúng ta ghi nhận số thu phù hợp với kết thu phép thử định tính Các lồi Klebsiella, Proteus Streptococcus feacalis có khả đề kháng mạnh so với chủng vi khuẩn khác - Các kết thu hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu húng quế tương đối mạnh tinh dầu húng - Tuy nhiên, nồng độ có khả ức chế chủng vi sinh vật thử nghiệm loại tinh dầu cao Điều dẫn đến việc ứng dụng tinh dầu công nghệ thực phẩm bị hạn chế - Chúng ta ghi nhận vi khuẩn gram dương bị ức chế nồng độ cao so với vi khuẩn gram âm Điều có nghĩa khả đề kháng vi khuẩn gram dương tốt vi khuẩn gram âm   - 39 -   Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Sau tiến hanhg đề tài nghiên cứu, rút số kết luận đề nghị sau : 5.1 Kết luận Những nghiên cứu sơ khả kháng khuẩn tinh dầu húng quế húng cho phép kết luận : - Tinh dầu húng quế có khả ức chế tất chủng vi khuẩn thử nghiệm trừ P.aeruginosa Chỉ số MIC tinh dầu húng quế chủng vi khuẩn thử nghiệm : - E coli : 2048 µg/ml Bacillus cereus : 4096 µg/ml Klebsiella : 4096 µg/ml Bacillus subtilis : 4096 µg/ml Proteus : 4096 µg/ml MRSA : 8192 µg/ml Samonella typhi : 2048 µg/ml Shigella : 1024 µg/ml Enterococcus feacalis : 8192 µg/ml Staphylococcus aureus : 8192 g/ml Tinh dầu húng có khả ức chế phát triển E coli, Samonella typhi, Shigella, Bacillus cereus, Bacillus subtilis MRSA dãy nồng độ thử nghiệm Ngược lại, loài : Klebsiella, Proteus, Staphylococcus aureus, Enterococcus feacalis chúng không bị ức chế dãy nồng độ Tinh dầu húng khơng có tác dụng P.aeruginosa Chỉ số MIC tinh dầu húng chủng vi khuẩn thử nghiệm : E coli : 4096 µg/ml Bacillus cereus : 8192 µg/ml Samonella typhi : 8192 µg/ml Bacillus subtilis : 8192 µg/ml Shigella : 4096 µg/ml MRSA : 8192 µg/ml 5.2 Đề nghị Đây nghiên cứu sơ khả kháng khuẩn vài chủng vi khuẩn Để đạt kết có hệ thống hơn, chúng tơi đề nghị :   - 41 -   - Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu húng quế húng số chủng vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm - Tiếp tục nghiên cứu khả kháng khuẩn chủng vi sinh vật gây bệnh khác - Xác định thành phần hóa học loại tinh dầu nhằm xác định hợp chất có hoạt tính chủ yếu - Nghiên cứu khả bổ sung loại tinh dầu vào loại thực phẩm chức   - 42 -   TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Nguyễn Văn Thanh Trần Cát Đơng, 2002 Xây dựng mơ hình đánh giá chất có tiềm kháng khuẩn, tạp chí y học thành phố Hồ Chí Minh, tập 6, phụ số Lê Thị Lài, 2004 Chiết xuất khảo sát thành phần tính chất tinh dầu tắc trồng miền Nam, luận văn tốt nghiệp đại học khoa Công Nghệ Thực Phẩm trường đại học Nông Lâm TP HCM Mai Hoàng Liên, 2005 Khảo sát nguồn nguyên liệu, thành phần hóa học, số hóa lý, khả kháng khuẩn tinh dầu tràm trà, luận văn tốt nghiệp đại học khoa Công Nghệ Thực Phẩm trường đại học Nông Lâm TP HCM Phan Trần Thúy Loan, 2007 Khảo sát tác dụng kháng khuẩn-kháng nấm số chất sử dụng sản phẩm chăm sóc da móng, luận văn tốt nghiệp đại học khoa Dược đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh Đỗ Tất Lợi, 2003 Những thuốc vị thuốc Việt, NXB Y Học Nguyễn Đức Minh, 1975 Tính kháng khuẩn thuốc Việt Nam, NXB Y Học Lê Ngọc Thạch, 2003 Tinh dầu - L’huile essentielle, NXB Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mĩ phẩm (tái lần hai), NXB Giáo Dục Nguyễn Năng Vinh, 1977 Kỹ thuật khai thác sơ chế tinh, NXB Nông Nghiệp NGOẠI VĂN   - 43 -   10 Jean-Paul Larpent, coordonnateur, 1997 Microbiologie alimentaire Lavoisier TEC&DOC 11 C M Bourgeois, J F Mescle et J Zucca, coordonnateur, 1996 Microbiologie alimentaire, tome Technique et Documentation 12 Raimo Hiltunen and Yvonne Holm, 1999 Basil the genus Ocimum Departement of Pharmacy, university of Helsinki, Finland TỪ INTERNET http://diendanykhoa.com/showthread.php?p=9876 http://en.wikipedia.org/wiki/Basil http://www.vulgaris-medical.com/encyclopedie/klebsiella-2654.html http://www.chu-rouen.fr/ssf/organ/klebsiellapneumoniae.html http://www.algerie-dz.com/forums/international/44506-la-bacterie-qui-fait-tremblerisrael.html http://fr.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas_aeruginosa http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6W8H-4TMRJYW3&_user=10&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_sort=d&view=c&_acct=C000050221 &_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=0bba0e685552e49205abf3715cb8d0 97 http://www.npalab.com/vietnamese/phantich/visinhvat/pseudomonas/ http://74.125.153.132/search?q=cache:SXrv6EFIflAJ:ihph.org/DownloadFolder/nguye nquoctuan%252013%252004%25202009.pdf+vi+khuan+Pseudomonas+aeruginosa&c d=6&hl=vi&ct=clnk&gl=vn 10 http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=17641462 11 http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=3979851   - 44 -   PHỤ LỤC   PHỤ LỤC : THÀNH PHẦN HỐ HỌC CỦA CÁC MƠI TRƯỜNG NI CẤY MHA (Muller Hinton Agar) Thành phần (g) pha chế cho lít mơi trường Cao thịt bò : Caséine thuỷ phân : 17,5 Tinh bột : 1,5 Aga : 17 Nguồn gốc Ấn Độ pH môi trường nhiệt độ 25°C : 7,3 ± 0,2 Nấu tiệt trùng 15 phút nhiệt độ 1210C TSB (Triptic soy brooth) Thành phần (g) pha chế cho lít mơi trường Tryptone : 17,0 Peptone papaïnique de soja : 3,0 Glucose : 2,5 Phosphate dipotassique : 2,5 Chlorure de sodium : 5,0 Nguồn gốc Ấn Độ pH môi trường nhiệt độ 25°C : 7,3 ± 0,2 Nấu tiệt trùng 15 phút nhiệt độ 1210C   - 45 -   PHỤ LỤC : THIẾT BỊ CHƯNG CẤT CLEVENGER   - 46 -   PHỤ LỤC : THIẾT BỊ XÁC ĐỊNH ẨM ĐỘ DINSTA   - 47 -   PHỤ LỤC : HÌNH ẢNH CỦA PHÉP THỬ ĐỊNH TÍNH KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU HÚNG QUẾ VÀ HÚNG CÂY NGUYÊN CHẤT   P.aeruginosa Klebsiella Proteus Enterococcus.feacalis MRSA Bacillus cereus - 48 -   Bacillus subtilis E Coli Samonella Shigella Enterococcus aureus   - 49 -   PHỤ LỤC : HÌNH ẢNH PHÉP THỬ ĐỊNH LƯỢNG TÌM CHỈ SỐ MIC CỦA TINH DẦU HÚNG QUẾ Đĩa chứng mơi trường 128 µg/ml 256 µg/ml 512 µg/ml   1024 µg/ml - 50 -   2048 µg/ml 4096 µg/ml 8192 µg/ml   - 51 -   PHỤ LỤC : HÌNH ẢNH PHÉP THỬ ĐỊNH LƯỢNG TÌM CHỈ SỐ MIC CỦA TINH DẦU HÚNG CÂY Đĩa chứng môi trường   128 µg/ml 256 µg/ml 512 µg/ml 1024 µg/ml - 52 -   2048 µg/ml 4096 µg/ml 8192 µg/ml   - 53 - ... liệu phải thu ho ch vào thời điểm mà đạt đến độ chín kĩ thuật Trong trường hợp khai thác hoa, phải thu ho ch vào thời điểm hoa chuẩn bị nở Đối với trái cây, nên thu ho ch chín ho n toàn Trong... dẫn dụ Thông thường thụ phấn loại hoa thực chủ yếu côn trùng Côn trùng tìm đến hoa hương thơm hoa toả Ở số loài hoa, tinh dầu có khả dẫn dụ trùng đến giúp cho hoa thụ phấn 2.1.5.2 Nhiệm vụ bảo... khúc xạ nD 1,5105 Chỉ số axít 0,14 Chỉ số xà bơng ho 10,58 Chỉ số este ho 10,44 (Theo Giáo sư Lê Ngọc Thạch cộng sự, khoa Ho Học trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên) 2.2.1.3 Dược tính húng quế Húng