TÁCH CHIẾT 6GINGEROL CÓ TRONG CỦ GỪNG (Zingiber officinale Roscoe) VÀ BÁN TỔNG HỢP DẪN XUẤT 6GINGEROL CHỨA KHUNG PYRIMIDINE

6-Gingerol, thành phần chính gây ra vị cay nồng của Gừng (Zingiber officinale Roscoe) và các dẫn xuất của nó được biết là có hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm và kháng ung thư. Trong nghiên cứu này, dẫn xuất 6-gingerol mang khung pyrimidine đã được tổng hợp thành công với hiệu suất khá (40,15%) thông qua một chuỗi tổng hợp ba bước bắt đầu từ 6-gingerol được tách chiết từ củ Gừng. Cấu trúc các chất được xác định bằng phương pháp phổ nghiệm MS, 1H-NMR, 13C-NMR. Việc đưa khung sườn pyrimidine vào cấu trúc 6-gingerol được kỳ vọng sẽ tăng cường hoạt tính sinh học của 6-gingerol, đặc biệt là hoạt tính kháng khuẩn và hoạt tính gây độc tế bào.

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

LÊ TRỌNG HIẾU

TÁCH CHIẾT 6-GINGEROL CÓ TRONG CỦ GỪNG

(Zingiber officinale Roscoe) VÀ BÁN TỔNG HỢP

DẪN XUẤT 6-GINGEROL CHỨA KHUNG PYRIMIDINE

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CỬ NHÂN HÓA HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGs Ts BÙI THỊ BỬU HUÊ

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LÊ TRỌNG HIẾU

TÁCH CHIẾT 6-GINGEROL CÓ TRONG CỦ GỪNG

(Zingiber officinale Roscoe) VÀ BÁN TỔNG HỢP

DẪN XUẤT 6-GINGEROL CHỨA KHUNG PYRIMIDINE

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CỬ NHÂN HÓA HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGs Ts BÙI THỊ BỬU HUÊ

CẦN THƠ-2017

Bộ Môn Hóa Học

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

- -

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Cán bộ hướng dẫn: PGs Ts Bùi Thị Bửu Huê

Tên đề tài: Tách chiết 6-gingerol có trong củ Gừng (Zingiber officinale

Roscoe) và bán tổng hợp dẫn xuất 6-gingerol chứa khung pyrimidine

Sinh viên thực hiện: Lê Trọng Hiếu MSSV: B1304043

Nội dung nhận xét:

Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp:

………

………

Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp:

Đánh giá nội dung thực hiện đề tài:

………

… … ……… Những vấn đề còn hạn chế:

………

… ……… Nhận xét đối với sinh viên thực hiện đề tài:

………

… ……… Kết luận, đề nghị và điểm:

………

… ………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2017

Cán bộ hướng dẫn

Tên đề tài: Tách chiết 6-gingerol có trong củ Gừng (Zingiber officinale

Roscoe) và bán tổng hợp dẫn xuất 6-gingerol chứa khung pyrimidine

Sinh viên thực hiện: Lê Trọng Hiếu MSSV: 1304043

Lớp: Hóa dược 2 Khóa: 39 Nội dung nhận xét:

Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp:

………

………

Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp:

Đánh giá nội dung thực hiện đề tài:

………

… ……… Những vấn đề còn hạn chế:

………

… ……… Nhận xét đối với sinh viên thực hiện đề tài:

………

… ……… Kết luận, đề nghị và điểm:

………

… ………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2017

Cán bộ chấm phản biện

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên

cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận

văn cùng cấp nào khác

Cần Thơ, ngày 10 tháng 04 năm 2017

Sinh viên cam đoan

Lê Trọng Hiếu

LỜI CẢM ƠN

Luận văn tốt nghiệp này sẽ không thể hoàn thành nếu thiếu đi sự giúp đỡ, khuyến khích và động viên của rất nhiều cá nhân Tôi muốn nhân cơ hội này để bày tỏ sự cảm ơn chân thành đến họ

Đầu tiên, tôi muốn gửi lòng biết ơn sâu sắc đến PGs Ts Bùi Thị Bửu Huê

vì những chỉ dẫn chuyên môn quý báu, lòng kiên nhẫn và sự quan tâm sâu sắc Sự hướng dẫn tận tình của Cô trong suốt quá trình thực hiện luận văn là động lực giúp tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp dễ dàng và thuận lợi hơn

Tôi cũng xin được gởi lời cảm ơn đến quý Thầy Cô Khoa Khoa học Tự nhiên, những người đã truyền đạt những kiến thức quý báo làm nền tảng giúp tôi

thực hiện luận văn này

Các anh, chị học viên cao học hữu cơ khóa 20, 21 và các bạn sinh viên hóa dược khóa 39, 40 với những lời động viên, sự quan tâm chân thành và sự

giúp đỡ hết sức nhiệt tình là một phần không thể thiếu trong sự hoàn thành của

luận văn tốt nghiệp này Đặc biệt, xin gởi đến ThS Nguyễn Văn Tuấn – cao học học hữu cơ khóa 21 lời cám ơn sâu sắc với những ý kiến đóng góp quý báo cho

đề tài Tôi xin chân thành cảm kích những giúp đỡ hữu ích đó

Và trên hết, tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn vô hạn đến cha mẹ Nếu không

có sự nuôi dưỡng cùng với lòng yêu thương của cha mẹ tôi đã không thể hoàn thành đề tài luận văn tốt nghiệp này Những hỗ trợ trên tất cả mọi phương diện đã giúp đỡ tôi vượt qua rất nhiều trở ngại trong suốt quãng đời sinh viên

Xin chân thành cảm ơn!

TÓM TẮT

6-Gingerol, thành phần chính gây ra vị cay nồng của Gừng (Zingiber

officinale Roscoe) và các dẫn xuất của nó được biết là có hoạt tính kháng khuẩn,

kháng viêm và kháng ung thư Trong nghiên cứu này, dẫn xuất 6-gingerol mang khung pyrimidine đã được tổng hợp thành công với hiệu suất khá (40,15%) thông qua một chuỗi tổng hợp ba bước bắt đầu từ 6-gingerol được tách chiết từ củ Gừng Cấu trúc các chất được xác định bằng phương pháp phổ nghiệm MS,

1

H-NMR, 13C-NMR Việc đưa khung sườn pyrimidine vào cấu trúc 6-gingerol được kỳ vọng sẽ tăng cường hoạt tính sinh học của 6-gingerol, đặc biệt là hoạt tính kháng khuẩn và hoạt tính gây độc tế bào

Từ khóa: Gừng, 6-gingerol, pyrimidine

ABSTRACT

6-Gingerol, the main component which causes the taste of ginger (Zingiber

officinale Roscoe), and its derivatives have been known to possess antibacterial,

anti-inflammatory and anti-cancer activities In this study, a containing 6-gingerol derivative has been successfully synthesized in reasonable

pyrimidine-total yield (40.15%) via a three step synthetic sequence starting from 6-gingerol

extracted from Ginger root The structure of the prepared compound was fully characterized by MS, 1H-NMR and 13C-NMR spectroscopic methodologies The introduction of the pyrimidine moiety into 6-gingerol core structure is expected to enhance the biological activity of 6-gingerol, especially the antimicrobial and cytotoxicity activities

Key: Ginger, 6-gingerol, pyrimidine

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iii

ABSTRACT iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH viii

DANH MỤC SƠ ĐỒ ix

DANH MỤC PHỤ LỤC x

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT xii

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Lý do chọn đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Tổng quan thực vật 3

2.1.1 Giới thiệu cây Gừng 3

2.1.2 Phân loại thực vật 3

2.1.3 Mô tả thực vật 4

2.1.4 Thành phần hóa học 4

2.2 Hoạt chất 6-gingerol và dẫn xuất của nó 5

2.2.1 Khát quát 5

2.2.2 Sự chuyển hóa giữa 6-gingerol, 6-shogaol và zingerone 5

2.2.3 Hoạt tính của 6-gingerol 6

2.2.3.1 Kháng khuẩn, kháng viêm 6

2.2.3.2 Hoạt tính kháng khối u 6

2.2.4 Dẫn xuất tổng hợp của 6-gingerol 7

2.3 Phương pháp tách chiết các chất ra khỏi cây 8

2.3.1 Dung môi để tách chiết hợp chất ra khỏi mẫu cây 8

2.4.1 Giới thiệu về pyrimidine 12

2.4.2 Các nghiên cứu tổng hợp dẫn xuất pyrimidine 13

2.4.3 Hoạt tính sinh học của dẫn xuất pyrimidine 15

2.5 Một số phản ứng hóa học sử dụng trong nghiên cứu 16

2.5.1 Phản ứng tổng hợp ether Williamson 16

2.5.2 Phản ứng oxy hóa alcol bằng pyridinium chlorochromate 17

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 Phương pháp nghiên cứu 18

3.2 Phương tiện nghiên cứu 18

3.2.1 Hóa chất 18

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ 19

3.2.3 Tinh chế một số hóa chất 19

3.3 Thực nghiệm 19

3.3.1 Xử lý nguyên liệu 19

3.3.2 Tách chiết sản phẩm 6-gingerol (G1) tinh khiết 21

3.3.3 Tổng hợp 5-hydroxy-1-(3-methoxy-4-((4-nitrobenzyl)oxy)phenyl) decan-3-one (G2) 21

3.3.4 Tổng hợp 1-(3-methoxy-4-((4-nitrobenzyl)oxy)phenyl)decane-3,5-dione (G3) 22

3.3.5 Tổng hợp 4-(3-methoxy-4-((4-nitrobenzyl)oxy)phenethyl)-6-pentylpyrimidin-2-amine (G4) 23

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

4.1 Tách chiết 6-gingerol (G1) từ củ gừng 25

4.2 Tổng hợp 5-hydroxy-1-(3-methoxy-4-((4-nitrobenzyl)oxy)phenyl)decan-3-one (G2) 28

4.3 Tổng hợp 1-(3-methoxy-4-((4-nitrobenzyl)oxy)phenyl)decane-3,5-dione (G3) 30

4.4 Tổng hợp 4-(3-methoxy-4-((4-nitrobenzyl)oxy)phenethyl)-6-pentyl pyrimidin-2-amine (G4) 35

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39

5.1 Kết luận 39

5.2 Kiến nghị 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

PHỤ LỤC 46

DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Dữ liệu phổ 1

H-NMR của sản phẩm G1 26 Bảng 4.2 Dữ liệu Phổ 13

C-NMR và phổ DEPT của sản phẩm G1 27 Bảng 4.3 Dữ liệu phổ 1

H-NMR của sản phẩm G2 29 Bảng 4.4 Dữ liệu phổ 1

H-NMR của sản phẩm G3 32 Bảng 4.5 Dữ liệu Phổ 13

C-NMR và phổ DEPT của sản phẩm G3 32 Bảng 4.6 Dữ liệu phổ 1

H-NMR của sản phẩm G4 36 Bảng 4.7 Dữ liệu Phổ 13

C-NMR và phổ DEPT của sản phẩm G4 37

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Đặc điểm hình thái củ Gừng 4

Hình 2.2 Công thức cấu trúc hoạt chất 6-gingerol 5

Hình 2.3 Các dẫn xuất của 6-gingerol có hiệu quả đáp ứng ức chế TRPV1 7

Hình 2.4 Các dẫn xuất 6-gingerol trong thử nghiệm in vitro trên dòng tế bào ung thư MCF-7 8

Hình 2.5 Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng bằng bình lóng 10

Hình 2.6 Pyridine và các dạng đồng phân khác nhau của họ diazine 12

Hình 2.7 Hợp chất tự nhiên và tổng hợp chứa khung pyrimidine 12

Hình 2.8 Thuốc kháng sinh chứa nhóm amino tự do trên nhân pyrimidine 15

Hình 3.1 Gừng tươi được làm sạch 19

Hình 3.2 Bột Gừng nguyên liệu 19

Hình 4.1 Sản phẩm G1 đã được tinh sạch 25

Hình 4.2 Sắc ký lớp mỏng sản phẩm G1 (Hex:Ea:CH3COOH = 50:50:1) 25

Hình 4.3 Sắc ký lớp mỏng sản phẩm thô tổng hợp G2 (Hex:Ea = 1:1) 28

Hình 4.4 Sản phẩm G2 29

Hình 4.5 Sắc ký lớp mỏng sản phẩm thô tổng hợp G3 (Hex:Ea = 1:1) 31

Hình 4.6 Sản phẩm G3 31

Hình 4.7 Sắc ký lớp mỏng sản phẩm thô tổng hợp G4 (Hex:Ea = 1:1) 35

Hình 4.8 Sản phẩm G4 35

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1 Tổng hợp dẫn xuất 6-gingerol chứa khung pyrimidine 2

Sơ đồ 2.1 Sự chuyển hóa 6-gingerol thành 6-shogaol 5

Sơ đồ 2.2 Sự chuyển hóa 6-gingerol thành zingerone 6

Sơ đồ 2.3 Phản ứng tổng hợp acid barbituric từ urea và acid malonic 13

Sơ đồ 2.4 Phản ứng tổng hợp các dẫn xuất pyrimidine từ ethyl acetoacetate và các amidine 13

Sơ đồ 2.5 Phản ứng tổng hợp ethyl 6-methyl-2-oxo-4-phenyl-1,2,3,4-tetrahydro pyrimidine-5-carboxylate 14

Sơ đồ 2.6 Phản ứng tổng hợp 4-methylpyrimidine 14

Sơ đồ 2.7 Phản ứng tổng hợp dẫn xuất 2-aminopyrimidine 14

Sơ đồ 2.8 Phản ứng tổng hợp dẫn xuất pyrimidine có 4 nhóm thế 15

Sơ đồ 2.9 Cơ chế phản ứng Williamson 16

Sơ đồ 2.10 Cơ chế phản ứng tạo thành phẩm O-alkylation và C-alkylation 16

Sơ đồ 2.11 Cơ chế của phản ứng oxy hóa alcol bậc 2 bằng PCC 17

Sơ đồ 3.1 Quy trình điều chế các loại cao từ bột củ Gừng 20

Sơ đồ 4.1 Phương trình phản ứng tổng hợp G2 28

Sơ đồ 4.2 Phương trình phản ứng tổng hợp G3 30

Sơ đồ 4.3 Phương trình phản ứng tổng hợp G4 35

Sơ đồ 4.4 Cơ chế phản ứng tổng hợp G4 38

DANH MỤC PHỤ LỤC Phụ lục 1 Các phổ của 6-gingerol (G1) 46

Phụ lục 2 Các phổ của 5-hydroxy-1-(3-methoxy-4-((4-nitrobenzyl)oxy)phenyl) decan-3-one (G2) 54

Phụ lục 3.1: Phổ MS (negative) của G3 58 Phụ lục 3.2: Phổ MS (positive) của G3 59

Phụ lục 4 Các phổ của pentylpyrimidin-2-amine (G4) 68

4-(3-methoxy-4-((4-nitrobenzyl)oxy)phenethyl)-6-Phụ lục 4.1: Phổ MS (negative) của G4 68 Phụ lục 4.2: Phổ MS (positive) của G4 69

DEPT Detortionless Enhancement by Polarization Transfer

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1.1 Lý do chọn đề tài

Các hợp chất có hoạt tính sinh học tồn tại rất phổ biến trong tự nhiên

Từ lâu con người đã biết phân lập ra những hợp chất thiên nhiên từ cây cỏ và động vật để dùng làm thuốc chữa bệnh Ngày nay, cùng với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật hiện đại, hướng nghiên cứu, phát triển thuốc theo con đường tổng hợp, bán tổng hợp và cô lập hợp chất thiên nhiên ngày càng phát triển mạnh mẽ Trong đó, con đường bán tổng hợp từ hợp chất

tự nhiên phát huy được những ưu điểm của tổng hợp toàn phần lẫn hóa học hợp chất thiên nhiên, đặc biệt là đối với các nước Châu Á – nơi có nguồn dược liệu vô cùng phong phú, đa dạng và dồi dào

Một trong những loài dược liệu được sử dụng phổ biến trên thế giới và

ở Việt Nam là Gừng (Zingiber officinale Roscoe) Đó là một cây thuốc được

sử dụng để phòng, chữa nhiều bệnh như viêm khớp, thấp khớp, bong gân, đau nhức cơ bắp, đau họng, đau bụng, táo bón, khó tiêu, nôn mửa, tăng huyết áp, mất trí nhớ, giảm đau, hạ sốt, bệnh truyền nhiễm, giun sán… [1-2]

Hiện nay, người ta đã biết được thành phần chủ yếu có hoạt tính trong Gừng là 6-gingerol – chất gây ra vị cay nồng của gừng [2] Những nghiên cứu gần đây cho thấy 6-gingerol còn có tác dụng kháng khuẩn [1], kháng oxi hóa [2, 6], chống kết tập tiểu cầu [3], đặc biệt 6-gingerol cũng gây độc tính đối với

tế bào ung thư ruột [4, 7], ung thư vú… [5, 7]

Trong một hướng nghiên cứu khác, tính đến năm 2014 đã có hơn 200 dẫn xuất khác nhau của pyrimidine được chứng minh là có hoạt tính kháng khuẩn Trong số đó, một số đã được thương mại hóa làm thuốc kháng sinh như brodiprim, iclaprim, trimethoprim [8]

Từ những kết quả trên có thể thấy đề tài “Tách chiết 6-gingerol có

trong củ Gừng (Zingiber officinale Roscoe) và bán tổng hợp dẫn xuất

6-gingerol chứa khung pyrimidine” là thực sự cần thiết, mở ra một hướng nghiên cứu nhiều tiềm năng nhưng chưa phổ biến ở Việt Nam, góp phần nâng cao hiệu quả sử dụng của Gừng, làm tăng giá trị của cây Gừng Việt Nam

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Đề tài nghiên cứu tách chiết 6-gingerol tinh khiết từ củ Gừng bằng

phương pháp ngâm dầm cổ điển Sau đó tiến hành bán tổng hợp tạo dẫn xuất

của 6-gingerol chứa khung pyrimidine

1.3 Nội dung nghiên cứu

– Trích ly 6-gingerol thô từ củ Gừng bằng phương pháp ngâm dầm cổ

điển trong dung môi ethanol

– Tinh chế 6-gingerol bằng sắc ký cột

– Bán tổng hợp tạo dẫn xuất của 6-gingerol chứa khung pyrimidine

Theo Sơ đồ 1.1 thì 6-gingerol sau khi đã tinh sạch được phản ứng với

4-nitrobenzyl bromide trong môi trường kiềm yếu tạo dẫn xuất

5-hydroxy-1-(3-methoxy-4-((4-nitrobenzyl)oxy)phenyl)decan-3-one (G2) Oxy hóa (G2)

bằng tác nhân PCC trong dichloromethane thu được hợp chất beta-diketone

(G3) Thực hiện phản ứng ghép vòng giữa (G3) với guanidine hydrochloride

cho sản phẩm dẫn xuất của 6-gingerol chứa khung pyrimidine (G4)

Sơ đồ 1.1 Tổng hợp dẫn xuất 6-gingerol chứa khung pyrimidine

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan thực vật

2.1.1 Giới thiệu cây Gừng

Chi Gừng Zingiber Bochmer gồm khoảng 100 loài, phân bố chủ yếu ở các khu vực nhiệt đới Châu Á và Châu Úc Riêng tại Trung Quốc hiện đã biết

khoảng trên 20 loài Trong số các loài gừng trồng thì loài Zingiber officinale

Roscoe được trồng phổ biến nhất

Ở Việt Nam, loài Gừng Z officinale được trồng trên khắp các địa

phương từ Bắc vào Nam, đặc biệt là các tỉnh miền núi Kết quả thu thập của Trung tâm Tài nguyên thực vật Việt Nam cho thấy từ năm 1994 - 2012 ở nước

ta có 22 loài khác nhau thuộc 9 chi của nguồn gen cây họ Gừng Trong đó chi

Gừng - Zingiber có số lượng loài và số lượng mẫu thu thập lớn hơn cả, tới 218 mẫu giống Ở Việt Nam, chi Gừng (Zingiber Roscoe) được thuần hoá sớm và

trồng phổ biến và có nhiều ứng dụng khác nhau cho con người như làm thuốc, gia vị, thực phẩm

-Theo Đông dược thì Gừng có hai loại

Can khương (Gừng khô): Gừng già đào củ vào mùa đông, cắt bỏ lá và

rễ con, rửa sạch và phơi khô

Sinh khương: Gừng tươi

-Trên thị trường thì phân biệt Gừng làm hai loại

Gừng xám có dạng cong như gập đầu gối lại, phân nhánh, màu xám ở bên ngoài, bên trong có màu vàng nhạt, bẻ ngang mắt Gừng thấy cấu tạo có nhiều hạt màu vàng, trắng dạng bột, mùi vị như long não, thơm, dễ chịu

Gừng trắng là loại đã cạo vỏ rồi đem phơi khô, thường người ta ngâm Gừng già vào nước một ngày rồi lấy ra, cạo vỏ hoặc tẩy trắng bằng calcium hypochlorite hoặc lưu huỳnh Việc tẩy Gừng còn có tác dụng tiêu diệt nấm

Gừng trâu: củ to, xơ ít, nhiều nạc, màu trắng, ít thơm, ít cay hơn Gừng

sẻ

2.1.3 Mô tả thực vật [10]

Gừng là loại cây thân thảo, thân có thể cao đến 1 m Thân rễ phồng thành củ Thân rễ (quen gọi là củ) không có hình dạng nhất định, phân nhánh trên một mặt phẳng, làm thành nhiều đốt, kích thước không đều, dài 3-7 cm, dày 0,5-1,5 cm, mặt ngoài màu trắng tro hay vàng nhạt, có vết nhăn dọc, trên các đốt có vết sẹo của các lá khô (vảy), vết bẻ màu trắng tro hoặc ngà vàng, lõi tròn rõ, mùi thơm, vị cay nóng Lá không cuống, mọc so le thành 2 dãy, hình ngọn giáo, thắt lại ở gốc, đầu nhọn dài 15-20 cm, rộng 2 cm, mặt trên màu lục sẫm bóng, mặt dưới nhạt, gân lá song song Bẹ nhẵn, có thể ôm vào nhau thành một thân giả Lưỡi nhỏ dạng màng, nhẵn, chia 2 thùy cạn

Hình 2.1 Đặc điểm hình thái củ Gừng

a Chiều cao thân thảo cây Gừng; b Thân rễ cây Gừng;

c Lát xắt thân rễ củ Gừng; d Lưỡi nhỏ phần bẹ của thân cỏ củ Gừng

2.1.4 Thành phần hóa học [11-14]

Gừng chứa 2-3% tinh dầu với thành phần chủ yếu là các hợp chất hydrocarbon sesquiterpenic: β-zingiberen (35%), aryl-curcumenen (17%), β-farnesen (10%) và một lượng nhỏ các hợp chất alcol monoterpenic như geraniol, linalol, borneol

Nhựa dầu chứa 20-25% tinh dầu và 20-30% các chất cay Thành phần chủ yếu của nhóm chất cay là zingeron, shogaol và gingerols, trong đó nhóm gingerols chiếm tỷ lệ cao nhất Ngoài ra, trong tinh dầu Gừng còn chứa α-camphen, β-phelandren, eucalyptol Cineol trong Gừng có tác dụng kích thích khi sử dụng tại chỗ và có tác dụng diệt khuẩn trên nhiều vi khuẩn

2.2 Hoạt chất 6-gingerol và dẫn xuất của nó

2.2.1 Khát quát

Gingerols, nhóm hợp chất gây ra vị cay nồng của củ Gừng đã được mô

tả từ hơn 100 năm trước, nhưng việc tách và xác định cấu trúc của chúng lần đầu tiên được báo cáo vào năm 1969 bởi Connell DW và cộng sự [15]

Cấu trúc chung của các gingerols là

1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-5-hydroxyalkan-3-ones, nhóm hydroxyl có cấu hình (S), các chuỗi bên có chiều

dài khác nhau tương ứng được xác định là 3-, 4-, 5-, 6-, 8- và 10-gingerol [16]

Trong đó, 6-gingerol (1) là thành phần có nhiều hoạt tính của Gừng

tươi, được tìm thấy như một loại dầu màu vàng hăng, nhưng cũng có thể tạo thành chất rắn kết tinh có nhiệt độ nóng chảy thấp, được biết đến với nhiều hoạt tính sinh học như tác dụng kháng khuẩn, hoạt động kháng viêm, chống khối u, kháng oxy hóa, ngăn ngừa ung thư và nhiều hoạt tính sinh học đáng quý khác [1-7, 15-16]

Hình 2.2 Công thức cấu trúc hoạt chất 6-gingerol

Tên IUPAC: (S)-5-Hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)decan-3-one

2.2.2 Sự chuyển hóa giữa 6-gingerol, 6-shogaol và zingerone

6-Shogaol (2) là một thành phần tạo nên vị cay nồng của Gừng tươi,

được tạo thành do phản ứng tách nước của 6-gingerol khi đun nóng hoặc sấy khô củ Gừng (Sơ đồ 2.1)

Sơ đồ 2.1 Sự chuyển hóa 6-gingerol thành 6-shogaol Zingerone, còn gọi là vanillylacetone (3), là một thành phần quan trọng

của các vị cay của Gừng Gừng tươi không chứa zingerone; Khi nấu chín

Gừng, 6-gingerol bị biến đổi thành zingerone (Sơ đồ 2.2)

Sơ đồ 2.2 Sự chuyển hóa 6-gingerol thành zingerone 2.2.3 Hoạt tính của 6-gingerol

2.2.3.1 Kháng khuẩn, kháng viêm

Trong một nghiên cứu trên chuột lang hồi tràng đã cho thấy các thành phần nhất định của Gừng (6-, 8- và 10-gingerol) ức chế sự chống serotonin - chức năng thụ thể Ngoài ra, các thành phần hoạt tính đã được chứng minh là ảnh hưởng đến nhu động dạ dày và có thể có tác dụng chống co thắt trên hệ tiêu hóa [17]

6-Gingerol có hoạt tính ức chế phù nề chân gây ra bởi carrageenin Từ

đó cho thấy khả năng giảm đau và kháng viêm của 6-gingerol

2.2.3.2 Hoạt tính kháng khối u

Tại Hội nghị thường niên lần thứ 97 của Hiệp hội Ung thư Mỹ công trình nghiên cứu của Tiến sĩ Rebecca Lui và các đồng nghiệp từ Đại học Michigan cho thấy nhóm chất gingerols, một nhóm hoạt chất có trong Gừng, giết chết tác nhân gây ung thư buồng trứng bằng cách gây ra cả hai quá trình apoptosisz (sự tự chết tế bào), và autophagocytosis (tự tiêu hóa)

Kết quả nghiên cứu của Lee, H và các cộng sự (2008) cho thấy hoạt chất 6-gingerol có khả năng ức chế sự di căn của tế bào ung thư vú MDA-MB-231 ở người [18]

Kết quả nghiên cứu của Park và các cộng sự (2006) cho thấy hoạt chất 6-gingerol có khả năng ức chế tế bào ung thư tuyến tụy [19]

Zick, MS (2008) đã công bố một nghiên cứu về dược động học và sự chuyển hóa của 6-gingerol, 8-gingerol, 10-gingerol và 6-shogaol trong cơ thể trên đối tượng là những người khỏe mạnh [20]

Năm 2011, Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Phương Dung đã công bố nghiên cứu về tác dụng chống nôn của cao chiết củ Gừng chứa 0,0216% 6-gingerol trên chuột nhắt trắng[21]

6-Gingerol đã được chứng minh để ức chế COX-2 biểu hiện bằng cách ngăn chặn sự kích hoạt của p38 MAP kinase và NF-κB trong phorbol ester được kích thích da chuột [22]

2.2.4 Dẫn xuất tổng hợp của 6-gingerol

Trong cuộc chiến chống lại những căn bệnh hiểm nghèo hiện nay, dựa trên hiểu biết về những hoạt tính quý của 6-gingerol, các nhà khoa học đã không ngừng nghiên cứu tổng hợp, thử nghiệm trên những dẫn xuất khác nhau của 6-gingerol

Nghiên cứu về hoạt động ức chế kênh chủ vận TRPV1 (có tác dụng

giảm đau) của Enrico Morera và cộng sự (2011) cho thấy nhiều dẫn xuất (4-7)

của 6-gingerol cho hoạt tính cao hơn 6-gingerol [23] (Hình 2.3)

Hình 2.3 Các dẫn xuất của 6-gingerol có hiệu quả đáp ứng ức chế TRPV1

Năm 2014, Ahmed S và cộng sự [5] đã tổng hợp hàng loạt dẫn xuất

6-gingerol và tiến hành thử nghiệm in vitro trên dòng tế bào ung thư MCF-7 từ

đó đưa ra mối tương quan giữa hoạt tính và cấu trúc các chất Nghiên cứu chỉ

ra rằng, chiều dài nhóm alkyl chuỗi bên của 6-gingerol (1) là tối ưu cho khả

năng chống ung thư, sự giảm chiều dài của chuỗi sẽ làm giảm đáng kể hoạt

tính này (dẫn xuất (8)) Methyl hóa nhóm phenol tạo (9) và isoprenyl hóa nhóm phenol tạo (10) cũng làm giảm hoạt tính so với 6-gingerol Khi ester hóa nhóm hydroxyl và nhóm phenol tạo (11) thì dẫn xuất vẫn có hoạt tính nhưng kém 6-gingerol Đáng chú ý là khi allyl hóa nhóm phenol tạo (12) thì hoạt tính

tăng lên đáng kể (cao hơn 6-gingerol) (Hình 2.4) Chính vì vậy, hướng đến benzyl hóa nhóm phenol có hy vọng làm tăng hoạt tính của 6-gingerol

Hình 2.4 Các dẫn xuất 6-gingerol trong thử nghiệm in vitro trên dòng tế bào

ung thư MCF-7

2.3 Phương pháp tách chiết các chất ra khỏi cây [24]

2.3.1 Dung môi để tách chiết hợp chất ra khỏi mẫu cây

Do cấu tạo của cây cỏ hoặc sinh khối thường là những chất liệu đại phân tử (polymer, ví dụ như cellulose có trong cây cỏ, nấm mốc, thành tế bào

vi sinh vật) tương đối trơ, không hòa tan trong dung môi hữu cơ Vì thế, việc khảo sát hợp chất thiên nhiên là chiết lấy và khảo sát các chất biến dưỡng thứ cấp có trọng lượng phân tử nhỏ

Thông thường, người ta muốn nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có tính

ái dầu có mức độ phân cực khác nhau, nhưng đôi khi cũng nghiên cứu các hợp chất có tính ái nước Điều này được thực hiện bằng cách chiết những hợp chất

có trong cây lần lượt bằng các dung môi có tính phân cực tăng dần hoặc chiết một lần lấy tất cả các loại hợp chất bằng cách sử dụng dung môi vạn năng methanol (có thể chiết hầu hết các loại hợp chất tự nhiên)

Nguyên tắc tổng quát là lựa chọn dung môi và quy trình phù hợp để chiết tách hợp chất ra khỏi mẫu cây, điều này tùy thuộc vào đặc tính của chất biến dưỡng thứ cấp có trong cây mà người khảo sát mong muốn cô lập Các hợp chất tự nhiên có cấu trúc và độ phân cực khác nhau nên chưa có một quy trình chiết tách đặc trưng Vì vậy trước khi tiến hành thực nghiệm phải thu thập đầy đủ các tài liệu tham khảo có liên quan trực tiếp đến cây mới có thể chọn được quy trình phù hợp

Muốn chiết hợp chất ra khỏi cây cỏ cần chọn dung môi phù hợp, sử dụng kỹ thuật chiết tách phù hợp bằng cách ngâm dầm, bằng thiết bị chiết soxhlet… Sau khi chiết, phần bã cây hay sinh khối còn lại được loại bỏ, dung

môi qua lọc được thu hồi ở nhiệt độ thấp khoảng 30-40ºC vì thực hiện ở nhiệt

độ cao có thể làm hư hại các hợp chất kém bền nhiệt

2.3.2 Lựa chọn dung môi để chiết tách

Chọn dung môi phải có tính trung tính, không độc, không quá dễ cháy, hòa tan được hợp chất cần khảo sát, sau khi chiết tách xong, dung môi đó có thể được loại bỏ dễ dàng Cần tránh các dung môi độc như benzene hoặc dễ cháy do có nhiệt độ sôi thấp như diethyl ether, tetrachloromethane… Trường hợp cần khảo sát đối với một số nhóm chất đặc biệt có thể sử dụng dung môi

có điều chỉnh pH (trong trường hợp chiết alkaloid, flavonoid…) hoặc có thể dùng các dung môi kém bay hơi (như trong chiết các tinh dầu) Khi sử dụng các dung môi dễ cháy cần phải thực hiện ở một nơi có điều kiện phòng chữa cháy tốt và cách ly với các phòng thí nghiệm khác

2.3.3 Một số điều cần biết khi sử dụng dung môi để chiết tách hợp chất

Các dung môi cần được chưng cất lại và tồn trữ trong những chai, lọ bằng thủy tinh do trong dung môi thường hay chứa một số tạp chất bẩn mà thường gặp nhất là chất làm dẻo hóa, chúng lẫn vào dung môi do dung môi thường được chứa trong các thùng làm bằng nhựa dẻo

Chloroform, dichloromethane có thể tạo phản ứng với các loại alkaloid như brucin, strychnin, ephedrine… để tạo thành các alkaloid dạng muối tứ cấp

và một vài hợp chất khác Tương tự, sự có mặt dù chỉ ở lượng vết của HCl có thể gây ra sự phân hủy, sự khử nước, sự đồng phân hóa cho vài loại hợp chất hữu cơ

Diethyl ether ít được sử dụng để chiết vì có nhiệt độ sôi thấp, dễ cháy, độc, có thể gây mê cho người sử dụng và có khuynh hướng tạo thành peroxide

dễ gây nổ Peroxide này rất hoạt động, có thể oxy hóa các hợp chất có mang nhiều nối đôi liên hợp (thí dụ như carotenoid)

Acetone có thể tạo ra dẫn xuất acetonide trong môi trường acid nếu hợp

chất cần thiết có chứa nhóm cis-1,2-diol

Quá trình chiết thực hiện trong môi trường acid hay base có thể thủy giải các hợp chất glycoside (môi trường acid sẽ cắt đứt nối glycoside làm mất

đi phần đường) hoặc cắt đứt nối ester (môi trường kiềm) hoặc tạo sự chuyển

vị

2.3.4 Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng

Hình 2.5 Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng bằng bình lóng

Kỹ thuật này còn được gọi là sự chiết bằng dung môi Cao alcol thô ban đầu (thí dụ bột cây được tận trích với methanol 80%, đuổi dung môi thu được cao alcol thô ban đầu) hoặc dung dịch ban đầu (thí dụ dung dịch sinh học) đều chứa hầu hết các hợp chất hữu cơ từ phân cực đến không phân cực vì thế rất khó cô lập riêng những hợp chất tinh khiết để thực hiện các khảo sát tiếp theo Người ta dùng kỹ thuật chiết lỏng-lỏng để phân chia cao alcol thô ban đầu hoặc dung dịch ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau

Nguyên tắc của sự chiết là dung môi không phân cực (thí dụ ether dầu hỏa) sẽ hòa tan tốt các hợp chất không phân cực (thí dụ các alcol béo, ester béo…), dung môi phân cực trung bình (thí dụ diethyl ether, dichloromethane…) hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình (các hợp chất có chứa nhóm chức ether –O–, aldehyde –CHO, ketone –CO–, ester –COO–…) và dung môi phân cực mạnh (ví dụ methanol, ethanol…) hòa tan tốt các chất có tính phân cực mạnh (các hợp chất có chứa nhóm chức –OH, –COOH…)

Việc chiết lỏng-lỏng được thực hiện bằng bình lóng, trong đó cao alcol thô ban đầu được hòa tan vào pha nước Sử dụng lần lượt các dung môi hữu

cơ, loại không hòa tan với nước để chiết ra khỏi pha nước các hợp chất có tính phân cực khác nhau (tùy vào độ phân cực của dung môi)

Tùy vào tỷ trọng so sánh giữa dung môi và nước mà pha hữu cơ nằm ở lớp trên hoặc ở dưới so với pha nước

Việc chiết được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực

đến dung môi phân cực thí dụ như: ether dầu hỏa hoặc n-hexane,

dichloromethane, ethyl acetate, butanol… Với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi, chiết đến khi không còn chất hòa tan vào dung môi thì đổi sang chiết với dung môi

có tính phân cực hơn Dung dịch của các lần chiết được gom chung lại, làm khan nước với các chất làm khan như Na2SO4, MgSO4, CaSO4… sau đó đuổi dung môi thu được cao chiết

Muốn kiểm tra xem các hợp chất nào đã được chiết vào pha hữu cơ cũng như các hợp chất nào còn lại ở trong pha nước và chiết bao nhiêu lần thì hoàn tất có thể sử dụng sắc ký lớp mỏng, trên bản mỏng cần so sánh đồng thời vết của pha nước và của pha hữu cơ Sự chiết bởi một dung môi cụ thể nào đó được gọi là hoàn tất khi lần chiết thứ n, trên bản mỏng không còn nhìn thấy vết của chất đó trong pha nước cũng như trong pha hữu cơ Cũng có thể kiểm tra bằng cách nhỏ một giọt dung dịch chiết lần thứ n trên một tấm kiếng sạch, sau khi đã bay hơi hết dung môi nếu không còn để lại vết gì trên mặt kiếng chứng tỏ đã chiết kiệt

Cần lưu ý sự chiết lỏng-lỏng được thực hiện ở nhiệt độ phòng, nếu gia tăng nhiệt độ cho dung môi thì khả năng hòa tan của dung môi sẽ tăng lên và nguyên tắc nêu trên sẽ có nhiều thay đổi

Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng có nhược điểm là do phải lắc bình lóng nhiều lần nên ở những lần chiết sau dung môi dễ tạo nhũ tương, gây khó khăn trong việc tách pha Khi dung môi trong bình lóng tạo nhũ tương có thể sử dụng một đũa thủy tinh dài đưa vào trong bình lóng, khuấy nhẹ dung dịch hoặc cọ xát nhẹ vào thành bình, chỗ mặt thoáng của dung dịch nhằm phá vỡ các bọt khí để dung dịch nhanh chóng phân thành hai lớp Cũng có thể phá bọt bằng cách ly tâm dung dịch

2.4 Sơ lược về dẫn xuất pyrimidine

2.4.1 Giới thiệu về pyrimidine

Pyrimidine (14) là hợp chất hữu cơ dị vòng thơm tương tự như pyridine (13) Pyrimidine là một trong ba loại diazine (hợp chất dị vòng thơm chứa sáu

nguyên tử, trong đó có hai nguyên tử nitơ), nó có các nguyên tử nitơ ở các vị

trí 1 và 3 trong vòng Các diazine khác là pyrazine (15) (hai nguyên tử nitơ ở

vị trí 1 và 4) và pyridazine (16) (hai nguyên tử nitơ ở vị trí 1 và 2) [25-26]

(Hình 2.6)

Hình 2.6 Pyridine và các dạng đồng phân khác nhau của họ diazine

So với pyridine, mật độ electron pi trong nhân pyrimidine giảm xuống còn đáng kể hơn khi có hai nguyên tử nitrogen trên vòng Do đó, phản ứng thế thân điện tử vào vòng thơm càng trở nên khó khăn hơn, trong khi thế thân hạch lại được ưu đãi bởi hiệu ứng này Cặp electron tự do trên nguyên tử nitrogen của pyrimidine cũng vì vậy mà giảm linh động hơn so với pyridine

điều này làm giảm đáng kể tính base của nó (giá trị pKa của pyrimidine là 1,23 còn của pyridine là 5,30) [27]

Họ pyrimidines là nhóm hợp chất dị vòng rất quan trọng về mặt sinh học, có ý nghĩa đặc biệt đối với sự sống và di truyền Trong các acid nucleic,

ba loại nucleobase là dẫn xuất pyrimidine bao gồm uracil (17), thymine (18)

2.4.2 Các nghiên cứu tổng hợp dẫn xuất pyrimidine

Mặc dù các dẫn xuất của pyrimidine như acid uric và alloxan đã được biết đến vào đầu thế kỷ 19, nhưng việc tổng hợp pyrimidine trong phòng thí nghiệm đã không được thực hiện cho đến năm 1879, khi Grimaux báo cáo đã

tổng hợp thành công acid barbituric (20) từ urea (22) và acid malonic (23)

trong sự hiện diện của xúc tác phosphorus oxychloride [29] (Sơ đồ 2.3)

Sơ đồ 2.3 Phản ứng tổng hợp acid barbituric từ urea và acid malonic

Pyrimidine được nghiên cứu sâu rộng hơn từ năm 1884 bởi Pinner, người đã tổng hợp thành công hàng loạt dẫn xuất bằng cách ngưng tụ ethyl

acetoacetate (24) với các amidine (25) trong môi trường kiềm mạnh

(Sơ đồ 2.4) Pinner cũng là người đầu tiên đề xuất tên "pyrimidin" vào năm

1885 [30-31]

Sơ đồ 2.4 Phản ứng tổng hợp các dẫn xuất pyrimidine từ ethyl acetoacetate và

các amidine Năm 1891, nhà hóa học người Ý Pietro Biginelli đã tổng hợp thành công ethyl 6-methyl-2-oxo-4-phenyl-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-5-

carboxylate (27) từ urea (22), ethyl acetoacetate (24) và benzaldehyde (26) với

xúc tác acid trong dung môi ethanol [32-33] (Sơ đồ 2.5) Về sau, tên của phản ứng này được đặt theo tên của ông

Sơ đồ 2.5 Phản ứng tổng hợp ethyl

6-methyl-2-oxo-4-phenyl-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-5-carboxylate Năm 1963, H Bredereck và cộng sự đã tổng hợp thành công

4-methylpyrimidine (30) bằng các tác nhân đơn giản như 2-one (28) và formamide (29), với sự xúc tác của acid Bronsted (ammonium

4,4-dimethoxybutan-chloride) trong nước, phản ứng cho hiệu suất khá cao (54-63%) [34] (Sơ đồ 2.6)

Sơ đồ 2.6 Phản ứng tổng hợp 4-methylpyrimidine

Trong một báo cáo của Norio Fujiwara và cộng sự (2000) về tổng hợp

và đánh giá hoạt tính sinh học của các dẫn xuất piperidylpyrimidine, nhóm nghiên cứu đã dùng nhiều tác nhân khác nhau để thu được các dẫn xuất mong muốn, trong đó có sử dụng tác nhân guanidine hydrochloride để tạo khung

pyrimidine chứa nhóm thế amino tự do (32) từ chất nền beta-diketone (31)

trong môi trường kiềm yếu [35] (Sơ đồ 2.7)

Sơ đồ 2.7 Phản ứng tổng hợp dẫn xuất 2-aminopyrimidine

Năm 2006, trong một nghiên cứu tổng hợp toàn phần, Mohammad

Movassaghi và Matthew D Hill đã sử dụng các N-vinyl và N-aryl amide (33)

phản ứng với carbonitrile (34) nhờ sự hoạt hóa thân điện tử của

2-chloropyridine (2-ClPyr) và anhydride trifluoromethanesulfonic (Tf2O) tạothành các pyrimidine có 4 nhóm thế (35), phản ứng cho hiệu suất cao

(61-94%) [36] (Sơ đồ 2.8)

Sơ đồ 2.8 Phản ứng tổng hợp dẫn xuất pyrimidine có 4 nhóm thế

2.4.3 Hoạt tính sinh học của dẫn xuất pyrimidine

Sự hiện diện của nhân pyrimidine trong thymine, cytosine và uracil, vốn là những cấu trúc cần thiết để xây dựng nên các acid nucleic DNA và RNA, đó là một trong những lý do có thể sử dụng rộng rãi dẫn xuất pyrimidine trong điều trị Các pyrimidine được chứng minh là cho phổ rộng các hoạt tính sinh học như kháng DNA và RNA không đặc hiệu, kháng virus sốt rét, lợi tiểu, kháng HIV, chống mệt mỏi, bệnh về tim mạch [37] Ngoài ra, các dẫn xuất pyrimidine còn cho thấy khả năng kháng khuẩn [38-39], kháng nấm [40-42], kháng viêm [43-44], giảm đau [45], hạ huyết áp [46-47], hạ sốt [48], chống dị ứng [49]… Trong đó, các dẫn xuất chứa nhóm amino tự do trên nhân pyrimidine cho hoạt tính kháng khuẩn rất tốt, nhiều dẫn xuất đã qua thử

nghiệm in vivo và trở thành thuốc thương mại Brodiprim (36) được chứng

minh là cho hiệu quả kháng khuẩn rất tốt [50], iclaprim (37) là chất ức chế chọn lọc dihydrofolate [51], trimethoprim (38) và pyrimethamine (39) là một

loại thuốc kháng khuẩn dựa trên ức chế chọn lọc vi khuẩn DHFR [52] (Hình 2.8)

Hình 2.8 Thuốc kháng sinh chứa nhóm amino tự do trên nhân pyrimidine

2.5 Một số phản ứng hóa học sử dụng trong nghiên cứu

Sơ đồ 2.9 Cơ chế phản ứng Williamson

Các phenol cũng có phản ứng tương tự các alcol, tuy nhiên anion

phenolate có thể phản ứng với alkyl halide cho hai sản phẩm O-alkylation (40) hoặc C-alkylation (41) Khả năng tạo ra (40) cao hơn xác suất hình thành (41) Tuy nhiên, trong những điều kiện nhất định, cũng có thể tạo thành (41) [55]

Cơ chế của phản ứng có thể được giải thích như sau (Sơ đồ 2.10)

Sơ đồ 2.10 Cơ chế phản ứng tạo thành phẩm O-alkylation và C-alkylation

Việc sử dụng các dung môi phân cực có proton dẫn đến sự hình thành

sản phẩm (41) vì dung môi có khả năng liên kết hydro với nguyên oxy của

phenolate và do đó cản trở oxy tấn công vào alkyl halide Vì vậy có thể lựa dung môi phản ứng thích hợp để thu được sản phẩm mong muốn, sử dụng

dung môi không proton để tạo (40) như DMF, DMSO, acetone…, sử dụng dung môi có proton để tạo (41) như nước, trifluoro ethanol (TFE)… [55].

2.5.2 Phản ứng oxy hóa alcol bằng pyridinium chlorochromate [56]

Pyridinium chlorochromate (PCC) có dạng tinh thể màu vàng cam, hút

ẩm rất ít và không phân hủy nên có thể lưu trữ trong thời gian dài PCC dùng

để oxy hóa những alcol bậc 1 hoặc bậc 2 thành các aldehyde hoặc ketone tương ứng Dung môi thường được sử dụng là CH2Cl2, THF, CH3CN,… Silica gel, celite hoặc florisil cũng được cho vào hỗn hợp phản ứng để giữ muối chromium, giúp dễ dàng khi lọc

Phản ứng oxy hóa alcol bởi PCC diễn ra thông qua giai đoạn trung gian

là tạo ester chromate một cách nhanh chóng và sau đó xảy ra quá trình đứt liên kết giữa nguyên tử oxy và chrome, đồng thời tách hydro của carbon mang nhóm –OH để tạo thành nhóm carbonyl (Sơ đồ 2.11)

Sơ đồ 2.11 Cơ chế của phản ứng oxy hóa alcol bậc 2 bằng PCC

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương pháp nghiên cứu

 Trích ly 6-gingerol thô từ củ Gừng bằng phương pháp ngâm dầm cổ điển trong dung môi ethanol

 Hiệu suất sản phẩm thu được được tính theo công thức:

Trong đó:

H%: là hiệu suất của sản phẩm (%)

m tt: là khối lượng sản phẩm thu được (g)

m lt: là khối lượng mẫu chất (g)

 Các phản ứng bán tổng hợp được thực hiện bằng phương pháp khuấy từ kết hợp đun hoàn lưu cổ điển

 Tiến trình phản ứng được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) với thuốc thử hiện hình là dung dịch vanilin kết hợp dùng đèn soi UV

 Sản phẩm được tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột silica gel

 Cấu trúc sản phẩm được xác định bằng phương pháp phổ nghiệm hiện đại: MS, 1

 Guanidine hydrochloride (Merck)

 4-Nitrobenzyl bromide (Merck)

 Silica gel (Ấn Độ)

 Ethanol 96º (Việt Nam)

100

%

lt

tt

m m

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ

 Máy cô quay HEIDOLPH

 Máy khuấy từ gia nhiệt IKA

Ethyl acetate: Chưng cất lại ở nhiệt độ sôi 77,1ºC

n-Hexane: Chưng cất lấy phân đoạn ở 68,0ºC

Ethanol: Chưng cất lấy phân đoạn ở 78,4ºC

3.3 Thực nghiệm

3.3.1 Xử lý nguyên liệu

Nguyên liệu được sử dụng là củ Gừng (Zingiber officinale Roscoe)

khoảng từ 10 – 12 tháng tuổi được thu mua tại Bạc Liêu Toàn bộ củ Gừng sau khi thu mua về được rửa sạch bùn đất, bụi bẩn và loại bỏ phần hư giập (Hình 3.1) Sau đó, toàn bộ nguyên liệu được xắt lát mỏng và làm khô trong bóng râm đến khi độ ẩm còn khoảng từ 12% - 15% (xác định bằng phương pháp sấy khô) sau đó nguyên liệu được nghiền thành bột (Hình 3.2)

Hình 3.1 Gừng tươi được làm sạch Hình 3.2 Bột Gừng nguyên liệu

nguyên liệu, thu được cao tổng dạng sệt Cao tổng được hòa tan với nước cất

theo tỉ lệ cao:nước (1:1) (v/v), sau đó chiết lần lượt với n-hexane và ethyl

acetate Dịch chiết từng phân đoạn sau đó được cô đuổi dung môi để thu được các cao tương ứng Quy trình điều chế các loại cao được tóm tắt như

-Hòa với nước cất

-Chiết kiệt với n-hexane

-Cô đuổi dung môi

3.3.2 Tách chiết sản phẩm 6-gingerol (G1) tinh khiết

Sắc ký cột phân đoạn cao Ea sử dụng hệ dung môi giải ly Hex:Ea = 3:1,6 thu được 6-gingerol tinh khiết

Phân đoạn cao Hex phần lớn chứa các hợp chất béo Tuy nhiên qua khảo sát bằng sắc ký lớp mỏng nhận thấy trong phân đoạn cao này vẫn có hiện diện 6-gingerol Vì vậy quá trình sắc ký được tiến hành tiếp tục đối với phân đoạn cao Hex sử dụng hệ dung môi giải ly Hex:Ea = 2:1 thu được 6-gingerol tinh khiết

Tổng lượng 6-gingerol tinh sạch thu được sau các lần tách cột là

4045 mg (hiệu suất tách chất đạt 1,01% so với bột nguyên liệu ban đầu) 6-gingerol tinh khiết được bảo quản trong khí quyển nitrogen, nhiệt độ -5ºC và được sử dụng làm tác chất ban đầu của chuỗi bán tổng hợp

31,7 (>CH2); 29,3 (>CH2); 25,1 (>CH2); 22,6 (>CH2), 14,0 (-CH3)

3.3.3 Tổng hợp 5-hydroxy-1-(3-methoxy-4-((4-nitrobenzyl)oxy)phenyl) decan-3-one (G2)

Cho 25 mL acetone vào bình cầu 100 mL có chứa sẵn hỗn hợp gồm

6-gingerol (G1) (350 mg, 1,19 mmol) và K2CO3 (164 mg, 1,19 mmol) Đậy kín bình cầu bằng septum, tạo khí quyển nitrogen Hỗn hợp được khuấy với tốc độ 700 vòng/phút trong 5 phút Dùng syring thêm từ từ vào bình cầu dung dịch của 4-nitrobenzyl bromide (514 mg, 2,38 mmol) đã được hòa tan trong 15

mL acetone Phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ

Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng Sau phản ứng, hỗn hợp được

thô bằng sắc ký cột với hệ dung môi giải ly Hex:Ea = 7:3, thu được sản phẩm

có dạng tinh thể màu vàng (452,9 mg – 88,72%; Rf = 0,34; Hex:Ea = 1:1)

Dữ liệu phổ sản phẩm G2

Phổ 1

H-NMR (500 MHz, DMSO,  ppm): 8,25 (dd, J = 7,0 Hz, 2H,

=CH-); 7,69 (d, J = 8,5 Hz, 2H, =CH-); 6,90 (d, J = 8,5 Hz, 1H, =CH-); 6,86 (d, J = 2,0 Hz, 1H, =CH-); 6,67(dd, J = 2,0 Hz, J = 8,0 Hz, 1H, =CH-); 5,2 (s, 2H, -OCH2-); 4,52 (d, J = 5,5 Hz, 1H, -OH); 3,88 – 3,80 (m, 1H,

>HCOH); 3,78 (s, 3H, -OCH3); 2,76 – 2,74 (m, 2H, >CH2); 2,71 – 2,69 (m,

2H, >CH 2); 2,45 – 2,42 (m, 2H, >CH2); 0,85 (t, J = 7,0 Hz, 3H, -CH3)

3.3.4 Tổng hợp dione (G3)

1-(3-methoxy-4-((4-nitrobenzyl)oxy)phenyl)decane-3,5-Trộn đều hỗn hợp gồm PCC (1293 mg, 6 mmol) và celite (1681 mg (tỉ

lệ khối lượng 1:1,3 với PCC)) trong bình cầu 200 mL, khí quyển nitrogen Dùng syring thêm 20 mL CH2Cl2 vào bình cầu, khuấy đều với vận tốc 700

vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ 0ºC Tiếp tục dùng syring thêm 10 mL

CH2Cl2 đã hòa tan hợp chất G2 (429 mg, 1 mmol) vào bình cầu Giữ nhiệt độ

và tốc độ khuấy như trên trong 5 phút nữa Sau đó, hỗn hợp phản ứng được đưa về thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 4 giờ tiếp theo

Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng Sau phản ứng thêm một ít tinh thể Na2S2O3, khuấy trong 5 phút Cho 120 mL n-hexane vào hỗn hợp,

khuấy đều trong 3 phút, sau đó ngưng khuấy, để yên cho phần rắn lắng xuống rồi dùng pipet hút lấy dịch hữu cơ, dịch này được lọc nhanh qua cột celite để loại hoàn toàn PCC Tiếp tục cho vào hỗn hợp rắn còn lại 20 mL dung môi (Hex:CH2Cl2 = 4:1) và lọc qua cột celite, tiến hành tương tự cho đến khi dịch lọc không còn sản phẩm

Làm khan dịch lọc bằng Na2SO4, lọc và cô đuổi dung môi thu được sản phẩm thô Tinh chế sản phẩm thô bằng sắc ký cột với hệ giải ly Hex:Ea = 5:1, thu được sản phẩm là chất rắn kết tinh màu trắng (89,67 mg – 21%; Rf = 0,6;

Hex:Ea = 1:1)

Dữ liệu phổ sản phẩm G3

Phổ MS (ESI) m/z 426,0 [M-H]

-; m/z 428,0 [M+H]+ Phổ 1

H-NMR (500 MHz, DMSO, δ ppm): 8,25(d, J = 8,5 Hz, 2H,

=CH-); 7,69 (d, J = 8,5 Hz, 2H, =CH-); 6,91 – 6,86 (m, 2H, =CH-); 6,71 – 6,67 (m, 1H, =CH-); 5,70 (s, 1H, -COH=CH) (dạng enol); 5,21 (s, 2H, -

OCH2-); 3,78 (s, 3H, -OCH3); 3,67 (s, 2H, >CH2) (dạng ketone); 2,79 (t, J = 7,0 Hz, 2H, >CH 2); 2,71 (t, J = 7,0 Hz, 2H, >CH2); 2,60 (t, J = 8,0 Hz, 2H,

>CH 2); 2,43 (t, J = 7,5 Hz, 2H, >CH2); 2,26 (t, J = 7,5 Hz, 2H, >CH2);

42,7 (>CH2); 39,2 (>CH2); 37,2 (>CH2); 30,7 (>CH2); 30,6 (>CH2);

30,3 (>CH2); 28,3 (>CH2); 24,8 (>CH2); 22,4 (>CH2); 21,8 (>CH2);

13,7 (-CH3)

3.3.5 Tổng hợp pentylpyrimidin-2-amine (G4)

4-(3-methoxy-4-((4-nitrobenzyl)oxy)phenethyl)-6-Thêm 3 mL pyridine vào bình cầu 10 mL có chứa sẵn hỗn hợp gồm

(G3) (26 mg, 0,06 mmol), K2CO3 (17 mg, 0,18 mmol), guanidine hydrochloride (11 mg, 0,12 mmol) Hỗn hợp phản ứng được đun hoàn lưu ở 110ºC, tạo khí quyển nitrogen, khuấy với tốc độ 600 vòng/phút trong thời gian

4 giờ

Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng Sau phản ứng, hỗn hợp được

cô quay đuổi dung môi, sau đó thêm dung dịch NH4Cl bão hòa vào hỗn hợp để trung hòa base dư và chiết với Ea (310 mL), lớp hữu cơ được rửa lần lượt với nước cất (310 mL) đến khi dịch chiết trung tính rồi rửa lại với dung dịch NaCl bão hòa (310 mL), làm khan nước bằng Na2SO4 Tinh chế sản phẩm thô bằng sắc ký cột với hệ dung môi giải ly Hex:Ea = 1:1, thu được sản phẩm

có dạng tinh thể màu trắng (11 mg – 40,15%; Rf = 0,15; Hex:Ea = 1:1)

Dữ liệu phổ sản phẩm G4

Phổ MS (ESI) m/z 449,0 [M-H]-; 451,1 [M+H]+

Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO, δ ppm): 8,25 (d, J = 6,5 Hz, 2H,

=CH-); 7,69 (d, J = 9,0 Hz, 2H, =CH-); 6,89 (d, J = 8,0 Hz, 1H, =CH-); 6,85 (d, J = 2,0 Hz, 1H, =CH-); 6,69 (dd, J = 2,0 Hz, J = 6,0 Hz, 1H, =CH-);

112,7 (=CH-); 107,7 (=CH-); 69,0 (-OCH2-); 55,5 (-OCH3); 36,8 (>CH2);

33,5 (>CH2); 30,9 (>CH2); 27,8 (>CH2); 21,8 (>CH2); 13,8 (-CH3)