Đánh giá hàm lượng lưu huỳnh tồn dư, hàm lượng saponin, đường tự do,và độc tính cấp của các mẫu dược liệu

Ngưu tất là một vị thuốc được dùng khá phổ biến trong Y học cổ truyền với nhu cầu ngày càng tăng, được nhập trồng vào nước ta từ những năm 1960. Hiện nay đ• thích hợp với điều kiện nước ta và phát triển tốt, được trồng ở nhiều nơi nhất là đồng bằng Bắc bộ như: x• Tân Quang huyện Văn Lâm tỉnh Hưng Yên, thôn Thiết Trụ, huyện Khoái Châu tỉnh Hưng Yên, x• Ninh Hiệp huyện Gia Lâm, trung tâm nghiên cứu cây trồng và chế biến thuốc Hà Nội và một số nơi khác. Khi thu hoạch người ta thường sơ chế bằng phương pháp xông sinh sau đó đem bán ra thị trường. Vậy vấn đề đặt ra là: tỉ lệ lưu huỳnh dùng để xông là bao nhiêu, xông sinh xong cần sấy ở nhiệt độ bao nhiêu , bảo quản bao lâu mới được sử dụng để đảm bảo không độc hại đến sức khoẻ con người, đảm bảo được chất lượng của thuốc đạt được tiêu chuẩn dược điển Viêt Nam và khu vực. Vì vậy chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu sự ảnh hưởng của quá trình xông sinh đến chất lượng dược liệu ngưu tất. Mục đích : đánh giá hàm lượng lưu huỳnh còn tồn dư, hàm lượng saponin toàn phần, hàm lượng đường và độc tính cấp của dược liệu được sơ chế với các phương pháp xông sinh khác nhau.Trên cơ sở đó có thể đề xuất phương pháp xông sinh thích hợp cho dược liệu chất lượng tốt và an toàn cho người sử dụng. Để đạt được mục đích trên, đề tài được tiến hành nghiên cứu với một số nội dung sau: -Xông sinh ngưu tất bằng các phương pháp khác nhau: Về liều lượng sinh, thời gian xông, nhiệt độ sấy. -Đánh giá hàm lượng lưu huỳnh tồn dư, hàm lượng saponin, đường tự do,và độc tính cấp của các mẫu dược liệu.

Đặt Vấn Đề Ngu tất là một vị thuốc đợc dùng khá phổ biến trong Y học cổ truyền với nhu cầu ngày càng tăng, đợc nhập trồng vào nớc ta từ những năm 1960. Hiện nay đã thích hợp với điều kiện nớc ta và phát triển tốt, đợc trồng ở nhiều nơi nhất là đồng bằng Bắc bộ nh: xã Tân Quang huyện Văn Lâm tỉnh Hng Yên, thôn Thiết Trụ, huyện Khoái Châu tỉnh Hng Yên, xã Ninh Hiệp huyện Gia Lâm, trung tâm nghiên cứu cây trồng và chế biến thuốc Hà Nội và một số nơi khác. Khi thu hoạch ngời ta thờng sơ chế bằng phơng pháp xông sinh sau đó đem bán ra thị trờng. Vậy vấn đề đặt ra là: tỉ lệ lu huỳnh dùng để xông là bao nhiêu, xông sinh xong cần sấy ở nhiệt độ bao nhiêu , bảo quản bao lâu mới đợc sử dụng để đảm bảo không độc hại đến sức khoẻ con ngời, đảm bảo đợc chất lợng của thuốc đạt đợc tiêu chuẩn dợc điển Viêt Nam và khu vực. Vì vậy chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu sự ảnh hởng của quá trình xông sinh đến chất lợng dợc liệu ngu tất. Mục đích : đánh giá hàm lợng lu huỳnh còn tồn d, hàm lợng saponin toàn phần, hàm lợng đờng và độc tính cấp của dợc liệu đợc sơ chế với các phơng pháp xông sinh khác nhau.Trên cơ sở đó có thể đề xuất phơng pháp xông sinh thích hợp cho dợc liệu chất lợng tốt và an toàn cho ngời sử dụng. Để đạt đợc mục đích trên, đề tài đợc tiến hành nghiên cứu với một số nội dung sau: -Xông sinh ngu tất bằng các phơng pháp khác nhau: Về liều lợng sinh, thời gian xông, nhiệt độ sấy. -Đánh giá hàm lợng lu huỳnh tồn d, hàm lợng saponin, đờng tự do,và độc tính cấp của các mẫu dợc liệu. 1 Phần I: Tổng quan 1-Tổng quan về ngu tất 1.1- Đặc điểm thực vật, phân bố và thu hái Vị thuốc Ngu tất là rễ phơi hay sấy khô của cây Ngu tất: Achyranthes bidentata Blume họ rau Dền Amaranthaceae. Cây thuộc thảo cao khoảng 1m. Thân mảnh, lá mọc đối, hình trứng, đầu nhọn, mép lá nguyên dài 5-12 cm. Cụm hoa là bông ở đầu cành hay kẽ lá. Hoa mọc hớng lên nhng khi biến thành quả sẽ mọc quặp xuống. Quả nang, lá bắc còn lại và nhọn thành gai cho nên vớng phải có thể mắc vào quần áo. Cây mọc ở Trung quốc, Việt Nam và các nớc Đông Nam á. Trồng bằng hạt, ở đồng bằng thì trồng vào tháng 9-10 thu hoạch vào tháng 2-3. Vùng miền núi trồng vào tháng 2-3 thu hoạch vào tháng 9-10. Muốn lấy giống thì cây sau khi thu hoạch, cắt bớt rễ, cắt bớt thân và trồng lại khoảng 4 tháng nữa mới lấy hạt [2]. Năng suất hiện nay vào khoảng 1,2 tấn một hecta. 1.2- Thành phần hoá học Rễ có chứa các saponin, khi thuỷ phân cho các sapogenin là acid oleanolic., ngoài ra còn có ecdysteron và inokosteron, glucose, galactose, rhamnoza. Muối kali [2,8], và một số thành phần khác nh: Betain, polysaccharide, emodin, physcion[ 15] - acid oleanolic HO COOH - Ecdysteron 2 H H O H O O H O H C H 3 O H O O H - Inokosteron H HO HO OH OH O OH H CH 2 OH 1.3- Tác dụng dợc lý Làm giảm sức co bóp của tim ếch [8 ] Giãn mạch hạ huyết áp, ức chế nhẹ tim ếch cô lập [2] Tăng co bóp tử cung [2,6] Tác dụng phá huyết và làm vón albumin [2,8] Tác dụng hạ cholesterol trong máu và hạ huyết áp [2 ] Ecdysteron và Inokosteron có tác dụng chống viêm,kháng khuẩn [8] Lợi tiểu, hạ đờng huyết, cải thiện chức năng gan [9]. Thúc đẩy quá trình tổng hợp protein[9] Kích thích miễn dịch [16] 3 Chống ung th [17, 18] 1.4- Sơ chế và bào chế Sơ chế: Dợc liệu sau khi thu hoạch về chặt bỏ phần thân, rũ sạch đất, phơi nắng 1-2 ngày, rửa sạch bằng nớc, để ráo nớc, xếp vào xông sinh với lợng sinh xông và thời gian xông theo kinh nghiệm từng địa phơng.[8, 10] Chế biến cổ truyền [10] Khi sử dụng làm thuốc ngời ta phải qua khâu chế biến bào chế, có nhiều phơng pháp chế biến khác nhau, tuỳ theo các mục đích điều trị chứng bệnh khác nhau mà ngời thầy thuốc chọn phơng pháp chế biến thích hợp. - Ngu tất thái dùng sống Ngu tất đợc rửa sạch, làm mềm, thái phiến vát dày 1-3mm (nếu rễ to); cắt đoạn 3-5mm (nếu rễ nhỏ), phơi hoặc sấy khô để dùng. [10] - Ngu tất sao cám Ngu tất rửa sạch, thái phiến, để ráo nớc. Sao cám nóng già, bốc khói trắng, cho ngu tất phiến vào sao đều đến khi có màu vàng. Lấy ra rây bỏ cám. - Ngu tất trích rợu Ngu tất 10 kg Ruợu 2 kg Ngu tất phiến sao nóng, phun rợu vào sao đến khô. Hoặc tẩm rợu vào ngu tất, ủ 30 phút- 1 giờ cho ngấm rợu; sau sao tới khô. - Ngu tất thán Đem ngu tất sao đến khi phía ngoài bị đen hoàn toàn, bên trong vàng đậm; có thể trích rợu sao đen nh trên. - Ngu tất sao đen Lấy ngu tất phiến, dùng nhỏ lửa sao cho đến khi xuất hiện các chấm đen. - Ngu tất trích muối 4 Ngu tất phiến 10 kg Muối 0.2 kg Muối hoà thành dung dịch đủ để tẩm vào ngu tất đã thái phiến ; ủ 30 phút , sao khô. 1.5- Công năng chủ trị [4, 8, 9, 10] - Hoạt huyết thông kinh hoạt lạc: dùng trong các trờng hợp kinh nguyệt bế, kinh nguyệt không đều. - Th cân, mạnh gân cốt, bổ can thận dùng cho các bệnh đau xơng khớp, đau xơng sống, đặc biệt đối với khớp của chân; sinh lý yếu, tiểu không tự chủ đ- ợc, làm giảm bạc tóc. - Chỉ huyết: thờng dùng trong các trờng hợp hoả độc bốc lên gây nôn ra máu, chảy máu cam. - Lợi niệu, trừ sỏi:dùng trong các trờng hợp tiểu tiện đau buốt, tiểu tiện ra sỏi, đục. -Giáng áp, giải độc chống viêm: dùng phòng bệnh bạch hầu -Làm tá dợc dẫn huyết, hoả đi xuống. 2- Diêm sinh 2.1- Nguồn gốc. Diêm sinh còn gọi là sinh, diêm vàng, hoàng nha, lu hoàng, thạch lu hoàng, oải lu hoàng, tên khoa học là sulfur. Là một nguyên tố có sẵn trong thiên nhiên hay do chế từ những hợp chất có lu huỳnh trong thiên nhiên. Lu huỳnh có thể tồn tại dới dạng tự do, hay sunphua nh pyrit, sunphua kẽm, hoặc sunphua các kim loại khác, sunphua hydro[6]. Tuỳ theo nguồn gốc và cách chế biến khác nhau, lu hoàng có khi là bột màu vàng, có khi là những cục to không đều màu vàng tơi, hơi có mùi đặc biệt, ít tan trong nớc, trong rợu và ete, tan nhiều hơn trong dầu. Khi đốt lên cháy với ánh lửa xanh và toả ra mùi khét khó thở. [8] 2.2- Thành phần hoá học 5 Thành phần chủ yếu của diêm sinh là chất sulfur nguyên chất, tuỳ theo nguồn gốc và cách chế tạo, có thể có những tạp chất nh: đất, vôi, asen, sắt . [8]. 3.3- Công dụng và liều dùng [8] Diêm sinh đợc dùng trong cả đông và tây y.Theo tài liệu cổ, diêm sinh có vị chua, tính ôn, có độc, vào hai kinh tâm và thận. Có tác dụng bổ hoả, tráng d- ơng, bổ mệnh môn chân hoả, lu lợi đại trờng, sát trùng. Dùng trong những trờng hợp liệt dơng, lỵ lâu ngày, ngời già yếu, h hàn mà bí đại tiện, phong thấp. Dùng trong còn có tác dụng sát trùng, chữa mẩn ngứa, mụn nhọt. Ngày dùng 2-3g dới dạng thuốc bột hay thuốc viên. 6 Phần II:Thực nghiệm và kết quả 1- Nguyên liệu, phơng tiện và phơng pháp nghiên cứu 1.1- Nguyên liệu, phơng tiện. Nguyên liệu - Rễ ngu tất tơi thu hoạch ở trung tâm nghiên cứu cây trồng và chế biến cây thuốc Hà Nội. - Diêm sinh lấy mẫu tại một số nơi dùng để chế biến thuốc. . Xã Ninh Hiệp, huyện Gia Lâm Hà Nội(Ký hiệu mẫu:S1) .Thôn Nghĩa Trai, xã Tân Quang huyện Văn Lâm(Ký hiệu mẫu:S2) .Thôn Thiết Trụ, huyện Khoái Châu tỉnh Hng Yên(Ký hiệu mẫu:S3) .Trung tâm nghiên cứu cây trồng và chế biến thuốc Hà Nội (Ký hiệu mẫu:S4) Hoá chất,thuốc thử Cồn tuyệt đối, acid sulphuric 72%, dd KOH/cồn 0.5N, dd acid HCl 0.5N,ortho.Toluidin, Thioure, chỉ thị Methyl da cam, .đạt tiêu chuẩn do viện Dợc liệu cung cấp. Động vật thí nghiệm Chuột nhắt trắng khoẻ mạnh,có khối lợng 20-22g do đủ tiêu chuẩnthí nghiệm mua tại Hà Tây. Máy móc và trang thiết bị - Máy đo độ ẩm Precisa MA300 Thuỵ Sĩ. - Máy quang phổ UV-VIS Cary 1E cua hãng Varian(Mỹ) - Máy đo quang phổ tử ngoại (máy ASIMCO của Anh) - Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử( máy AAS-Shimadza của Nhật) 1.2- Phơng pháp thực nghiệm 1.2.1- Xông sinh ngu tất 7 1.2.1.1- Xông sinh ngu tất với lợng sinh khác nhau Các mẫu ngu tất cùng khối lợng đợc xông sinh với những lợng sinh khác nhau, trong cùng một thời gian một ngày một đêm.Với khối lợng sinh nh sau: 0,5kg S/tạ dợc liệu; 1kg S/tạ dợc liệu; 1.5kg S/tạ dợc liệu; 3kg S/tạ dợc liệu. Sấy ở 60C đạt độ thuỷ phần <15%. 1.2.1.2- Xông sinh ngu tất với thời gian khác nhau Xông sinh các mẫu có khối lợng bằng nhau với cùng lợng sinh 1.5kg S/tạ dợc liệu nhng thời gian khác nhau, xông 4h, 12h, 24h. Sấy khô ở 60C đạt độ thuỷ phần < 15%. 1.2.1.3- Sấy ở các nhiệt độ khác nhau Sấy ở nhiệt độ khác nhau 60C, 70C, 80C, 100C đến đạt độ thuỷ phần < 15%. Sau khi chế biến tiến hành kiểm tra chất lợng đồng thời đóng túi bảo quản. 1.2.2- Định lợng một số thành phần trong ngu tất sau khi xông 1.2.2.1- Định lợng saponin (TCCS VDL) Thực hiện tại Khoa hoá phân tích-Viện dợc liệu. Theo phơng pháp đo quang ở bớc sóng = 538, với chất chuẩn là acid oleanolic và thuốc thử tạo màu là cồn Vanilin trong H2SO4 đặc. Hàm lợng Saponin (tính theo acid oleanolic) đợc tính bằng công thức: X (%) = )100( 10000 BPtDc PcDt ìì ìì Trong đó: Dt: Mật độ quang ống thử Dc: Mật độ quang ống chuẩn Pt: Lợng dợc liệu (g) Pc: Lợng acid oleanoic(g) B: Độ ẩm của dợc liệu 1.2.2.2- Định lợng đờng tự do (TCCS VDL) Thực hiện tại tại Khoa hoá phân tích-Viện dợc liệu. 8 Theo phơng pháp đo quang ở bớc sóng =630nm , với chất chuẩn là glucoza 0.1%, thuốc thử là O.Toluidin và Thioure. Hàm lợng đờng đợc tính theo công thức: X (%) = )100( 1000 BPDc Dt ìì ì Trong đó: X%: Hàm lợng đờng tự do tính theo Glucoza Dt: Mật độ quang ống thử Dc: Mật độ quang ống chuẩn P: Lợng dợc liệu(gam) B: Độ ẩm của dợc liệu(%) 1.2.2.3- Định lợng lu huỳnh trong ngu tất sau khi xông sinh và trong dịch chiết nớc và cồn Thực hiện tại phòng phân tích môi trờng- Viện công nghệ môi trờng - Định lợng theo phơng pháp cân Nguyên tắc: Mẫu đợc nghiền nhỏ, vô vơ hoá và kiềm chảy với Na2CO3. Hỗn hợp nóng chảy đợc lấy bằng nớc cất nóng. Acid hoá bằng HCl và dùng để định lu huỳnh dới dạng BaSO4 bằng phơng pháp trọng lợng. 1.2.3- Thử độc tính cấp của lu huỳnh và ngu tất sau khi xông sinh Thực hiện tại bộ môn phân tích - Trờng đai học Dợc Hà Nội - Liều LD50 đợc nghiên cứu theo phơng pháp Karber thí nghiệm trên chuột nhắt trắng có khối lợng 18-20g. Những nhóm chuột 12 con đợc cho uống cao ngu tất với các liều tăng dần; trong đó liều tối đa không gây chết con nào, liều tối thiểu gây chết toàn bộ lô chuột thí nghiệm(LD100) và một số liều trung gian, mà khoảng cách có thể không bằng nhau. Theo dõi và ghi số chuột chết ở mỗi nhóm. Thời gian theo dõi là ba ngày. 1.2.4- Xác định hàm lợng lu huỳnh trong các mẫu diêm sinh Thực hiện tại Khoa hoá phân tích-Viện dợc liệu Định lợng theo phơng pháp acid-base thừa trừ, chỉ thị màu là Methyl da cam. 9 Nguyên tắc phản ứng: Cân chính xác Pt gam mẫu thử, thêm V ml (chính xác) dung dịch KOH 0.5N/cồn và nớc đun cách thuỷ sôi đến tan hết lu huỳnh và cồn, thêm H202 đến khi mất màu dung dịch. Để nguội thêm 2 giọt Methyl da cam và định lợng KOH d bằng acid HCL 0.5N.Song song tiến hành làm mẫu trắng, 1ml KOH 0.5N tơng đơng với 0.00817g lu huỳnh Hàm lợng lu huỳnh đợc tính theo công thức: X (%) = Pt kVtVo 008017,0100)( ììì Trong đó: Vo: Thể tích acid HCL dùng cho mẫu trắng Vt: Thể tích acid HCl dùng cho mẫu thử Pt: Lọng mẫu đem cân K : Hệ số hiệu chỉnh KOH 0.5N/cồn 2. Thực nghiệm và kết quả 2.1 Xông sinh ngu tất 2.1.1 Xông sinh với lợng sinh khác nhau Ngu tất sau khi thu hoạch về chặt bỏ phần thân, rũ sạch đất, chia thành 4 lô, mỗi lô khối lợng 20 kg, phơi nắng 2 ngày, rửa sạch bằng nớc, để ráo nớc, buộc thành các bó nhỏ, xếp vào lò xông sinh và xông sinh với thời gian 1 ngày, một đêm với những lợng sinh khác nhau, theo các mẫu sau: Mẫu 1: 0.5kg/tạ dợc liệu (Ký hiệuM1). Mẫu 2: 1kg/tạ dợc liệu (Ký hiệu M2) Mẫu 3: 1.5kg/tạ dợc liệu (Ký hiệu M3). Mẫu 4: 3kg/tạ dợc liệu (Ký hiệu M4) Xông sinh một ngàymột đêm, sau đó lấy ra sấy ở nhiệt độ 60C cho đến khô đạt độ ẩm<15%. Bảo quản mẫu để nghiên cứu tiếp. Kết quả thu đợc trình bày ở bảng 2. - Nhận xét: Ngu tất khi đã chế củ nhuận dẻo, bẻ gập của không bị gẫy nh khi còn tơi. 10