Đánh giá hàm lượng lưu huỳnh tồn dư, hàm lượng saponin, đường tự do,và độc tính cấp của các mẫu dược liệu

Vị thuốc Ngưu tất là rễ phơi hay sấy khô của cây Ngưu tất: Achyranthes bidentata Blume họ rau Dền Amaranthaceae. Cây thuộc thảo cao khoảng 1m. Thân mảnh, lá mọc đối, hình trứng, đầu nhọn, mép lá nguyên dài 5-12 cm. Cụm hoa là bông ở đầu cành hay kẽ lá. Hoa mọc hướng lên nhưng khi biến thành quả sẽ mọc quặp xuống. Quả nang, lá bắc còn lại và nhọn thành gai cho nên vướng phải có thể mắc vào quần áo. Cây mọc ở Trung quốc, Việt Nam và các nước Đông Nam Á. Trồng bằng hạt, ở đồng bằng thì trồng vào tháng 9-10 thu hoạch vào tháng 2-3. Vùng miền núi trồng vào tháng 2-3 thu hoạch vào tháng 9-10. Muốn lấy giống thì cây sau khi thu hoạch, cắt bớt rễ, cắt bớt thân và trồng lại khoảng 4 tháng nữa mới lấy hạt [2]. Năng suất hiện nay vào khoảng 1,2 tấn một hecta.

Đặt Vấn Đề Ngưu tất là một vị thuốc được dùng khá phổ biến trong Y học cổ truyền với nhu cầu ngày càng tăng, được nhập trồng vào nước ta từ những năm 1960. Hiện nay đã thích hợp với điều kiện nước ta và phát triển tốt, được trồng ở nhiều nơi nhất là đồng bằng Bắc bộ như: xã Tân Quang huyện Văn Lâm tỉnh Hưng Yên, thôn Thiết Trụ, huyện Khoái Châu tỉnh Hưng Yên, xã Ninh Hiệp huyện Gia Lâm, trung tâm nghiên cứu cây trồng và chế biến thuốc Hà Nội và một số nơi khác. Khi thu hoạch người ta thường sơ chế bằng phương pháp xông sinh sau đó đem bán ra thị trường. Vậy vấn đề đặt ra là: tỉ lệ lưu huỳnh dùng để xông là bao nhiêu, xông sinh xong cần sấy ở nhiệt độ bao nhiêu , bảo quản bao lâu mới được sử dụng để đảm bảo không độc hại đến sức khoẻ con người, đảm bảo được chất lượng của thuốc đạt được tiêu chuẩn dược điển Viêt Nam và khu vực. Vì vậy chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu sự ảnh hưởng của quá trình xông sinh đến chất lượng dược liệu ngưu tất. Mục đích : đánh giá hàm lượng lưu huỳnh còn tồn dư, hàm lượng saponin toàn phần, hàm lượng đường và độc tính cấp của dược liệu được sơ chế với các phương pháp xông sinh khác nhau.Trên cơ sở đó có thể đề xuất phương pháp xông sinh thích hợp cho dược liệu chất lượng tốt và an toàn cho người sử dụng. Để đạt được mục đích trên, đề tài được tiến hành nghiên cứu với một số nội dung sau: -Xông sinh ngưu tất bằng các phương pháp khác nhau: Về liều lượng sinh, thời gian xông, nhiệt độ sấy. -Đánh giá hàm lượng lưu huỳnh tồn dư, hàm lượng saponin, đường tự do,và độc tính cấp của các mẫu dược liệu. 1 Phần I: Tổng quan 1-Tổng quan về ngưu tất 1.1- Đặc điểm thực vật, phân bố và thu hái Vị thuốc Ngưu tất là rễ phơi hay sấy khô của cây Ngưu tất: Achyranthes bidentata Blume họ rau Dền Amaranthaceae. Cây thuộc thảo cao khoảng 1m. Thân mảnh, lá mọc đối, hình trứng, đầu nhọn, mép lá nguyên dài 5-12 cm. Cụm hoa là bông ở đầu cành hay kẽ lá. Hoa mọc hướng lên nhưng khi biến thành quả sẽ mọc quặp xuống. Quả nang, lá bắc còn lại và nhọn thành gai cho nên vướng phải có thể mắc vào quần áo. Cây mọc ở Trung quốc, Việt Nam và các nước Đông Nam Á. Trồng bằng hạt, ở đồng bằng thì trồng vào tháng 9-10 thu hoạch vào tháng 2-3. Vùng miền núi trồng vào tháng 2-3 thu hoạch vào tháng 9-10. Muốn lấy giống thì cây sau khi thu hoạch, cắt bớt rễ, cắt bớt thân và trồng lại khoảng 4 tháng nữa mới lấy hạt [2]. Năng suất hiện nay vào khoảng 1,2 tấn một hecta. 1.2- Thành phần hoá học Rễ có chứa các saponin, khi thuỷ phân cho các sapogenin là acid oleanolic., ngoài ra còn có ecdysteron và inokosteron, glucose, galactose, rhamnoza. Muối kali [2,8], và một số thành phần khác như: Betain, polysaccharide, emodin, physcion[ 15] - acid oleanolic HO COOH 2 - Ecdysteron H H O H O O H O H C H 3 O H O O H - Inokosteron H HO HO OH OH O OH H CH 2 OH 1.3- Tác dụng dược lý • Làm giảm sức co bóp của tim ếch [8 ] • Giãn mạch hạ huyết áp, ức chế nhẹ tim ếch cô lập [2] • Tăng co bóp tử cung [2,6] • Tác dụng phá huyết và làm vón albumin [2,8] • Tác dụng hạ cholesterol trong máu và hạ huyết áp [2 ] • Ecdysteron và Inokosteron có tác dụng chống viêm,kháng khuẩn [8] • Lợi tiểu, hạ đường huyết, cải thiện chức năng gan [9]. • Thúc đẩy quá trình tổng hợp protein[9] 3 • Kích thích miễn dịch [16] • Chống ung thư [17, 18] 1.4- Sơ chế và bào chế • Sơ chế: Dược liệu sau khi thu hoạch về chặt bỏ phần thân, rũ sạch đất, phơi nắng 1-2 ngày, rửa sạch bằng nước, để ráo nước, xếp vào xông sinh với lượng sinh xông và thời gian xông theo kinh nghiệm từng địa phương.[8, 10] • Chế biến cổ truyền [10] Khi sử dụng làm thuốc người ta phải qua khâu chế biến bào chế, có nhiều phương pháp chế biến khác nhau, tuỳ theo các mục đích điều trị chứng bệnh khác nhau mà người thầy thuốc chọn phương pháp chế biến thích hợp. - Ngưu tất thái dùng sống Ngưu tất được rửa sạch, làm mềm, thái phiến vát dày 1-3mm (nếu rễ to); cắt đoạn 3-5mm (nếu rễ nhỏ), phơi hoặc sấy khô để dùng. [10] - Ngưu tất sao cám Ngưu tất rửa sạch, thái phiến, để ráo nước. Sao cám nóng già, bốc khói trắng, cho ngưu tất phiến vào sao đều đến khi có màu vàng. Lấy ra rây bỏ cám. - Ngưu tất trích rượu Ngưu tất 10 kg Ruợu 2 kg Ngưu tất phiến sao nóng, phun rượu vào sao đến khô. Hoặc tẩm rượu vào ngưu tất, ủ 30 phút- 1 giờ cho ngấm rượu; sau sao tới khô. - Ngưu tất thán Đem ngưu tất sao đến khi phía ngoài bị đen hoàn toàn, bên trong vàng đậm; có thể trích rượu sao đen như trên. - Ngưu tất sao đen 4 Lấy ngưu tất phiến, dùng nhỏ lửa sao cho đến khi xuất hiện các chấm đen. - Ngưu tất trích muối Ngưu tất phiến 10 kg Muối 0.2 kg Muối hoà thành dung dịch đủ để tẩm vào ngưu tất đã thái phiến ; ủ 30 phút , sao khô. 1.5- Công năng chủ trị [4, 8, 9, 10] - Hoạt huyết thông kinh hoạt lạc: dùng trong các trường hợp kinh nguyệt bế, kinh nguyệt không đều. - Thư cân, mạnh gân cốt, bổ can thận dùng cho các bệnh đau xương khớp, đau xương sống, đặc biệt đối với khớp của chân; sinh lý yếu, tiểu không tự chủ được, làm giảm bạc tóc. - Chỉ huyết: thường dùng trong các trường hợp hoả độc bốc lên gây nôn ra máu, chảy máu cam. - Lợi niệu, trừ sỏi:dùng trong các trường hợp tiểu tiện đau buốt, tiểu tiện ra sỏi, đục. -Giáng áp, giải độc chống viêm: dùng phòng bệnh bạch hầu -Làm tá dược dẫn huyết, hoả đi xuống. 2- Diêm sinh 2.1- Nguồn gốc. Diêm sinh còn gọi là sinh, diêm vàng, hoàng nha, lưu hoàng, thạch lưu hoàng, oải lưu hoàng, tên khoa học là sulfur. Là một nguyên tố có sẵn trong thiên nhiên hay do chế từ những hợp chất có lưu huỳnh trong thiên nhiên. Lưu huỳnh có thể tồn tại dưới dạng tự do, hay sunphua như pyrit, sunphua kẽm, hoặc sunphua các kim loại khác, sunphua hydro…[6]. Tuỳ theo nguồn gốc và cách chế biến khác nhau, lưu hoàng có khi là bột màu vàng, có khi là những 5 cục to không đều màu vàng tươi, hơi có mùi đặc biệt, ít tan trong nước, trong rượu và ete, tan nhiều hơn trong dầu. Khi đốt lên cháy với ánh lửa xanh và toả ra mùi khét khó thở. [8] 2.2- Thành phần hoá học Thành phần chủ yếu của diêm sinh là chất sulfur nguyên chất, tuỳ theo nguồn gốc và cách chế tạo, có thể có những tạp chất như: đất, vôi, asen, sắt . [8]. 3.3- Công dụng và liều dùng [8] Diêm sinh được dùng trong cả đông và tây y.Theo tài liệu cổ, diêm sinh có vị chua, tính ôn, có độc, vào hai kinh tâm và thận. Có tác dụng bổ hoả, tráng dương, bổ mệnh môn chân hoả, lưu lợi đại trường, sát trùng. Dùng trong những trường hợp liệt dương, lỵ lâu ngày, người già yếu, hư hàn mà bí đại tiện, phong thấp. Dùng trong còn có tác dụng sát trùng, chữa mẩn ngứa, mụn nhọt. Ngày dùng 2-3g dưới dạng thuốc bột hay thuốc viên. 6 Phần II:Thực nghiệm và kết quả 1- Nguyên liệu, phương tiện và phương pháp nghiên cứu 1.1- Nguyên liệu, phương tiện. • Nguyên liệu - Rễ ngưu tất tươi thu hoạch ở trung tâm nghiên cứu cây trồng và chế biến cây thuốc Hà Nội. - Diêm sinh lấy mẫu tại một số nơi dùng để chế biến thuốc. . Xã Ninh Hiệp, huyện Gia Lâm Hà Nội(Ký hiệu mẫu:S1) .Thôn Nghĩa Trai, xã Tân Quang huyện Văn Lâm(Ký hiệu mẫu:S2) .Thôn Thiết Trụ, huyện Khoái Châu tỉnh Hưng Yên(Ký hiệu mẫu:S3) .Trung tâm nghiên cứu cây trồng và chế biến thuốc Hà Nội (Ký hiệu mẫu:S4) • Hoá chất,thuốc thử Cồn tuyệt đối, acid sulphuric 72%, dd KOH/cồn 0.5N, dd acid HCl 0.5N,ortho.Toluidin, Thioure, chỉ thị Methyl da cam, .đạt tiêu chuẩn do viện Dược liệu cung cấp. • Động vật thí nghiệm Chuột nhắt trắng khoẻ mạnh,có khối lượng 20-22g do đủ tiêu chuẩnthí nghiệm mua tại Hà Tây. • Máy móc và trang thiết bị - Máy đo độ ẩm Precisa MA300 Thuỵ Sĩ. - Máy quang phổ UV-VIS Cary 1E cua hãng Varian(Mỹ) - Máy đo quang phổ tử ngoại (máy ASIMCO của Anh) - Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử( máy AAS-Shimadza của Nhật) 1.2- Phương pháp thực nghiệm 1.2.1- Xông sinh ngưu tất 7 1.2.1.1- Xông sinh ngưu tất với lượng sinh khác nhau Các mẫu ngưu tất cùng khối lượng được xông sinh với những lượng sinh khác nhau, trong cùng một thời gian một ngày một đêm.Với khối lượng sinh như sau: 0,5kg S/tạ dược liệu; 1kg S/tạ dược liệu; 1.5kg S/tạ dược liệu; 3kg S/tạ dược liệu. Sấy ở 60°C đạt độ thuỷ phần <15%. 1.2.1.2- Xông sinh ngưu tất với thời gian khác nhau Xông sinh các mẫu có khối lượng bằng nhau với cùng lượng sinh 1.5kg S/tạ dược liệu nhưng thời gian khác nhau, xông 4h, 12h, 24h. Sấy khô ở 60°C đạt độ thuỷ phần < 15%. 1.2.1.3- Sấy ở các nhiệt độ khác nhau Sấy ở nhiệt độ khác nhau 60°C, 70°C, 80°C, 100°C đến đạt độ thuỷ phần < 15%. Sau khi chế biến tiến hành kiểm tra chất lượng đồng thời đóng túi bảo quản. 1.2.2- Định lượng một số thành phần trong ngưu tất sau khi xông 1.2.2.1- Định lượng saponin (TCCS VDL) Thực hiện tại Khoa hoá phân tích-Viện dược liệu. Theo phương pháp đo quang ở bước sóng λ= 538, với chất chuẩn là acid oleanolic và thuốc thử tạo màu là cồn Vanilin trong H2SO4 đặc. Hàm lượng Saponin (tính theo acid oleanolic) được tính bằng công thức: X (%) = )100( 10000 BPtDc PcDt −×× ×× Trong đó: Dt: Mật độ quang ống thử Dc: Mật độ quang ống chuẩn Pt: Lượng dược liệu (g) Pc: Lượng acid oleanoic(g) B: Độ ẩm của dược liệu 1.2.2.2- Định lượng đường tự do (TCCS VDL) Thực hiện tại tại Khoa hoá phân tích-Viện dược liệu. 8 Theo phương pháp đo quang ở bước sóng λ=630nm , với chất chuẩn là glucoza 0.1%, thuốc thử là O.Toluidin và Thioure. Hàm lượng đường được tính theo công thức: X (%) = )100( 1000 BPDc Dt −×× × Trong đó: X%: Hàm lượng đường tự do tính theo Glucoza Dt: Mật độ quang ống thử Dc: Mật độ quang ống chuẩn P: Lượng dược liệu(gam) B: Độ ẩm của dược liệu(%) 1.2.2.3- Định lượng lưu huỳnh trong ngưu tất sau khi xông sinh và trong dịch chiết nước và cồn Thực hiện tại phòng phân tích môi trường- Viện công nghệ môi trường - Định lượng theo phương pháp cân Nguyên tắc: Mẫu được nghiền nhỏ, vô vơ hoá và kiềm chảy với Na2CO3. Hỗn hợp nóng chảy được lấy bằng nước cất nóng. Acid hoá bằng HCl và dùng để định lưu huỳnh dưới dạng BaSO4 bằng phương pháp trọng lượng. 1.2.3- Thử độc tính cấp của lưu huỳnh và ngưu tất sau khi xông sinh Thực hiện tại bộ môn phân tích - Trường đai học Dược Hà Nội - Liều LD50 được nghiên cứu theo phương pháp Karber thí nghiệm trên chuột nhắt trắng có khối lượng 18-20g. Những nhóm chuột 12 con được cho uống cao ngưu tất với các liều tăng dần; trong đó liều tối đa không gây chết con nào, liều tối thiểu gây chết toàn bộ lô chuột thí nghiệm(LD100) và một số liều trung gian, mà khoảng cách có thể không bằng nhau. Theo dõi và ghi số chuột chết ở mỗi nhóm. Thời gian theo dõi là ba ngày. 1.2.4- Xác định hàm lượng lưu huỳnh trong các mẫu diêm sinh 9 Thực hiện tại Khoa hoá phân tích-Viện dược liệu Định lượng theo phương pháp acid-base thừa trừ, chỉ thị màu là Methyl da cam. Nguyên tắc phản ứng: Cân chính xác Pt gam mẫu thử, thêm V ml (chính xác) dung dịch KOH 0.5N/cồn và nước đun cách thuỷ sôi đến tan hết lưu huỳnh và cồn, thêm H202 đến khi mất màu dung dịch. Để nguội thêm 2 giọt Methyl da cam và định lượng KOH dư bằng acid HCL 0.5N.Song song tiến hành làm mẫu trắng, 1ml KOH 0.5N tương đương với 0.00817g lưu huỳnh Hàm lượng lưu huỳnh được tính theo công thức: X (%) = Pt kVtVo 008017,0100)( ×××− Trong đó: Vo: Thể tích acid HCL dùng cho mẫu trắng Vt: Thể tích acid HCl dùng cho mẫu thử Pt: Lưọng mẫu đem cân K : Hệ số hiệu chỉnh KOH 0.5N/cồn 2. Thực nghiệm và kết quả 2.1 Xông sinh ngưu tất 2.1.1 Xông sinh với lượng sinh khác nhau Ngưu tất sau khi thu hoạch về chặt bỏ phần thân, rũ sạch đất, chia thành 4 lô, mỗi lô khối lượng 20 kg, phơi nắng 2 ngày, rửa sạch bằng nước, để ráo nước, buộc thành các bó nhỏ, xếp vào lò xông sinh và xông sinh với thời gian 1 ngày, một đêm với những lượng sinh khác nhau, theo các mẫu sau: Mẫu 1: 0.5kg/tạ dược liệu (Ký hiệuM1). Mẫu 2: 1kg/tạ dược liệu (Ký hiệu M2) 10