Nghiên cứu tạo sản phẩm liên hợp oxytocin peg để làm thuốc có khả năng bảo vệ được oxytocin trong đường tiêu hóa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THANH NGHỊ NGHIÊN CỨU TẠO SẢN PHẨM LIÊN HỢP OXYTOCIN - PEG ĐỂ LÀM THUỐC CÓ KHẢ NĂNG BẢO VỆ ĐƢỢC OXYTOCIN TRONG ĐƢỜNG TIÊU HÓA LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THANH NGHỊ NGHIÊN CỨU TẠO SẢN PHẨM LIÊN HỢP OXYTOCIN - PEG ĐỂ LÀM THUỐC CÓ KHẢ NĂNG BẢO VỆ ĐƢỢC OXYTOCIN TRONG ĐƢỜNG TIÊU HÓA LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH DƢỢC MÃ SỐ: 8720208 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Văn Rƣ HÀ NỘI 2018 LỜI CẢM ƠN Với kính trọng lòng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Nguyễn Văn Rƣ - trƣởng mơn Hóa Sinh dƣợc, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, ngƣời thầy trực tiếp hƣớng dẫn tận tình giúp đỡ tơi q trình làm luận văn Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy giáo mơn Hóa Sinh dƣợc, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội bảo tận tình tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn tới Ban giám hiệu, môn Dƣợc trƣờng Cao đẳng Y tế Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình thực luận văn Tôi chân thành cảm ơn tới Ban giám hiệu, phòng Sau đại học trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội tồn thể thầy giáo trƣờng cho kiến thức quý báu q trình học tập Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới gia đình bạn bè ln bên cạnh chăm lo, động viên khích lệ tơi lúc khó khăn nhƣ trình thực luận văn Hà Nội, ngày 26 tháng 03 năm 2018 LÊ THANH NGHỊ MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 OXYTOCIN 1.1.1 Đặc điểm cấu tạo tính chất 1.1.2 Tác dụng dƣợc lý Oxytocin 1.1.3 Sự bền phân tử Oxytocin chế phẩm thuốc 1.2 PHƢƠNG PHÁP TĂNG ĐỘ BỀN CỦA PHÂN TỬ OXYTOCIN 1.2.1 Tạo chất có tác dụng tƣơng tự Oxytocin 1.2.2 Kỹ thuật liên kết vào cầu nối disulfid Oxytocin 1.2.3 Tạo hệ đệm chứa ion kim loại chế phẩm thuốc 1.2.4 Chế phẩm dạng bột đông khô 1.2.5 Nghiên cứu gắn phân tử polyethylen glycol vào protein Oxytocin 1.3 PHƢƠNG PHÁP PEGYL HÓA PROTEIN DÙNG LÀM THUỐC 10 1.3.1 Polyethylen glycol 10 1.3.2 Phƣơng pháp Pegyl hóa protein dƣợc dụng 10 1.4 PHƢƠNG PHÁP PEGYL HÓA OXYTOCIN 15 1.4.1 Gắn kết vào nhóm amin Oxytocin 15 1.4.2 Gắn kết vào cầu nối disulfid Oxytocin 16 1.4.3 Các vị trí liên hợp khác 18 1.5 PEGYL HÓA ẢNH HƢỞNG ĐẾN TÁC DỤNG CỦA OXYTOCIN 19 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 21 2.1.1 Nguyên vật liệu 21 2.1.2 Dụng cụ máy móc 21 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu, phƣơng pháp xử lý số liệu 22 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 22 2.3 PHƢƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 23 2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu 23 2.3.2 Pha dung dịch đệm dùng nghiên cứu 23 2.3.3 Tiến hành gắn PEG vào phân tử Oxytocin 25 2.3.4 Xác định hình thành hợp chất liên hợp Oxytocin PEG phƣơng pháp điện 27 2.3.5 Đánh giá hiệu hình thành tinh chế hợp chất liên hợp Oxytocin PEG phƣơng pháp sắc ký lọc gel 30 2.3.6 Phƣơng pháp định lƣợng Oxytocin hợp chất liên hợp 33 2.3.7 Phƣơng pháp đông khô 34 2.3.8 Phƣơng pháp đánh giá độ bền protein hợp chất liên hợp 35 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 37 3.1 LIÊN HỢP mPEG aldehyd VỚI OXYTOCIN VÀ ĐÁNH GIÁ TỶ LỆ HÌNH THÀNH HỢP CHẤT LIÊN HỢP 37 3.1.1 Tổng hợp sản phẩm liên hợp Oxytocin-PEG 37 3.1.2 Phát phức hợp phản ứng điện di 37 3.1.3 Xây dựng phƣơng trình tƣơng quan logarit khối lƣợng phân tử protein thể tích rửa giải (Ve) sắc ký lọc gel 38 3.1.4 Xác định khối lƣợng phân tử hợp chất liên hợp phản ứng Pegyl hóa sắc ký lọc gel 42 3.1.5 Xác định hiệu hình thành sản phẩm mẫu phản ứng 43 3.2 Ảnh hƣởng lƣợng mPEG aldehyd tham gia phản ứng tới hiệu suất hình thành khả phân tách Oxytocin-PEG dung dịch sau sắc ký lọc gel 45 3.3 Tinh chế hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG dạng bột đông khô 47 3.4 Đánh giá độ bền Oxytocintrong phân tử Oxytocin-PEG 48 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 51 4.1.Về phản ứng gắn kết tạo phức hợp Oxytocin-PEG 51 4.2 Xác định khối lƣợng sản phẩm Oxytocin-PEG sau phản ứng liên hợp 52 4.3 Về đánh giá hiệu hình thành phân tách hợp chất liên hợp từ phản ứng 53 4.4 Đông khô Oxytocin-PEG dạng bột 53 4.5 Về đánh giá độ bền Oxytocin Oxytocin-PEG dịch sinh học giả 54 KẾT LUẬN 55 KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT APS: Ammonium persulfate Asn5: acid amin Asparagine vị trí số Cys1: acid amin Cysteine vị trí số Cys6: acid amin Cysteine vị trí số D: Độ hấp thụ quang DCC: Dicyclohexyl carbodiimide DNA: Deoxyribonucleic acid DTT: dithiothreitole FDA: Food and drug Administation Gln4: acid amin Glutamine vị trí số Gly9: acid amin Glycine vị trí số mPEG aldehyde: Methoxy polyethylen propion glycol NHS: N-Hydroxysuccinimidyl PEG: Polyethylen glycol Pegyl hóa: Thực gắn kết polyethylene glycol SDS: Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE: điện di gel polyacrylamide sử dụng Sodium dodecyl sulfate TEMED: tetramethylenediamine Tris: tris(hydroxylmethyl)aminomethane Tyr2: acid amin Tyrosine vị trí số UV: Ultraviolet Ve: thể tích rửa giải VR: phân đoạn rửa giải DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu tạo khơng gian Oxytocin Hình 1.2 Sự hình thành disulfid từ Oxytocin Hình 1.3 Cấu trúc desamino-oxytocin carbetocin Hình 1.4 Các liên kết vào cầu nối disulfid Oxytocin Hình 1.5 Protein đƣợc Pegyl hóa 11 Hình 1.6 Cấu trúc hóa học dẫn chất PEG hoạt hóa dùng cho phản ứng Pegyl hóa vào nhóm amin 12 Hình 1.7 Phản ứng NHS ester peptid .15 Hình 1.8 Quá trình khử amin qua trung gian tạo bazơ Schiff 16 Hình 1.9 Liên hợp với nhóm Cacboxylic 16 Hình 1.10 Gắn hợp chất dibromo dithiomaleimid tạo cầu nối cacbon sulfid 17 Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 23 Hình 2.2 Gắn mPEG aldehyd vào phân tử Oxytocin 25 Hình 2.3 Nguyên tắc phản ứng liên hợp 26 Hình 3.1 Kết điện di pH 7,5 37 Hình 3.2 Kết điện di pH 4,5 38 Hình 3.3 Đồ thị mật độ quang phân đoạn rửa giải dung dịch Insulin 39 Hình 3.4 Đồ thị mật độ quang phân đoạn rửa giải dung dịch Chymotrypsin 39 Hình 3.5 Đồ thị mật độ quang phân đoạn rửa giải dung dịch Casein 40 Hình 3.6 Đồ thị mật độ quang phân đoạn rửa giải dung dịch Oxytocin 40 Hình 3.7 Đồ thị hồi quy tuyến tính logMW Ve 41 Hình 3.8 Biểu đồ mật độ quang phân đoạn rửa giải dung dịch sau phản ứng liên hợp Oxytocin mPEG aldehyd pH 4,5 42 Hình 3.9 Biểu đồ mật độ quang phân đoạn rửa giải dung dịch sau phản ứng liên hợp Oxytocin mPEG aldehyd với pH 7,5 43 Hình 3.10 Bột đơng khơ Oxytocin-PEG 47 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các sản phẩm Pegyl hóa sử dụng thị trƣờng 14 Bảng 2.1 Các dung dịch đệm dùng nghiên cứu 23 Bảng 3.1 Tổng hợp kết rửa giải protein phƣơng pháp lọc gel 41 Bảng 3.2 Mật độ quang (D) phân đoạn lọc gel với phản ứng pH 4,5 43 Bảng 3.3 Mật độ quang (D) phân đoạn lọc gel với phản ứng pH 7,5 44 Bảng 3.4 Lƣợng sản phẩm liên hợp thu đƣợc dung dịch sau lọc gel 44 Bảng 3.5 Mật độ quang phân đoạn rửa giải phản sau sắc ký lọc gel 45 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng lƣợng mPEG aldehyd tham gia phản ứng với tỷ lệ Oxytocin-PEG hình thành phân doạn sau lọc gel 46 Bảng 3.7 Hiệu suất thu hồi dạng bột đông khô hợp chất Oxytocin-PEG 47 Bảng 3.8 Tỷ lệ thu hồi dạng bộc đông khô lƣợng Oxytocin-PEG dung dịch sau lọc gel 48 Bảng 3.9 Độ hấp thụ ánh bƣớc sóng 280mm dịch ruột chứa Oxytocin Oxytocin-PEG 48 Bảng 3.10 Độ hấp thụ ánh bƣớc sóng 280nm dịch dày giả chứa Oxytocin Oxytocin-PEG 49 Bảng 3.11 Độ hấp thụ ánh bƣớc sóng 280nm dịch nƣớc bọt Oxytocin Oxytocin-PEG 49 ĐẶT VẤN ĐỀ Oxytocin hormon peptid nội sinh thùy sau tuyến yên Ngày nay, ngƣời ta tổng hợp đƣợc đƣờng tái tổ hợp để làm thuốc phổ biến đƣợc sử dụng sản khoa Với định quan trọng thúc đẻ cầm máu sau sinh Trong thể, Oxytocin bị phá hủy nhanh enzym peptidase nên thời gian bán thải phút, gây khó khăn sử dụng với tác dụng cầm máu dự phòng chảy máu sau sinh [2] Các nhƣợc điểm khác sử dụng Oxytocin nhƣ gây đau tiêm bắp, sử dụng liều cao khó kiểm sốt tốc độ tiêm truyền tĩnh mạch điều trị Khi sử dụng đƣờng uống Oxytocin bị phá hủy hồn tồn đƣờng tiêu hóa [1] Polyethylen glycol (PEG) có kích thƣớc phân tử từ 500 Da đến 20 kDa Với đặc điểm trung tính, thân nƣớc, khơng gây độc PEG đƣợc FDA (Mỹ) cho phép dùng làm tá dƣợc nhiều loại thuốc tiêm thuốc uống [5], [70] PEG đƣợc nhà khoa học sử dụng để bảo vệ cấu trúc protein, khắc phục số nhƣợc điểm sử dụng protein làm thuốc điều trị lâm sàng Kỹ thuật Pegyl hóa protein giúp gắn phân tử PEG vào phân tử protein thuốc mang lại số ƣu điểm nhƣ: làm tăng độ bền phân tử cho protein thuốc, kéo dài tác dụng giảm liều điều trị [22], [41] Các nghiên cứu giới chứng minh Pegyl hóa Oxytocin làm tăng độ bền phân tử điều kiện bảo quản, kéo dài thời gian tác dụng giúp làm giảm liều dùng Oxytocin đƣợc Pegyl hóa đƣợc đánh giá ứng dụng làm thuốc có tác dụng kéo dài Để sử dụng an tồn bệnh nhân dự phòng cầm máu sau sinh, phải dùng với liều cao thời gian kéo dài [41] Để thực đƣợc kỹ thuật Pegyl hóa vào việc cải biến Oxytocin dƣợc dụng Việt Nam Đồng thời, đánh giá đƣợc khả làm tăng độ bền phân tử Oxytocin dịch sinh học invitro, góp phần nhằm thay đổi đƣờng dùng Oxytocin, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo sản phẩm liên hợp Oxytocin - PEG để làm thuốc có khả bảo vệ Oxytocin đường tiêu hóa” với mục tiêu sau: Tạo phức hợp Oxytocin-PEG xác định hiệu hình thành Phân tách đánh giá độ bền protein phân tử Oxytocin-PEG môi trường tương tự dịch tiêu hóa CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 OXYTOCIN 1.1.1 Đặc điểm cấu tạo tính chất Oxytocin hormon hậu tuyến n có cơng thức phân tử C43H66N12O12S2, phân tử lƣợng 1007 Da Cấu tạo phân tử polypeptid vòng: S S H2N-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2 Cấu tạo khơng gian [32]: Hình 1.1 Cấu tạo khơng gian Oxytocin Oxytocin đƣợc Henry Hallett Dale phát lần vào năm 1906 Trong co thắt có giải phóng khỏi tuyến yên Cho tới năm 1950 nghiên cứu Vincent du Vigneaud làm sáng tỏ cấu trúc Oxytocin Ngay sau Oxytocin đƣợc tổng hợp mặt sinh học polypeptid đƣợc tổng hợp đoạt giải Nobel năm 1955 hóa học Với cấu trúc protein bậc I, phân tử Oxytocin có chứa liên kết peptid acid amin cầu nối disulfur phân tử Giữa phân tử liên kết với liên kết hydro hay liên kết ion Cách xếp acid amin chuỗi polypeptid định cấu trúc khơng gian tính chất sinh học Oxytocin [9] Các liên kết phân tử Oxytocin liên kết yếu Khi tiếp xúc với yếu tố công môi trƣờng (pH, nhiệt độ…) liên kết dễ bị phá vỡ, làm thay đổi cấu trúc ban đầu Oxytocin Do đó, cần có biện pháp thích hợp bảo vệ cấu trúc để tăng hiệu điều trị mong muốn thuốc Sản phẩm thu đƣợc dạng bột vơ định hình hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG - So sánh với lƣợng Oxytocin-PEG dung dịch sau lọc gel Bảng 3.8 Tỷ lệ thu hồi dạng bột đông khô lượng Oxytocin-PEG dung dịch sau lọc gel H% bột đông khô H% dung dịch sau lọc gel 60,12 59,47 62,78 60,62 58,28 67,33 p > 0,05 * Nhận xét: Tỷ lệ thu hồi hợp chất liên hợp sau đông khô dung dịch sau sắc ký lọc gel nhƣ (p > 0,05) 3.4 Đánh giá độ bền Oxytocin phân tử Oxytocin-PEG - Trong dịch tƣơng tự dịch ruột non có chứa Pancreatin Bảng 3.9 Độ hấp thụ ánh bước sóng 280 nm dịch ruột chứa Oxytocin Oxytocin-PEG MẪU ĐO 0h Dịch tƣơng tự dịch ruột non chứa 3,267 Pancreatin Dịch tƣơng tự dịch ruột non có 4,579 Oxytocin Tỷ lệ Oxytocin bị phá hủy (%) Dịch tƣơng tự dịch ruột non có 4,745 Oxytocin-PEG Tỷ lệ Oxytocin-PEG bị phá hủy (%) 0,5 h D 1h 2h 3h 3,260 3,120 3,038 3,012 3,754 3,320 3,046 3,018 62,35 84,76 99,39 99,54 4,423 4,054 3,880 3,680 21,31 36,81 43,03 54,80 Nhận xét: Trong môi trƣờng dịch tƣơng tự dịch ruột non có chứa Pancreatin, Oxytocin bị phá hủy nhanh gần nhƣ hoàn toàn sau (99,39%) Tuy nhiên, tốc độ phá hủy sản phẩm liên hợp với mPEG aldehyd chậm (p < 0,05) Sau dịch tƣơng tự dịch ruột non có 54,9% hợp chất Oxytocin-PEG bị phá hủy Cho thấy khả bền vững cao liên kết peptid hợp chất liên hợp Oxytocin môi trƣờng dịch tƣơng tự dịch ruột non 48 - Trong dịch tƣơng tự dịch dày Bảng 3.10 Độ hấp thụ ánh bước sóng 280 nm dịch dày giả chứa Oxytocin Oxytocin-PEG D MẪU ĐO 0h 0,5 h 1h 2h 3h 4,604 4,013 3,267 3,260 3,124 Dịch tƣơng tự dịch dày hòa tan Oxytocin 5,916 4,874 3,776 3,650 3,228 Tỷ lệ Oxytocin bị phá hủy (%) 34,38 61,20 70,27 92,07 5,265 4,329 4,012 3,610 1,18 16,18 40,65 61,64 Dịch tƣơng tự dịch dày Dịch tƣơng tự dịch dày hòa tan Oxytocin-PEG 5,871 Tỷ lệ Oxytocin-PEG bị phá hủy (%) Với p < 0,05 cho thấy khác khả hấp thu ánh sáng bƣớc sóng 280 nm dung dịch tƣơng tự dịch vị có chứa Oxytocin dịch có chứa hợp chất liên hợp với mPEG aldehyd Nhƣ vậy, Oxytocin Oxytocin-PEG bị biến đổi dịch tƣơng tự dịch vị không nhƣ theo thời gian Tỷ lệ lƣợng Oxytocin bị phá hủy 92,07% so với 61,64% Oxytocin-PEG bị phá hủy sau Cho thấy độ bền vững hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG so với Oxytocin tự nhiên môi trƣơng dịch vị giả - Trong dung dịch tƣơng tự dịch nƣớc bọt Bảng 3.11 Độ hấp thụ ánh bước sóng 280 nm của dịch nước bọt chứa Oxytocin Oxytocin-PEG D 0h 0,5 h 1h 2h 3h MẪU ĐO Dịch tƣơng tự dịch nƣớc bọt chứa α0,520 amylase Dịch tƣơng tự dịch nƣớc bọt hòa tan Oxytocin 1,832 Tỷ lệ Oxytocin bị phá hủy (%) Dịch tƣơng tự dịch nƣớc bọt hòa tan Oxytocin-PEG 1,787 Tỷ lệ Oxytocin-PEG bị phá hủy (%) 49 0,520 0,520 0,520 0,520 1,764 1,624 1,546 1,410 5,18 15,85 21,80 32,16 1,724 1,612 1,514 1,423 4,97 13,81 21,55 28,73 Sự thay đổi độ hấp thu ánh sáng bƣớc sóng 280 nm dung dịch tƣơng tự dịch nƣớc bọt có chứa Oxytocin Oxytocin-PEG theo thời gian giống p = 0,152 > 0,05 Cho thấy độ bền Oxytocin hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG dịch nƣớc bọt nhƣ Sau thời gian dịch tƣơng tự nƣớc bọt có 32,16% lƣợng Oxytocin bị phá hủy có 28,73% lƣợng Oxytocin-PEG bị phá hủy Lƣợng hợp chất Oxytocin hợp chất liên hợp khơng bị phá hủy đáng kể dịch tƣơng tự nhƣ nƣớc bọt so sánh với phá hủy dịch dịch ruột dày giả (p < 0,05) 50 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1.Về phản ứng gắn kết tạo phức hợp Oxytocin-PEG Phản ứng gắn kết polyethylene glycol vào protein đƣợc thực cho nhiều thuốc có chất protein Trong nghiên cứu công bố điều kiện pH phù hợp cho phản ứng thƣờng 4,5 7,5 Đây điều kiện thích hợp cho phản ứng nhóm amin (-NH2) nhóm phản ứng nhƣ aldehyd (-CHO), cacboxyl (-COOH), … Cũng nhƣ điều kiện tốt cho khả xúc tác NaCNBH3 [10], [41] Những polyethylene glycol đƣợc lựa chọn cho phản ứng Pegyl hóa protein thƣờng sử dụng PEG-bis succinimidyl succinat, mPEG-succinimidyl propionat, PEG-aldehyd, PEG-imidazol carbonat, PEG-succinimidyl carbonat, Chúng dẫn chất PEG hoạt hóa đầu; đầu lại trơ, khơng hoạt động bị gắn với alkyl tạo thành nhóm alcoxy (hay gặp methoxy) Khi tham gia phản ứng tạo thành hợp chất liên hợp chúng thể ƣu nhƣợc điểm khác Trong đó, Methoxy polyethylene glycol aldehyd đƣợc đánh giá chất có khả phản ứng dễ dàng, chọn lọc vào nhóm amin phân tử protein [41], [65] Tỷ lệ thành phần chất tham gia vào phản ứng thƣờng thay đổi khác nhau, nhƣng tỷ lệ chất xúc tác khử hóa NaCNBH3 đƣợc thêm vào phản ứng thƣờng gấp từ vài lần đến vài chục lần nguyên liệu liên hợp [3] Thực phản ứng liên hợp với nguyên liệu dẫn chất Methoxyl polyethyle glycol propion aldehyd để Pegyl hóa Oxytocin Phản ứng liên hợp đƣợc thực hai điều kiện pH 4,5 7,5 Lựa chọn tỷ lệ hai nguyên liệu ban đầu tham gia phản ứng 1:1, xúc tác phản ứng NaCNBH3 gấp lần chất tham gia phản ứng số mol chất Phản ứng đƣợc thực hiên điều kiện nhiệt độ thấp (40C), thời gian 24 [41] Đánh giá kết liên hợp phản ứng phƣơng pháp điện di Cả hai mẫu điện di phản ứng pH 4,5 7,5 cho thấy suất chất Chất có chất protein bắt màu thuốc nhuộm Comassie blue, chạy gel điện di giống protein khác có khối lƣợng phân tử 51 lớn Oxytocin ban đầu Điều chứng minh đƣợc phân tử mPEG propion aldehyd gắn kết đƣợc với Oxytocin Sơ xác định đƣợc khối lƣợng hợp chất liên hợp tạo thành khoảng 6,1 kDa 4.2 Xác định khối lƣợng sản phẩm Oxytocin-PEG sau phản ứng liên hợp Phƣơng pháp sắc ký lọc gel thƣờng đƣợc dùng để tinh phân tử sinh chất mẫu nhỏ xác định trọng lƣợng phân tử protein [7],[8] Nguyên lý sắc ký lọc gel tách phân tử theo kích thƣớc khối lƣợng khác qua gel xốp Khi hỗn hợp protein đƣợc nạp vào cột, phân tử prortein nhỏ khuếch tán vào lỗ Còn protein lớn không chịu vào lỗ tiếp tục dọc theo cột khỏi cột trƣớc hạt nhỏ [8] Xác định đƣợc mối liên quan tuyến tính logarit khối lƣợng protein (logMW) thể tích rửa giải (Ve) chúng qua sắc ký lọc gel [73] Do đó, phƣơng pháp đƣợc áp dụng để xác định khối lƣợng phân tử protein mẫu phản ứng liên hợp Tiến hành sắc ký lọc gel lần lƣợt protein Chymotrypcin, Casein, Insulin Oxytocin với khối lƣợng giảm dần từ 25 kDa, 23,6 kDa, 5,778 kDa 1,078 kDa Xác định thể tích rửa giải Ve protein sắc ký lọc gel lần lƣợt ml, ml, 12 ml 18 ml Đã xây dựng đƣợc phƣơng trình tuyến tính logMW thể tích rửa giải Ve protein phƣơng pháp y = -0,131x + 2,36 Trong y logMW x thể tích rửa giải protein qua sắc ký lọc gel Phƣơng trình tuyến tính có hệ số tƣơng quan R -0,997 Trong phƣơng pháp sắc ký lọc gel thực nghiệm logMW phân tử protein có mối liên quan chặt chẽ với thể tích rửa giải Ve chúng tƣơng quan nghịch Các phản ứng liên hợp thực pH 4,5 7,5 đƣợc lấy mẫu tiến hành lọc gel Sắc ký đồ lọc gel xuất hai đỉnh hấp thụ hấp thu ánh sáng bƣớc sóng 280 nm Xác định đƣợc thể tích rửa giải Ve2 Oxytocin 18 ml tính theo phƣơng trình tuyến tính khối lƣợng 1009 Da Thể tích rửa giải hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG Ve1 = 12 ml có khối lƣợng 6,1 kDa Hợp chất phản ứng liên hợp phân tử mPEG aldehyd gắn kết với phân tử Oxytocin Kết phù hợp với kết mẫu điện di protein sau phản ứng liên hợp Kết phù hợp với nghiên cứu Jennifer Collins cộng thực hiên năm 2016 [41] 52 4.3 Về đánh giá hiệu hình thành phân tách hợp chất liện hợp từ phản ứng Mẫu phản ứng pH 4,5 7,5 đƣợc xác định có hình thành hợp chất liên hợp điện di Đƣợc lấy tiến hành sắc ký lọc gel Mẫu tiến hành đƣợc lặp lại lần kết cho thấy độ lặp lại tất mẫu sau sắc ký lọc gel Quy trình tiến hành có độ tin cậy Kết cho thấy hợp chất liên hợp có khối lƣợng 6,1 kDa phù hợp với kết Hợp chất có chứa phân đoạn rửa giải từ ml đến 14 ml sau sắc ký lọc gel Lƣợng hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG xác định dung dịch sau sắc ký lọc gel mẫu phản ứng pH 4,5 62,37 ± 4,31% so với 33,72 ± 3,64% thu đƣợc pH 7,5 (p < 0,05) Do đó, lƣợng hợp chất đƣợc liên hợp pH 4,5 lớn tiến hành điều kiện lọc gel mẫu thử Tỷ lệ thấp so với tổng hợp nghiên cứu giới khoảng 80% [38] Đồng thời chƣa giám sát đƣợc ảnh hƣởng thời gian đến hiệu hình thành sản phẩm liên hợp - Ảnh hƣởng tỷ lệ nguyên liệu tham gia vào phản ứng liên hợp tới hiệu hình thành khả tinh chế hợp chất liên hợp Thay đổi lƣợng mPEG aldehyd tham gia vào phản ứng liên hợp với Oxytocin khoảng thêm bớt 20%, 10% so với lƣợng ban đầu Các mẫu đƣợc tiến hành lặp lại lần Quy trình cho thấy độ tin cậy cao với thể tích rửa giải Ve Oxytocin-PEG 12 ml Phƣơng pháp sắc ký lọc gel Sephadex G-50 phù hợp để phân tách sản phẩm liên hợp Oxytoicn-PEG từ phản ứng Lƣợng hợp chất có chứa phân đoạn rửa giải từ ml đến 14 ml điều kiện sắc ký lọc gel nghiên cứu Với p > 0,05 so sánh mẫu M1 đến M4 với M0 cho thấy lƣợng hợp chất có mẫu dung dịch sau lọc gel không thay đổi so với tỷ lệ phản ứng ban đầu Nhƣ xác định đƣợc tỷ lệ phản ứng giảm lƣợng nguyên liệu tham gia tổng hợp 4.4 Đông khô Oxytocin-PEG dạng bột Đông khô phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng để chuyển protein dung dịch dạng bột Mà giữ đƣợc tính chất nhƣ hoạt tính chúng [3] Tiến hành đơng khơ phân đoạn có chứa Oxytocin-PEG sau sắc ký lọc gel áp suất 0,129 mBar, nhiệt độ -400C Làm mẫu đông khô kết cho thấy tỷ lệ bột đông khô hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG thu đƣợc 53 60,39% ± 2,62% Với p > 0,05 tỷ lệ Oxytocin-PEG có dung dịch sau sắc ký lọc gel tỷ lệ sau đông khô nhƣ Trong điều kiện đông khô thực nghiệm thu đƣợc 29,53 ± 1,11 mg Oxytocin-PEG dạng bột vơ định hình gần nhƣ trắng Nhƣ tinh chế đông khô đƣợc sản phẩm liên hợp Oxytocin-PEG dạng bột vô định hình 4.5 Về đánh giá độ bền Oxytocin Oxytocin-PEG dịch sinh học giả Trong đƣờng tiêu hóa Oxytocin thƣờng bị phá hủy hồn tồn dƣới tác động enzym nhƣ: Pancreatin, α-amylase, pepsin, aminopolypeptidase, dipeptidase, …[50] Theo số nghiên cứu Pegyl hóa protein cho thấy hợp chất sau liên hợp có khả bền vững mơi trƣờng chứa enzym kể [9], [65] Với mục đích đánh giá khả sử dụng thuốc chất protein theo đƣờng uống Nghiên cứu tiến hành đánh giá độ bền phân tử Oxytocin-PEG dịch tƣơng tự dịch đƣờng tiêu hóa So sánh hấp thụ ánh sáng bƣớc sóng 280 nm dung dịch sinh học giả có chứa Oxytocin dung dịch sinh học giả có chứa Oxytocin-PEG cho kết nhƣ sau: - Trong dịch tƣơng tự nƣớc bọt chứa α-amylase, với p > 0,05 cho thấy độ bền Oxytocin Oxytocin-PEG tƣơng tự nhƣ thời gian theo dõi Sau môi trƣờng tƣơng tự dịch nƣớc bọt, Oxytocin bị phá hủy 32,16% Oxytocin-PEG bị phá hủy 28,73% Cho thấy mức độ tốc độ phá hủy tƣơng tự hai hợp chất - So sánh độ bền vững Oxytocin Oxytocin-PEG môi dịch dày giả dịch tƣơng tự ruột non chứa Pancreatin thời gian cho p < 0,05 Chứng minh đƣợc phá hủy hai chất môi trƣờng dịch vị dịch ruột non không nhƣ Dựa vào kết đo quang kết luận đƣợc lƣợng Oxytocin bị phá hủy mạnh so với lƣợng hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG Cụ thể nhƣ sau: + Trong môi trƣờng dịch tƣơng tự ruột non sau Oxytocin bị phá hủy gần nhƣ hồn tồn (99,39%), hợp chất đƣợc Pegyl hóa bị phá hủy 54,8% Nhƣ vậy, hợp chất liên hợp cho thấy khả bảo vệ tốt Oxytocin môi trƣơng dịch tƣơng tự ruột non thử nghiệm invitro + Sau môi trƣờng tƣơng tự dịch dày, Oxytocin bị phá hủy 92,7% Oxytocin-PEG bị phá hủy 61,64% Cũng cho thấy đƣợc khả bảo vệ Oxytocin tốt hợp chất đƣợc Pegyl hóa mơi trƣờng dịch vị 54 KẾT LUẬN Đã tạo đƣợc phức hợp Oxytocin-PEG thực nghiệm nghiên cứu Điều kiện phản ứng phù hợp đƣợc xác định pH 4,5 với tỷ lệ 41,5 mg mPEG aldehyd 8,3 mg Oxytocin - Hiệu suất hình thành hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG dung dịch sau sắc ký lọc gel 62,37 ± 4,31% - Xác định đƣợc hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG có khối lƣợng phân tử 6,1 kDa, chứng minh phân tử hợp chất có phân tử mPEG aldehyd gắn với phân tử Oxytocin Phân tách đƣợc sản phẩm liên hợp dung dịch dạng bột đông khô vô định hình màu gần nhƣ trắng - Đơng khơ hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG dƣới dạng bột vơ định hình với hiệu suất thu hồi 60,39 ± 2,62% * Xác định đƣợc Oxytocin đƣợc bảo vệ tốt dạng liên hợp với Methoxy polyethylene glycol propion aldehyd, mơi trƣờng tƣơng tự dịch đƣờng tiêu hóa thử nghiệm invitro - Trong dung dịch tƣơng tự dịch dày dịch ruột Oxytocin bị phá hủy mạnh sản phẩm liên hợp với mPEG aldehyd (p 0,05), phá hủy hai hợp chất không đáng kể KIẾN NGHỊ - Thực nghiên cứu nhằm hồn thiện quy trình kỹ thuật để tổng hợp đƣợc hợp chất Oxytocin-PEG đạt hiệu cao Phát triển áp dụng quy mô sản xuất lớn tạo hợp chất liên hợp Pegyl hóa protein làm thuốc Đồng thời xây dựng tiêu chuẩn đánh giá khác nhằm xác định thêm đặc điểm độ tinh khiết của hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ môn Dƣợc lý - trƣờng Đại học Y Hà Nội (2010), Dược lý học lâm sàng, NXB Y học, Hà Nội Bộ Y tế (2007), Dược lý học, NXB Y học, Hà Nội Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, Hà Nội Bộ Y tế (2009), Hóa sinh học, NXB Y học, Hà Nội Bộ Y tế (2015), Dược thư quốc gia Việt Nam 2, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Lê Nguyễn Phúc Sơn (2007), “Thiết lập quy trình điện di protein SDSPAGE ứng dụng đánh giá phản ứng lúa với thuốc sinh học kích kháng”, tr 9-19, trƣờng Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương Pháp Cô Lập Hợp Chất Hữu Cơ, NXB Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh, Hồ Chí Minh Nguyễn Quốc Khƣơng Anh (2014), Sắc ký lọc gel ứng dụng, trƣờng Đại học Bách khoa Hồ Chí Minh, Hồ Chí Minh Nguyễn Văn Mùi (2007), Thực hành hóa sinh học, tr 130-131, NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội, Hà Nội 10 Nguyễn Văn Rƣ (2017), “Tạo chế phẩm insulin Pegyl hóa đánh giá số đặc tính chế phẩm để dùng y dƣợc”, Tạp chí dược học, tập 57 (số 6), tr 55-59 11 Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng (1999), Hóa sinh học, tr 3-39, NXB Giáo Dục, Hà Nội Tiếng Anh 12 Alconcel, Baas and Maynard (2011), “RAFT synthesized copolymers and conjugates designed for therapeutic delivery of siRNA”, Polym Chem 2, pp 1442-1448 13 Avanti C., Hinrichs, Casini (2013), “Leachable Diphenylguanidine from Rubber Closures Used in Pre-Filled Syringes: A Case Study to Understand Solid and Solution Interactions with Oxytocin”, J Pharm Sci 102, pp 1734-1741 14 Avanti C., Oktaviani, Hinrichs, Frijlink and Mulder (2013), “Binding of Cu+ and Cu2+ with peptides: Peptides oxytocin, Arg vasopressin, bradykinin, angiotensin, substance, somatostatin, and neurotensin”, Int J.Pharm 444, pp 139-145 15 Balan S., Choi J W., Godwin A., Teo I., Laborde C M., Heidelberger S., Zloh M., Shaunak S., Brocchini S (2007), “Site-specific PEGylation of protein disulfide bonds using a three-carbon bridge” Bioconjug Chem 18(1), pp 61-76 16 Ban H., Nagano M., Gavrilyuk J., Hakamata W., Inokuma T., Barbas C.F (2013), “Facile and stabile linkages through tyrosine: bioconjugation strategies with the tyrosine-click reaction”, Bioconjug Chem 24(4), pp 520 17 Barth T., Krejcí I., Kupková B., Jost K., “Pharmacology of cyclic analogues of deamino-oxytocin not containing a disulphide bond” Eur J Pharmacol 24(2), pp 183 18 Baxter, Ellen W., Reitz, Allen B (2004) "Reductive Aminations of Carbonyl Compounds with Borohydride and Borane Reducing Agents", In Overman, Larry E Organic Reactions, pp 714 19 Bossmar (1994), “Receptors for and myometrial responses to Oxytocin and vasopressin in preterm and term human pregnancy: effects of the Oxytocin antagonist atosiban” Am J Obstet Gyneco 171(6):1634-42 20 Caparrotta T M , Evans M., (2014), “Pegylated Insulin Lispro (LY2605541) a new basal Insulin analogue”, Diabetes Obes Metab 16(5):388-95, pp 388 21 Carine Bertolla , Stéphanie Rolina, Brigitte Evrardb, Lionel Pocheta, Bernard Masereel (2008), “Synthesis and pharmacological evaluation of a new targeted drug carrier system: β-Cyclodextrin coupled to oxytocin” Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 18(6), pp 1855-1858 22 Cline G W and Hanna S B (1987), “The aminolysis of Nhydroxysuccinimide esters”, Am Chem Soc 109(10), pp 3087–3091 23 Chan W Y anh du Vigneaud (1962), “Comparison of the pharmacologic properties of oxytocin and its highly potent analogue, desaminooxytocin” Endocrinology 71, pp 82 24 Cheng Yang, Diannan Lu and Zheng Liu, (2011), “How Pegylation Enhances the Stability and Potency of Insulin: A Molecular Dynamics Simulation”, Biochemistry 50 (13), pp 2585-2593 25 Choi J, Godwin A, Balan, Bryant, Cong, Pawlisz, Porssa, Rumpf, Singh and Brocchini (2009), “Pegylated Protein Durgs: Basic Science and Clinical Applications”, Bioconjug Chem 14(4) pp 47-72 26 Christina Avanti (2012), Innovative strategies for stabilization of therapeutic peptides in aqueous formulations, pp 284-290, Faculty of Mathematics and Natural Sciences of the University of Groningen 27 De Araujo A D., Mobli, Castro J., Harrington A M (2014), “Selenoether oxytocin analogues have analgesic properties in a mouse model of chronic abdominal pain” Nat Commun 5, pp 3165 28 Francesco M Veronese and Gianranco Pasut (2005), “Pegylation successful approach to drug delivery”, Drug Discovery Today 10(21), pp 1451-1458 29 Francesco M Veronese (2000), Peptide and Protein Pegylation a review of problems and solutions, pp 405-417, University of Padova, Italy 30 Gard J.W., Alexander J.M., Bawdon R.E., Albrecht J.T (2002), “Oxytocin preparation stability in several common obstetric intravenous solutions” Am J Obstet Gynecol 186(3), pp 496-498 31 Gary W Cline, and Samir B Hanna (1988) “Kinetics and mechanisms of the aminolysis of N-hydroxysuccinimide esters in aqueous buffers”, J Org Chem 53 (15), pp 3583-3586 32 George W Anderson, Zimmerman and Callahan (1964), “The Use of Esters of N-Hydroxysuccinimide in Peptide Synthesis”, J Am Chem Soc 86 (9), pp 1839-1842 33 Hawe A., Poole R., Romeijn S., Kasper P., van der Heijden R., Jiskoot W (2009), “Towards heat - stable oxytocin formulations: analysis of degradation kinetics and identification of degradation products”, Pharm Res 26(7), pp 1679-1688 34 Healthcare Bio-Sciences (2009), The Recombinant Protein Handbook Imagination at work, Sweden 35 Helmut D (1969), “Gel Chromatography, Gel Filtration, Gel Permeation, Molecular Sieves”, A Laboratory Handbook, Springer-Verlag 36 Hope and Vigneaud (1962), J Biol Chem 237, pp 314-315 37 Houchin M L., Heppert K., Topp E.M (2006), “Deamidation, acylation and proteolysis of a model peptide in PLGA films”, J Control Release 112(1), pp 111 38 Hudnut P S and Cook G P (2004), “Oxytocin controlled release formulations and methods of using same”, Patent WO2004078147 39 Jan M Antosiewicz, David Shugar (2016), “UV–Vis spectroscopy of tyrosine side-groups in studies of protein structure”, Selected applications 8(2), pp 163-177 40 Jankowski M., Danalache B., Wang D (2004) "Oxytocin in cardiac ontogeny", Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101(35), pp 102 41 Jennifer Collins, Kristian Kempe, Paul Wilson, Michelle P McIntosh, Thomas P Davis, Michael R Whittaker and David M Haddleton (2016), “Stability Enhancing N-Terminal PEGylation of Oxytocin Exploiting Different Polymer Architectures and Conjugation Approaches”, Biomacromolecules 17 (8), pp 2755-2766 42 Johnson J A, Van Deventer and Tirrell D A (2010), Curr Opin Chem Biol 14, pp 774-780 43 Johnson K A (1997), “Preparation of peptide and protein powders for inhalation”, Adv Drug Deliv Rev 26(1), pp.3-15 44 Jones M W., Strickland R A., Schumacher F.F., Caddick S., Baker J R., Gibson M I , Haddleton D M (2012), “Polymeric dibromomaleimides as extremely efficient disulfide bridging bioconjugation and pegylation agents”, J Am Chem Soc 134(3), pp 52 45 Kim C H., Axup J Y., Schultz P G (2013), “Protein conjugation with genetically encoded unnatural amino acids”, Curr Opin Chem Biol 17 (3), pp 412-419 46 Klok H A (2005), “Biological-synthetic hybrid block copolymers”, J Polym Sci Part A Polym Chem 43, pp 1-17 47 Kumar V., Madabushi R., Derendorf H., Boothby L A., Breland B D., Hatton R C and Doering P L (2006), Introduction into Theory and Practice, Deutscher Apotheker -Verlag, Stuttgart, Germany 48 Lecolley F., Tao L., Mantovani G., Durkin I., Lautru S and Haddleton D M (2004),“A new approach to bioconjugates for proteins and peptides (“pegylation”) utilising living radical polymerisation”, Chemical Communications, pp 2026-2027 49 Masri M S., Friedman M (1988), “Protein reactions with methyl and ethyl vinyl sulfones”, J Protein Chem 7(1), pp 49-54 50 Maton, Anthea, Jean Hopkins, Charles William Mc Laughlin, Susan Johnson, Maryanna Quon Warner, David LaHart, Jill D Wright (1993) Human Biology and Health, Englewood Cliffs, New Jersey, USA Prentice Hall 51 Morpurgo M., Veronese F M., Kachensky D., Harris J M (1996), “Preparation of characterization of poly(ethylene glycol) vinyl sulfone”, Bioconjug Chem 7(3), pp 363-368 52 Muttenthaler M., Andersson A., de Araujo A D , Dekan Z., Lewis R J., Alewood P F (2010) “Modulating oxytocin activity and plasma stability by disulfide bond engineering”, J Med Chem 53(24) 53 Peng L., Calton G.J., Burnett J.W (1987), “Effect of borohydride reduction on antibodies, Appl Biochem Biotechnol 4(2) 54 Prankerd R J., Nguyen T H., Coleman H A., Morton D A., McIntosh M P “Pulmonary delivery of an ultra-fine oxytocin dry powder formulation: potential for treatment of postpartum haemorrhage in developing countries”, PLoS One 8(12) 55 Ranganath S , Bhandari A., Avitahl Curtis N., Mc Mahon J (2015), “Characterization of a Potent Interleukin-6 Binding Peptide with Neutralizing Activity In Vivo”, PLoS One 10(11) 56 Rath W (2009), “Prevention of postpartum haemorrhage with the oxytocin analogue carbetocin”, Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 147(1), pp 15-20 57 Richard Borch (1988), "Reductive Amination with Sodium yanoborohydrid: N,N-Dimethylcyclohexylamine", Organic Synthese, Collective Volume 6, p 499 58 Richard F Borch, Mark D Bernstein, and H Dupont Durst (1971), “Cyanohydridoborate anion as a selective reducing agent”, J Am Chem Soc 93 (12), pp 2897-2904 59 Ryan, Sinéad M., Frías, Jesús M., Wang, Xuexuan, Sayers (2011), “PK/PD modelling of combed-shaped PEGylated salmon calcitonin conjugates of differing molecular weights”, Journal of Controlled Release 149 (2), pp.126-132 60 Sandler S R., Karo W., Bonesteel J., Pearce E M (1998), Polymer Synthesis and Characterization, A Laboratory Manual Academic Press, San Diego 61 Schumacher, Nobles, Ryan, Smith, Tinker, Caddick and Baker (2011), “State of the art in PEGylation: The great versatility achieved after forty years of research”, Bioconjug Chem 22, pp 132–136 62 Smith C V and Ferger M F (1976), J Med Chem 19, pp 250-254 63 Smith M E., Schumacher F F., Ryan C P., Tedaldi L M., Papaioannou D., Waksman G., Caddick S., Baker J.R (2010), “Protein modification, bioconjugation, and disulfide bridging using bromomaleimides”, J Am Chem Soc 132(6) 64 Takayanagi Y., Yoshida M., Bielsky I F., Ross H E.,( 2005), "Pervasive social deficits, but normal parturition, in Oxytocin receptor-deficient mice", Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (44), pp 102 65 Tao Hu, Muthuchidambaram Prabhakaran, Seetharama A Acharya, and Belur N Manjula (2005) “Influence of the chemistry of conjugation of poly (ethylene glycol) to Hb on the oxygen-binding and solution properties of the PEG-Hb conjugate”, Biochem J 392(Pt 3), pp 64 66 Turro, Nicholas J., Yekta, Ahmad (1978), "Luminescent probes for detergent solutions A simple procedure for determination of the mean aggregation number of micelles" Journal of the American Chemical Society 100(18), pp 5951-5952 67 Thomas Bruckdorfer (2007), Pegylation the magic wand, p 34-40 68 Thornton J M (1981), “How are close residues of protein structures distributed in primary sequence”, J Mol Bio 151, pp 261-287 69 Trathnigg B (1995), “Determination of MWD and Chemical Composition of Polymers by Chromatographic Techniques”, Prog Polym Sci 20, pp 615-650 70 Uchio T., Baudys M., Liu F., Song S C., and Kim S W (1999), “Sitespecific Insulin conjugates with enhanced stability and extended action profile” Adv Drug Deliv Rev 35, pp 289-306 71 Van Dongen P W., Van Roosmalen J., De Boer C N and Van Rooij (1991), Pharm Weekbl Sci13, pp 238-243 72 Walter R., Schwartz I L., Darnell J H., Urry D W.(1971), “Relation of the conformation of oxytocin to the biology of neurohypophyseal hormones” Proc Natl Acad Sci USA 68(6), pp 73 Wang W (2000) “Lyophilization and development of solid protein pharmaceutical”, Int J Pharm 203(1-2), pp.1-60 74 Wilson P., Anastasaki A., Owen MR., Kempe K., Haddleton, Mann S K., Johnston A P., Quinn J F., Whittaker M R., Hogg P J., Davis T P (2015), “Organic arsenicals as efficient and highly specific linkers for protein/peptide-polymer conjugation”, J Am Chem Soc137(12), pp 22 75 Wiśniewski K., Finnman J., Flipo M., Galyean R., Schteingart (2013) “On the mechanism of degradation of oxytocin and its analogues in aqueous solution”, Biopolymers 100(4) 76 Yoh Kodera, Ayako Matsushima, Misao Hiroto, Hiroyuki Nishimura, Ashako Ishii, Tomoo Ueno, Yuji Inada (1998), “Pegylation of proteins and bioactive substances for medical and technical applications”, Pro Polym Sci Vol 23, pp 1235 77 Yong Woo Cho, Jae Hyung Park, Kinam Park (2007), “Pegylation camouflage of protein, cells and nanoparticles agianst recognition by the body’s defense mechanism”, Handbook of pharmaceutical biotechnology, pp 444-451 ... GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THANH NGHỊ NGHIÊN CỨU TẠO SẢN PHẨM LIÊN HỢP OXYTOCIN - PEG ĐỂ LÀM THUỐC CÓ KHẢ NĂNG BẢO VỆ ĐƢỢC OXYTOCIN TRONG ĐƢỜNG TIÊU HÓA LUẬN VĂN THẠC... đƣợc khả làm tăng độ bền phân tử Oxytocin dịch sinh học invitro, góp phần nhằm thay đổi đƣờng dùng Oxytocin, tiến hành đề tài: Nghiên cứu tạo sản phẩm liên hợp Oxytocin - PEG để làm thuốc có khả. .. protein hợp chất liên hợp 35 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 37 3.1 LIÊN HỢP mPEG aldehyd VỚI OXYTOCIN VÀ ĐÁNH GIÁ TỶ LỆ HÌNH THÀNH HỢP CHẤT LIÊN HỢP 37 3.1.1 Tổng hợp sản phẩm liên hợp