ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÒNG CÁ RÔ PHI ĐỎ ( Oreochromis spp ) TÍCH HỢP CHO CHƯƠNG TRÌNH CHỌN GIỐNG BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DỊNG CÁ RƠ PHI ĐỎ (Oreochromis spp) TÍCH HỢP CHO CHƯƠNG TRÌNH CHỌN GIỐNG BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : ĐỖ BẢO TRÂM ANH Niên khóa : 2007 – 2011 Tháng năm 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DỊNG CÁ RƠ PHI ĐỎ (Oreochromis spp) TÍCH HỢP CHO CHƯƠNG TRÌNH CHỌN GIỐNG BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS BÙI THỊ LIÊN HÀ ĐỖ BẢO TRÂM ANH Tháng năm 2011 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tơi xin trân trọng gửi lòng biết ơn đến ThS Bùi Thị Liên Hà, người tận tình hướng dẫn, định hướng đề tài truyền đạt kinh nghiệm, tạo điều kiện tốt cho thực đề tài tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Nguyễn Điền, người hết lòng bảo, nhận xét, sửa lỗi luận văn cho tơi lời khun q giá để hồn thành khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Cử nhân Cơng nghệ sinh học Lê Chính tận tình giúp đỡ tơi nhiều suốt q trình làm việc phòng thí nghiệm Con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ bố mẹ chỗ dựa vững tinh thần tạo điều kiện cho học tập tốt Đồng thời, xin chân thành cảm ơn:  Ban lãnh đạo Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II  Ban Chủ nhiệm, Thầy, Cô Bộ môn Công nghệ sinh học hỗ trợ tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Đồng chân thành gửi lời cảm ơn đến Anh, Chị Phòng sinh học thực nghiệm, bạn sinh viên Cơng nghệ sinh học khóa 2007 làm đề tài Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II nhiệt tình giúp đỡ hỗ trợ tơi suốt q trình thực đề tài, lúc khó khăn TP Hồ Chí Minh, tháng năm 2011 Đỗ Bảo Trâm Anh iii TĨM TẮT Cá rơ phi nói chung cá rơ phi đỏ nói riêng ni rộng rãi giới Cá rô phi đối tượng nuôi triển vọng, thị trường có nhu cầu tăng nhanh Nghề nuôi cá rô phi châu Á mở rộng kết việc nâng cao kỹ thuật ni trồng chất lượng giống Vì thế, chương trình chọn giống khoa học đóng vai trò quan trọng hệ thống nuôi trồng thủy sản nhằm nâng cao hiệu kinh tế việc sản xuất Sáu microsatellite sử dụng để khảo sát mức độ đa dạng di truyền hai dòng cá rơ phi đỏ có nguồn gốc từ Ecuador Malaysia nhằm phục vụ cho công tác chọn giống Sáu microsatellite sử dụng cho đa hình mẫu phân tích, số lượng allele dao động từ đến allele locus Các locus có số lượng allele lớn UNH216, UNH231 UNH159 với số allele Locus có số lượng allele UNH172 với allele Số lượng allele tổng số dòng 32 lớn so số lượng allele tổng số dòng 29 Gía trị allele trung bình dòng 5,3 lớn so với giá trị allele trung bình dòng 4,8 Dị hợp tử phát có ý nghĩa sáu locus từ 0,25 đến 0,87 Gía trị FIS dao động từ thấp 0,089 locus OM05 cao 0,417 locus UNH231 Sự thiếu hụt dị hợp tử có ý nghĩa phát hầu hết locus cho thấy mức độ cận huyết đáng quan tâm hai dòng cá nghiên cứu Giá trị FST cho thấy khơng có nhiều khác biệt di truyền có ý nghĩa hai dòng cá Từ kết đề tài cho thấy nên tiến hành lai tạo hai dòng cá với quần đàn cá rô phi đỏ khác nhằm làm tăng biến dị di truyền phục vụ cho cơng tác chọn giống tốt góp phần giữ nguồn gene đa dạng cho việc chọn lọc tính trạng khác tương lai iv SUMMARY Thesis title: Genetic diversity of red tilapia broodstock populations (Oreochromis spp) using microsatellite markers The tilapia, specifically red tilapia, have become globally important aquatic species produced in many countries worldwide Many farmers prefer to cultivate red tilapia since it is much sought after in certain markets and the demand for this fish tends to increase in the future Red tilapia aquaculture in Asia has been expanding as a result of the improvement in production technology and in seed quality Thus, a sound breeding program is a necessary part of the total aquaculture production system to improve the economic efficiency of production In this study, six microsatellite markers were applied to quantify the genetic diversity within and between two red tilapia races originated from Ecuador and Malaysia for use in subsequent breeding programs Six microsatellite loci were found to be polymorphic in all accessions The number of alleles produced from each marker ranged from four to six The loci UNH216, UNH231 and UNH159 produced the highest number of alleles at six The lowest number of alleles was observed at locus UNH172 with four alleles The total number of alleles of first race was higher at a value of thirty-two, than that of second race with a value of twenty-nine The mean number of alleles of first race was higher at a value of 5.3, than that of second race with a value of 4.8 The observed heterozygosity of the six loci ranged from 0.25 to 0.87 FIS value ranged from 0.089 at locus OM05 to 0.417 at locus UNH231 A statistically significant heterozygosity deficit was detected across almost all of loci that showed the risk of inbreeding level within the two races FST value showed no significant genetic differentiation between the two red tilapia races Results suggest that it should make hybridizations between the two red tilapia races and other populations to improve genetic variation for better breeding programs and to manage and conserve diversity of genetic source for selection of other traits in the future v MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN iii TÓM TẮT iv SUMMARY v MỤC LỤC vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix DANH SÁCH CÁC BẢNG x DANH SÁCH CÁC HÌNH xi Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu tổng quan cá rô phi đỏ (Red tilapia) 2.1.1 Phân loại 2.1.2 Đặc điểm sinh học cá rô phi đỏ 2.1.3 Giá trị kinh tế cá rô phi đỏ 2.1.4 Đặc điểm dòng cá rơ phi đỏ nghiên cứu đề tài 2.1.4.1 Dòng cá rơ phi đỏ nhập từ Ecuador 2.1.4.2 Dòng cá rơ phi đỏ nhập từ Malaysia 2.2 Nghiên cứu kỹ thuật 2.2.1 Ly trích DNA 2.2.2 Định lượng DNA cách đo mật độ quang 2.2.3 Giới thiệu kỹ thuật PCR 2.2.3.1 PCR 2.2.3.2 Nguyên tắc phản ứng PCR 2.3 Di truyền quần thể 2.3.1 Một số khái niệm 2.3.1.1 Quần thể vi 2.3.1.2 Locus, gene allele 2.3.1.3 Vốn gene (gene pool) 10 2.3.2 Sự đa dạng di truyền quần thể 10 2.3.2.1 Đa dạng di truyền 10 2.3.2.2 Nguyên nhân dẫn đến đa dạng di truyền quần thể .10 2.4 Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể 11 2.4.1 Các thị hình thái 11 2.4.2 Các thị isozyme 11 2.4.3 Các thị DNA 12 2.4.4 Chỉ thị SSR 13 2.4.4.1 Khái niệm microsatellite 14 2.4.4.2 Cơ chế hình thành microsatellite .14 2.4.4.3 Nguyên tắc phát microsatellite primer SSR .15 2.4.4.4 Vai trò microsatellite 17 2.5 Ứng dụng microsatellite nghiên cứu đa dạng di truyền .18 2.5.1 Những nghiên cứu đa dạng di truyền nước 18 2.5.2 Những nghiên cứu đa dạng di truyền giới 19 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .20 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 20 3.2 Vật liệu 20 3.2.1 Các dòng cá rơ phi đỏ nghiên cứu 20 3.2.2 Hóa chất thí nghiệm 20 3.2.2.1 Primer 20 3.2.2.2 Các hóa chất dùng ly trích DNA 21 3.2.2.3 Các hóa chất dùng phản ứng PCR 21 3.2.2.4 Các hóa chất dùng điện di agarose 22 3.2.3 Thiết bị thí nghiệm 22 3.3 Phương pháp nghiên cứu .22 3.3.1 Phương pháp ly trích DNA tổng số .22 3.3.2 Phương pháp tối ưu hóa phản ứng PCR khảo sát hoạt động primer 24 3.3.2.1 Khảo sát nhiệt độ bắt cặp 25 vii 3.3.2.2 Khảo sát nồng độ MgCl2 25 3.3.2.3 Khảo sát tính ổn định phản ứng PCR 25 3.3.3 Phương pháp phân tích đa dạng di truyền dòng cá rô phi đỏ 26 3.3.3.1 Thực phản ứng PCR hàng loạt mẫu 26 3.3.3.2 Phân tích đa dạng di truyền dòng cá rơ phi đỏ phần mềm 27 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .28 4.1 Sản phẩm ly trích DNA .28 4.2 Khảo sát tính hoạt động cặp primer tối ưu hóa phản ứng PCR 29 4.2.1 Khảo sát nhiệt độ bắt cặp tối ưu 29 4.2.2 Khảo sát nồng độ MgCl2 tối ưu 31 4.2.3 Khảo sát tính ổn định phản ứng PCR 32 4.3 Khảo sát đa dạng di truyền dòng cá rô phi đỏ nghiên cứu đề tài 33 4.3.1 Kết PCR 60 mẫu dòng 53 mẫu dòng 33 4.3.2 Đặc điểm di truyền dòng cá rô phi đỏ nghiên cứu đề tài 35 4.3.3 Đánh giá số cận huyết 39 4.3.4 Kiểm tra cân Hardy - Weinberg 39 4.3.5 Đánh giá khác biệt di truyền dòng cá rơ phi đỏ 40 4.4 Đánh giá tổng qt tính đa dạng di truyền dòng cá rô phi đỏ 40 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42 5.1 Kết luận 42 5.2 Đề nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 PHỤ LỤC viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT µg: microgram µl: microlite µM: micromol/lite AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism Ar: allelic richness bp: base pair DMSO: Dimethyl sulfoxide DNA: Deoxyribonucleic acid dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid GTE: Glucose-Tris-EDTA He: expected heterozygosity (dị hợp tử mong đợi) Ho: observed heterrozygosity (dị hợp tử phát hiện) ISSR: Inter Simple Sequence Repeats mM: milimolar (milimol/lite) Na: number of alleles per locus (số lượng allele locus) PCR: Polymerase chain reaction RAPD: Randomly Amplified Polymorphic DNA RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism SDS: Sodium Dodecyl Sulphate SSR: Single sequence repeat STE: Sodium Chloride-Tris-EDTA Ta : Annealing tenperature TBE: Tris Borate EDTA Tm: Melting temperature VNTR: Variable Number Tamdem Repeat) ix DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 So sánh chi chí lĩnh vực áp dụng số loại thị phân tử 12 Bảng 3.1 Các primer microsatellite dùng thí nghiệm 21 Bảng 3.2 Gradient nhiệt độ lai cho cặp microsatellite 25 Bảng 3.3 Khảo sát nồng độ MgCl2 cho cặp microsatellite 25 Bảng 3.4 Thành phần buffer, dNTP, primer, DNA, Taq cho phản ứng PCR 26 Bảng 3.5 Chu trình nhiệt máy PCR sau tối ưu nhiệt độ bắt cặp 26 Bảng 4.1 Nhiệt độ bắt cặp thích hợp cho cặp primer microsatellite 30 Bảng 4.2 Nồng độ MgCl2 tối ưu cặp primer microsatellite 32 Bảng 4.3 Thể tích H2O cho phản ứng PCR 32 Bảng 4.4 Tóm tắt kết khảo sát 10 mẫu cá rô phi đỏ 33 Bảng 4.5 Đặc điểm đa dạng di truyền dòng cá rô phi đỏ 36 x Sau tiến hành tối ưu hóa nồng độ MgCl2 mẫu DNA (trong đề tài sử dụng mẫu mẫu 10) 10 mẫu DNA ly trích từ 10 mẫu vây ngực cá rơ phi đỏ thu ngẫu nhiên chương trình chọn giống, nhận thấy nồng độ MgCl2 cao 3,75 mM cặp primer UNH231 Nồng độ MgCl2 thấp 1,25 mM cặp primer OM05 UNH172 Hai cặp primer có nồng độ MgCl2 UNH159 OM02 với giá trị nồng độ MgCl2 3,125 mM Và cặp primer UNH216 có nồng độ MgCl2 tối ưu 2,5 mM (bảng 4.2) Dựa vào nồng độ MgCl2 thích hợp cho cặp primer, biết thể tích MgCl2 H2O cho cặp primer microsatellite phản ứng PCR với tổng thể tích phản ứng 20 µl (bảng 4.3) Bảng 4.2 Nồng độ MgCl2 tối ưu cặp primer microsatellite cho phản ứng PCR Primer OM02 OM05 UNH216 UNH231 UNH172 UNH159 MgCl2 (mM) 3,125 1,25 2,5 3,75 1,25 3,125 Bảng 4.3 Thể tích MgCl2 H2O cho phản ứng PCR Primer OM02 OM05 UNH216 UNH231 UNH172 UNH159 MgCl2 (µl) 2,5 2,5 H2O (µl) 10,25 11,75 10,75 9,75 11,75 10,25 Hồn tất q trình tiến hành tối ưu hóa nồng độ MgCl2 cho cặp primer microsatellite đề tài với độ lặp lại lần, cung cấp kết nồng độ MgCl2 tối ưu cho cặp primer tiến tới thực phản ứng PCR với 10 mẫu DNA ly trích nhằm tiếp tục kiểm tra độ hoạt động primer với tính ổn định phản ứng PCR 4.2.3 Khảo sát tính ổn định phản ứng PCR Sau có kết nhiệt độ bắt cặp nồng độ MgCl2 tối ưu cho cặp primer, tiếp tục thực phản ứng PCR với 10 mẫu DNA ly trích từ 10 mẫu vây ngực cá rơ phi đỏ thu ngẫu nhiên Trung tâm Quốc Gia giống thủy sản nước Nam Bộ – Cái Bè – Tiền Giang trình bày Chương Mục đích việc thực phản ứng PCR nhằm tiếp tục kiểm tra độ hoạt động primer, đồng thời kiểm tra tính ổn định phản ứng sau tối ưu hóa Kết chạy PCR cho 10 mẫu DNA với cặp primer trình bày bảng 4.4 32 Bảng 4.4 Tóm tắt kết khảo sát 10 mẫu cá rô phi đỏ ngẫu nhiên với nhiệt độ bắt cặp nồng độ MgCl2 tối ưu Mẫu Primer OM02 OM05 UNH216 UNH231 UNH172 UNH159                                   Có sản phẩm khuếch đại             10            Dựa vào bảng 4.4 thấy phản ứng PCR đạt kết 80 – 90% Cụ thể, cặp primer UNH216, UNH231, UNH172, UNH159 cho sản phẩm 10 phản ứng Đối với primer OM05 có 9/10 phản ứng PCR đạt hiệu Và primer OM02 primer có số phản ứng PCR đạt hiệu thấp primer microsatellite – 8/10 phản ứng PCR đạt hiệu Từ kết khả quan đạt được, cho thấy tính hoạt động cặp primer microsatellite tốt kết nhiệt độ bắt cặp tối ưu, nồng độ MgCl2 tối ưu góp phần làm cho phản ứng PCR ổn định 4.3 Khảo sát đa dạng di truyền dòng cá rô phi đỏ nghiên cứu đề tài 4.3.1 Kết PCR 60 mẫu dòng 53 mẫu dòng Qua kết tối ưu cặp microsatellite, tiếp tục tiến hành phân tích đánh giá tính đa dạng di truyền 60 mẫu thu dòng 53 mẫu thu dòng nhằm phân tích đa dạng di truyền Phản ứng PCR thực với cặp primer microsatellite Sản phẩm khuếch đại kiểm tra phương pháp điện di gel agarose 2%, điện 100 V, thời gian 60 phút Việc chọn tỷ lệ % agarose để điện di phải phù hợp với kích thước sản phẩm khuếch đại Đối với sản phẩm khuếch đại lớn 500 bp nên dùng agarose 1,5%, sản phẩm khuếch đại kích thước 100 bp nên dùng agarose 2,5% (Phạm Hùng Vân, 2002) Do đó, chọn nồng độ agarose 2% để chạy điện di sản phẩm khuếch đại cặp primer nằm khoảng 120 – 390 bp 33 Hình 4.4 Kết điện di sản phẩm PCR sử dụng primer OM05 cho mẫu DNA 25 - 37 ly trích từ dòng Hình 4.5 Kết điện di sản phẩm PCR sử dụng primer UNH159 cho mẫu DNA 14 - 26 ly trích từ dòng Hình 4.4 4.5 minh họa cho kết điện di sản phẩm PCR sử dụng primer OM05 UNH159 Primer OM05 khuếch đại 13 mẫu dòng (từ mẫu DNA số 25 đến mẫu DNA số 37) Dựa vào kết điện di cho thấy sản phẩm PCR diện 13 mẫu này, chứng tỏ primer OM05 hoạt động tốt nhiệt độ bắt cặp nồng độ MgCl2 tối ưu Đồng thời band gel quan sát rõ nét, điều giúp hạn chế sai sót tiến hành xác định kích thước sản phẩm PCR dựa vào thang chuẩn gel điện di (hình 4.4) Tương tự primer UNH159, mẫu DNA khuếch đại 13 mẫu dòng (bắt đầu từ DNA số 14 đến DNA số 26) Căn vào kết điện di, sản phẩm PCR diện 13 mẫu này, nhiên mẫu số 23, band quan sát điện di mờ (hình 4.5) Tuy có trường hợp band quan sát khơng rõ, nói primer UNH159 hoạt động tốt cho kết PCR tất 34 mẫu khuếch đại, band quan sát rõ nét, có band bị mờ, điều cho thấy primer UNH159 hoạt động tốt nhiệt độ bắt cặp nồng độ MgCl2 sau tối ưu Thực phản ứng khuếch đại với cặp primer 60 mẫu dòng 53 mẫu dòng Quan sát kết điện di thu từ phản ứng khuếch đại, cho thấy có trung bình allele primer (locus) Vì đến nhận xét bước đầu có đa hình dòng cá rơ phi đỏ nghiên cứu đề tài Tuy nhiên, việc xác định kích thước sản phẩm khuếch đại dựa vào thang chuẩn gel agarose thực tay, khơng tránh khỏi sai sót q trình thực đánh giá sai kích thước sản phẩm PCR, bỏ sót số allele Bên cạnh đó, khơng có điều kiện để tiến hành phân tích sản phẩm PCR lần gel polyacrylamide, khơng phân biệt allele có kích thước khác biệt từ – nucleotide Ngồi ra, số lượng mẫu tiến hành nghiên cứu chưa đủ lớn, nghiên cứu đa dạng di truyền, số lượng mẫu thử nghiệm yếu tố quan trọng, nhiều mẫu phân tích tính độ tin cậy kết có ý nghĩa thống kê Hoặc trình thao tác phản ứng PCR làm nhiễm số mẫu; có khả trình load sản phẩm PCR vào giếng điện di làm trào sản phẩm PCR sang giếng bên cạnh; yếu tố góp phần làm ảnh hưởng đến kết PCR điện di Từ tất vấn đề nêu trên, cho thấy yếu tố làm ảnh hưởng tới việc đánh giá đa dạng di truyền dòng cá rơ phi đỏ nghiên cứu đề tài Sau có kết điện di từ phản ứng khuếch đại, tiếp tục tiến hành thống kê kích thước allele cá thể Sau đó, số liệu đưa vào phầm mềm Arlequin Fstat để xử lý, từ đưa giá trị số allele locus (Na), dị hợp tử phát (Ho), dị hợp tử mong đợi (He), giá trị allelic richness (A r), số cận huyết FIS số FST Dựa vào số đưa ra, đánh giá đa dạng di truyền dòng cá rơ phi đỏ nhằm tích hợp cho chương trình chọn giống 4.3.2 Đặc điểm di truyền dòng cá rô phi đỏ nghiên cứu đề tài Sau xử lý số liệu phần mềm Arlequin Fstat, tổng hợp giá trị số allele locus (Na), dị hợp tử phát (Ho), dị hợp tử mong đợi (He), phong phú allele (Ar), số cận huyết FIS Các số trình bày bảng 4.5 35 Bảng 4.5 Đặc điểm đa dạng di truyền microsatellite dòng cá rơ phi đỏ nghiên cứu Mẫu Locus Dòng Dòng (2) (3) N 60 53 Na Ho 0,63333 0,50000 He 0,74888 0,70768 Ar 5,953 4,000 FIS 0,155 0,296 N 60 53 Na 5 Ho 0,87273 0,65957 He 0,76781 0,72318 Ar 5,980 5,000 FIS -0,138 0,089 N 60 53 Na Ho 0,50000 0,50000 He 0,81359 0,69838 Ar 6,000 5,000 FIS 0,387 0,286 N 60 53 Na Ho 0,45763 0,53846 He 0,78198 0,69623 Ar 6,757 4,904 FIS 0,417 0,228 (1) OM02 OM05 UNH216 UNH231 36 Bảng 4.5 (tt) Đặc điểm đa dạng di truyền microsatellite dòng cá rơ phi đỏ nghiên cứu (1) UNH159 UNH172 Trung bình (2) (3) N 60 53 Na 6 Ho 0,55738 0,63265 He 0,76250 0,73995 Ar 6,946 5,999 FIS 0,271 0,146 N 60 53 Na 4 Ho 0,25424 0,42553 He 0,41678 0,68291 Ar 3,999 4,000 FIS 0,392 0,379 Na 5,333 4,833 Ho 0,545885 0,542702 He 0,71526 0,70806 Ar 5,939 4,817 FIS 0,247 0,237 Số lượng cá thể phân tích (N), số lượng allele locus (Na), dị hợp tử phát (Ho), dị hợp tử mong đợi (He), phong phú allele (Ar), số cận huyết (FIS) Có thể thấy giá trị số lượng allele locus (Na), hệ số dị hợp tử phát mong đợi (Ho He), phong phú allele (A r) giá trị allele trung bình locus khơng có nhiều biến động dòng cá (bảng 4.5) Trên tổng số mẫu phân tích, số lượng allele locus dao động từ đến allele Số lượng allele tổng số dòng 32 lớn so với số lượng allele tổng số dòng 29 giá trị allele trung bình dòng 5,3 lớn so với giá trị allele trung bình dòng 4,8 Giá trị phong phú allele (Ar) trung bình dòng 5,9; nhận thấy giá trị lớn so giá trị phong phú allele trung bình dòng 4,8 Chỉ số Ar xác định cách chuẩn hóa biến dị allele nhóm mẫu có số lượng thống Như vậy, 37 vào số Ar để nhận xét bước đầu dòng cá rơ phi đỏ nghiên cứu đề tài đạt yêu cầu phân tích biến dị di truyền Sau phân tích kết quả, nhận thấy locus có số lượng allele lớn UNH216, UNH231, UNH159 với số allele Locus có số lượng allele UNH172 với allele Hình 4.6 Đồ thị so sánh tần số allele locus dòng cá rơ phi đỏ 38 Sau xử lý số liệu phần mềm Genepop giúp tổng hợp giá trị tần số allele locus dòng cá rơ phi đỏ nghiên cứu đề tài Có thể nhận thấy locus dòng cá rô phi đỏ nghiên cứu đề tài tồn allele có tần số xuất thấp, với giá trị nhỏ 0,1 (hình 4.1) Các allele dễ dàng bị khơng tiến hành lai dòng cá rơ phi đỏ với quần thể cá rô phi đỏ khác có nhiều biến dị di truyền nhằm làm giảm nguy bị allele này, từ giúp hạn chế thiếu hụt allele dòng cá rô phi đỏ nghiên cứu đề tài 4.3.3 Đánh giá số cận huyết Hệ số cận huyết F IS cho biết xác suất mà cá thể có cặp allele giống hệt từ tổ tiên chung; tỷ lệ locus mang allele giống hệt theo từ tổ tiên chung (Jenkins, 1990) Với giá trị FIS thống kê bảng 4.5, chúng tơi thấy có dòng 1, locus OM5 FIS < chứng tỏ cận huyết mong đợi (less inbreeding than expected) Ở trường hợp lại FIS > chứng tỏ cận huyết nhiều mong đợi (more inbreeding than expected) Gía trị FIS cần phải lưu ý dòng 1, trường hợp có giá trị F IS cao trình khảo sát locus UNH231 giá trị F IS 0,417; locus UNH172 giá trị FIS 0,392; locus UNH216 giá trị FIS 0,387 Trong dòng giá trị FIS thấp 0,3; có trường hợp locus UNH172 giá trị F IS 0,379 Nhìn chung, giá trị FIS hầu hết cho kết dương, cận huyết dòng cá khơng đáng lo ngại Tuy nhiên có cảnh báo mức độ cận huyết dòng (dòng cá rơ phi nhập từ Ecuador), đặc biệt locus UNH231, UNH172 UNH216 Việc cảnh báo mức độ cận huyết điều cần thiết chương trình chọn giống quần thể mức độ cận huyết cao dẫn đến tình trạng thiếu hụt dị hợp tử, khơng đảm bảo tiêu chuẩn chọn làm giống để tiến hành lai tạo số tính trạng tiến hành chọn lọc 4.3.4 Kiểm tra cân Hardy - Weinberg Từ bảng 4.5, cho thấy tất locus dòng cá rơ phi đỏ nghiên cứu đề tài có thiếu hụt dị hợp tử mong đợi có ý nghĩa (P < 0,05) vào giá trị dị hợp tử quan sát (Ho) dị hợp tử mong đợi (He) Cụ thể, giá trị Ho trung bình dòng 0,546 dòng 0,543; giá trị He trung bình dòng 0,715 dòng 39 0,708 Gía trị dị hợp tử quan sát (H o) thấp so với dị hợp tử mong đợi (H e) dòng cá nghiên cứu Sự xuất null allele kỹ thuật điện di sử dụng nghiên cứu khơng có khả phát allele có kích thước gần (khác biệt – nucleotide) microsatellite loci sử dụng giải thích cho tượng Như nhìn tổng thể dòng cá lệch khỏi cân Hardy – Weinberg (P = 0,0001 < 0,05) Sự thiếu hụt dị hợp tử (heterozygote deficiencies) thường xuyên đề cập tới nghiên cứu đối tượng thủy sản nuôi tự nhiên hai thị phân tử allozyme microsatellite (Launey ctv, 2001) Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu nhận đa dạng allele thường xảy nhanh so với việc dị hợp tử allele có tần suất thấp thường đóng góp vào giá trị dị hợp tử tổng thể (Norris ctv, 1999) Thực tế, mức độ dị hợp tử cao locus định nhóm qua chọn lọc (ngay có đa dạng allele lớn) so với nhóm chưa qua chọn (Bancroft ctv, 1995; Pemberton ctv, 1996) Do đó, đánh giá mức độ đa dạng allele thị tốt mức độ dị hợp tử, để đánh giá ảnh hưởng thực tế phương pháp áp dụng trại giống lên mức độ đa dạng di truyền quần đàn nuôi (Hedgecock Sly, 1990) 4.3.5 Đánh giá khác biệt di truyền dòng cá rơ phi đỏ Giá trị FST thước đo khác biệt quần thể, khoảng cách di truyền, dựa liệu đa hình di truyền Khi FST 0, chứng tỏ khơng có khác biệt quần thể, FST chứng tỏ quần thể hoàn toàn khác biệt (Harpending, 2002) Đối với dòng cá rơ phi đỏ nghiên cứu đề tài, sau xử lý số liệu phần mềm Fstat, chúng tơi có giá trị FST 0,101 Điều đồng nghĩa với việc dòng cá rơ phi đỏ có nguồn gốc từ Ecuador (dòng 1) dòng rơ phi đỏ có nguồn gốc từ Malaysia (dòng 2) nghiên cứu đề tài khác biệt 10% mặt di truyền Chúng nhận thấy dù có cách biệt địa lý mặt di truyền dòng khác biệt khơng đáng kể Do đó, chương trình chọn giống vào khác biệt địa lý để chọn cá thể bố mẹ Bởi cách biệt địa lý khơng thể nói lên khác biệt mặt di truyền 4.4 Đánh giá tổng qt tính đa dạng di truyền dòng cá rơ phi đỏ Sau phân tích dòng cá rơ phi đỏ nhập từ Ecuador dòng cá rô phi đỏ nhập 40 Malaysia ghi nhận giá trị allele trung bình hai dòng allele locus Từ kết đó, chúng tơi tiến hành so sánh với giá trị allele trung bình cá rô phi đỏ nghiên cứu tác giả Romana ctv (2004) nhận thấy hai dòng cá rô phi đỏ mà tiến hành nghiên cứu có giá trị allele trung bình thấp so với giá trị allele trung bình dòng cá rô phi đỏ nghiên cứu Romana ctv (7 allele locus) Như hai dòng cá rơ phi đỏ nghiên cứu đề tài có thiếu hụt allele, đồng thời có thiếu hụt dị hợp tử mong đợi có ý nghĩa (P = 0,0001) Bên cạnh đó, chúng tơi nhận thấy hai dòng cá rơ phi đỏ khơng có khác biệt di truyền lớn Qua kết phân tích đa dạng di truyền hai dòng cá rơ phi đỏ nhập từ Ecuador Malaysia, cho nên tiến hành lai tạo hai dòng cá với quần đàn cá rô phi đỏ khác nhằm làm tăng biến dị di truyền phục vụ cho công tác chọn giống tốt giữ nguồn gene đa dạng cho việc chọn lọc tính trạng khác tương lai 41 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Nghiên cứu thực nhằm đánh giá đa dạng di truyền hai dòng cá rơ phi đỏ có nguồn gốc từ Ecuador Malaysia sáu cặp mồi microsatellite Đây bước khởi đầu quan trọng nhằm phục vụ công tác chọn giống Kết phân tích di truyền cho thấy sáu microsatellite cho đa hình với tổng cộng 32 allele khác phát Dị hợp tử phát có ý nghĩa sáu locus từ 0,25 đến 0,87 Gía trị phong phú allele trung bình dòng cá rơ phi đỏ có nguồn gốc từ Ecuador Malaysia 5,9 4,8 Giá trị allele trung bình hai dòng cá allele/locus, giá trị thấp đáng kể so với giá trị allele trung bình nghiên cứu vào năm 2004 Romana ctv với allele/locus Sự dư thừa đồng hợp tử cho thấy dòng cá rơ phi đỏ nghiên cứu bị ảnh hưởng mức độ cận huyết khơng có quan tâm quản lý khai thác nguồn gene mức Đồng thời, nghiên cứu cho thấy thị phân tử microsatellite (SSR) cơng cụ hữu ích việc đánh giá đa dạng di truyền phục vụ cho công tác chọn giống Nên tiến hành lai tạo hai dòng cá với quần đàn cá rô phi đỏ khác nhằm làm tăng biến dị di truyền phục vụ cho cơng tác chọn giống, giữ gìn nguồn gene đa dạng cho việc chọn lọc tính trạng khác tương lai hạn chế ảnh hưởng cận huyết 5.2 Đề nghị Microsatellite (SSR) thị phân tử triển vọng để phân tích đa dạng di truyền Tuy nhiên, phạm vi đề tài, sử dụng số lượng primer microsatellite hạn chế Do chúng tơi đề nghị tiếp tục nghiên cứu, phát triển thêm nhiều cặp primer microsatellite để đánh giá đa dạng di truyền với độ tin cậy cao hơn, phục vụ cho cơng tác chọn giống Vì thời gian đề tài khơng cho phép, chúng tơi chưa có điều kiện để tiến hành phân tích sản phẩm PCR lần gel polyacrylamide, khơng phân biệt allele có kích thước khác biệt từ – nucleotide Vì đề nghị nên phân tích sản phẩm PCR gel polyacrylamide để đánh giá xác số allele locus 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phân tử - Những nguyên tắc chọn giống trồng Nhà xuất Nông nghiệp, Hồ Chí Minh Hồ Huỳnh Thùy Dương 1997 Sinh học phân tử Nhà xuất Giáo Dục Bùi Thị Liên Hà 2004 Bước đầu thăm dò, ứng dụng số thị DNA phân tích đa dạng di truyền cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) Đề tài tập sự, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II Phạm Thành Hổ 2007 Di truyền học Nhà xuất Giáo dục Phan Cự Nhân, Trần Đình Miên, Tạ Tồn Trần Đình Trọng 1978 Di truyền học sở chọn giống động vật Nhà xuất Đại Học THCN Hà Nội Nguyễn Đức Thành 2004 Một số kỹ thuật thị phân tử Nhà xuất Viện khoa học công nghệ Việt Nam - Viện công nghệ sinh học Hà Nội Phạm Anh Tuấn 2004 Công nghệ phục vụ nuôi cá rô phi xuất - Thuận lợi khó khăn Tạp chí khoa học thủy sản Phạm Hùng Vân 2002 PCR Real time PCR – Các vấn đề áp dụng thường gặp Nhà xuất Y học Tài liệu nước ngoài: Chhorn Lim 2007 Tilapia: Biology, Culture, And Nutrition Plublisher CRC Press 10 Graham Mair 2002 Topical issues in genetic diversity and breeding Genes and Fish Aquaculture Asia 71: 15-29 11 Griffiths Anthony JF 2000 An Introduction to Genetic Analysis, 7th edition Publisher New York: Harper & Row 12 Hughes A Randall, Brian D Inouye, Marc T J Johnson, Nora Underwood, Mark Vellend 2008 Ecological consequences of genetic diversity Publisher Wiley Online Library 13 Jenkins, John B 1990 Human Genetics Publisher Nova 14 Jeremy J Agresti, Shingo Seki, Avner Cnaani, Supawadee Poompuang , Eric M Hallerman, Nakdimon Umiel, Gideon Hulata, Graham A.E Gall, Bernie May 2000 Breeding new strains of tilapia: development of an artificial center of origin and linkage map based on AFLP and microsatellite loci Aquaculture 185: 43–56 15 Jolly M Saju, Woo-Jai Lee, Laszlo Orban 2010 Characterization of nine novel microsatellites isolated from Mozambique tilapia, Oreochromis mossambicus Conservation Genet Resour 2: 385–387 16 Kashi, Y., E M Hallerman, M Soller 1990 Marker-assisted selection of candidate bulls for progeny testing programs Anim Prod 51: 63-74 17 Miller, S A Dykes, D D Polesky 1988 A simple salting out procedure for extracting DNA from nucleated cells Nucleic Acids Research 16: 31-215 18 Muhammad H Rahman, Barry Jaquish and P.D Khasa 2000 Optimization of PCR Protocol in Microsatellite, Analysis with Sliver and SYBR Stains Plant Molecular Biology Reporter 18: 339-348 19 Overturf Ken 2009 Basic Molecular Laboratory Methods Molecular research in aquaculture Publisher Wiley-Blackwell, pp: 16-17 43 20 Palti Y., A Shirak, A Cnaani, G Hulata, R.R Avtalion, M Ron 2002 Detection of genes with deleterious alleles in an inbred line of tilapia (Oreochromis aureus) Aquaculture 206: 151– 164 21 Pante M J R., B Gjerde, and I McMillan Inbreeding levels and inbreeding depression in a farmed population of rainbow trout (Onchorhynchus mykiss) 1996 Conservation Genetics 5: 539–543 22 Rahman Muhammad H., Barry Jaquish and P D Khasa 2000 Optimization of PCR Protocol in Microsatellite Analysis with Silver and SYBR Stains Plant Molecular Biology Reporter 18: 339-348 23 Romana-Eguia Maria Rowena R., Minoru Ikeda, Zubaida U Basiao, Nobuhiko Taniguchi 2004 Genetic diversity in farmed Asian Nile and red hybrid tilapia stocks evaluated from microsatellite and mitochondrial DNA analysis Aquaculture 236: 131–150 24 Santoni, S., P Faivre-Rampant, E Prado, D Prat 2000 Molecular markers for analysis of genetic resources and plant breeding Journal Cahiers Agricultures 9: 311-327 25 Semagn, K., Å Bjørnstad, M N Ndjiondjop 2006 Principles, requirements and prospects of genetic mapping in plants African Journal of Biotechnology 5: 2569-2587 Tham khảo từ Internet: 23 http://www.uvi.edu/sites/uvi/Pages/AES-Aquaculture-Red_Tilapia 24 http://tilapia-fish-farming.info/default.aspx 25 http://www.aquaticcommunity.com/tilapia/red.php 44 PHỤ LỤC Phụ lục Các bảng số liệu sau xử lý phần mềm Arlequin Bảng Kiểm tra cân Hardy-Weinberg dòng -Locus #Genot Obs.Het Exp.Het P-value s.d Steps done -1 60 0.63333 0.74888 0.00001 0.00001 100172 55 0.87273 0.76781 0.00000 0.00000 100172 60 0.50000 0.81359 0.00000 0.00000 100172 59 0.45763 0.78198 0.00000 0.00000 100172 61 0.55738 0.76250 0.00000 0.00000 100172 59 0.25424 0.41678 0.00141 0.00010 100172 Bảng Kiểm tra cân Hardy-Weinberg dòng -Locus #Genot Obs.Het Exp.Het P-value s.d Steps done -1 48 0.50000 0.70768 0.00074 0.00008 100172 47 0.65957 0.72318 0.00000 0.00000 100172 50 0.50000 0.69838 0.00000 0.00000 100172 52 0.53846 0.69623 0.00000 0.00000 100172 49 0.63265 0.73995 0.00000 0.00000 100172 47 0.42553 0.68291 0.00001 0.00001 100172 Bảng Gía trị dị hợp tử mong đợi dòng dòng Expected heterozygosity -Locus# Population1 Population2 Mean s.d Tot Het -1 0.74888 0.70768 0.72828 0.02914 0.76003 0.76781 0.72318 0.74549 0.03156 0.76611 0.81359 0.69838 0.75598 0.08146 0.81216 0.78198 0.69623 0.73910 0.06063 0.75712 0.76250 0.73995 0.75123 0.01594 0.78771 0.41678 0.68291 0.54984 0.18819 0.62760 -Mean 0.71525 0.70805 0.71165 0.00509 0.75179 s.d 0.13499 0.01876 0.07688 0.08219 0.05868 Bảng Số lượng allele locus dòng dòng -Locus# Population1 Population2 Mean s.d Tot number -1 5.000 1.414 5.500 0.707 5.500 0.707 7 6.000 1.414 6.500 0.707 4 4.000 0.000 -Mean 6.000 4.833 5.417 0.825 7.000 s.d 1.000 0.687 0.844 0.221 1.000 Phụ lục Mức độ phong phú allele dòng cá rô phi đỏ Allelic Richness per locus and population based on sample size of: OM02 5.953 4.000 5.583 OM05 5.980 5.000 5.710 47 diploid individuals UNH216 6.000 5.000 6.000 UNH231 6.757 4.904 6.092 UNH159 6.946 5.999 6.673 UNH172 3.999 4.000 3.996 Phụ lục Chỉ số cận huyết locus dòng cá rơ phi đỏ Fis Per population : OM02 0.155 0.296 OM05 -0.138 0.089 UNH216 0.387 0.286 UNH159 0.271 0.146 UNH231 UNH172 All 0.417 0.392 0.238 0.228 0.379 0.235 Phụ lục Gía trị FST thống kê Over all loci Capf 0.314 Theta 0.101 Smallf Relat Relatc Sig_a Sig_b 0.237 0.153 -1.250 0.479 1.012 ... có nhu cầu tăng nhanh, cần nhanh chóng đầu tư phát triển Ðể sản phẩm cá rơ phi ni có tính cạnh tranh cao, cần tiếp tục nâng cao chất lượng giống, tạo phẩm giống có khả lớn nhanh thích ứng với... iv SUMMARY v MỤC LỤC vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix DANH SÁCH CÁC BẢNG x DANH SÁCH CÁC HÌNH xi Chương MỞ ĐẦU 1.1... Ngành (phylum): Chordata  Lớp (class): Actinopterygii  Liên (superordo): Labroidei  Bộ (ordo): Perciformes  Phân (subordo): Labroidei  Họ (familia): Cichlidae 2.1.2 Đặc điểm sinh học cá rô