Ảnh hưởng của nhiệt độ và hàm lượng oxy thấp lên cấu trúc cơ quan hô hấp của cá tra (pangasianodon hypophthalmus) tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chun ngành: Ni trồng thủy sản Mã ngành: 62 62 03 01 LÊ MỸ PHƯƠNG ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ VÀ HÀM LƯỢNG OXY THẤP LÊN CẤU TRÚC CƠ QUAN HÔ HẤP CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) Cần Thơ, 2017 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC THỰC HIỆN VÀ HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VÀ TRƯỜNG ĐẠI HỌC AARHUS Người hướng dẫn chính: PGS.TS Đỗ Thị Thanh Hương Người hướng dẫn phụ: PGS.TS Mark Bayley Luận án bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại: ……………………………………………………… Vào lúc: … … ngày … tháng … năm … Phản biện 1: …………………………………………… Phản biện 2: …………………………………………… Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Phuong, L.M., Damsgaard, C., Huong, D.T.T., Ishimatsu, A., Wang, T and Bayley, M., 2017 Recovery of blood gases and haematological parameters upon anaesthesia with benzocaine, MS-222 or Aqui-S in the air-breathing catfish Pangasianodon hypophthalmus Ichthyological Research, 64(1), pp.8492 Phuong, L.M., Huong, D.T.T., Nyengaard, J.R and Bayley, M., 2017 Gill remodelling and growth rate of striped catfish Pangasianodon hypophthalmus under impacts of hypoxia and temperature Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology, 203, pp.288-296 Phuong, L.M., Huong, D.T.T., Malte, H., Nyengaard, J.R, and Bayley, M., 2017 Ontogeny and morphometric of the gill and swim bladder of air-breathing striped catfish Pangasianodon hypophthalmus Journal of Experimental Biology In press CHƯƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Theo dự đoán IPPC (2014), nhiệt độ môi trường dần tăng lên hậu biến đổi khí hậu tồn cầu Khi nhiệt độ tăng dẫn đến nồng độ oxy nước giảm, nhiên thời điểm, nhu cầu oxy cho trao đổi chất động vật thủy sản tăng Và phạm vi hiếu khí (aerobic scope) động vật thủy sản giảm Do đó, nhiệt độ tăng biết ảnh hưởng đến sinh lý, sinh sản, tăng trưởng, miễn dịch, tỷ lệ sống…của động vật thủy sản, giả thiết OCLTT (the oxygen- and capacity-limited thermal tolerance) Pörtner (2010) đề xuất vận chuyển phân phối oxy thể động vật thủy sản tác động nhiệt độ tăng nguyên nhân ảnh hưởng nghiêm trọng đến sinh vật Ngoài ra, theo giả thiết Tewksbury ctv (2008), động vật thủy sản khu vực nhiệt đới chịu ảnh hưởng nghiêm trọng nóng lên tồn cầu nhiều so với đối tượng khu vực ôn đới Điều động vật thủy sản loài biến nhiệt (nhiệt độ bên chúng thay đổi theo biến đổi nhiệt độ môi trường), loài vùng nhiệt đới gần với ngưỡng chịu nhiệt chúng, nên chúng dễ bị tác động nhiệt độ tiếp tục tăng tương lai Vì tăng lên nhiệt độ đe dọa nguồn thực phẩm người lâu dài Khu vực Đơng Nam Á nói chung khu vực Đồng sông Cửu Long (ĐBSCL) nói riêng theo dự đốn chịu tác động nghiêm trọng biến đổi khí hậu kinh tế đời sống người dân khu vực phần lớn phụ thuộc vào nguồn tài nguyên thiên nhiên, vào nơng sản thủy sản Do đó, việc tìm hiểu tác động tượng nóng lên tồn cầu lên ni trồng thủy sản tìm hiểu chế thích ứng động vật thủy sản với biến đổi môi trường thiết yếu cho sách chiến lược quản lý tương lai góp phần cho phát triển bền vững ngành thủy sản Cá tra Pangasianodon hypophthalmus đối tượng nuôi thủy sản quan trọng Đông Nam Á đặc biệt khu vực ĐBSCL (Phuong Oanh, 2010) Theo Lefevre ctv (2011), cá tra lồi hơ hấp khí trời khơng bắt buộc có khả hơ hấp nước để trì q trình trao đổi chất hơ hấp khơng khí mơi trường nước thiếu oxy Tuy nhiên, có thơng tin nghiên cứu đặc điểm sinh học, phản ứng sinh lý hô hấp cá tra với biến đổi môi trường, đặc biệt với điều kiện nhiệt độ tăng tình trạng thiếu oxy nước (hypoxia) Ngồi ra, chưa có minh chứng (định lượng) hình thái học quan hô hấp cho thấy cá tra có khả hơ hấp tốt nước khơng khí, thơng số có biến đổi hay không tác động nhiệt độ oxy nước biến đổi 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu thực nhằm cung cấp thông tin có giá trị khoa học góp phần đánh giá tác động nhiệt độ cao tình trạng thiếu oxy lên cấu trúc quan hô hấp cá tra P hypophthalmus phương pháp mô học lập thể Đồng thời khảo sát tăng trưởng cảu cá Tra tác động điều kiện Một số tiêu sinh lý máu cá khảo sát cá tình trạng thiếu oxy (trong trình gây mê) cá phục hồi (sau gây mê) Ngoài ra, nghiên cứu khảo sát mối liên hệ biến đổi cấu trúc mang (nếu có) với khả điều hòa acid-bazo máu cá 1.3 Các nội dung nghiên cứu a) Khảo sát ảnh hưởng loại thuốc mê thường dùng nuôi trồng thủy sản lên thông số sinh lý máu cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) b) Khảo sát biến đổi hình thái mang tăng trưởng cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) tác động điều kiện nhiệt độ cao và/hoặc hàm lượng oxy thấp c) Khảo sát tương quan thông số hô hấp mang bong bóng khí với khối lượng cá tra (P hypophthalmus) kích cỡ khác khảo sát ảnh hưởng bơ lội lên cấu trúc mang cá Tra phương pháp mô học lập thể d) Khảo sát biến đổi cấu trúc mang lên khả điều hòa axit-bazo cá Tra P hypophthalmus 1.4 Ý nghĩa nghiên cứu Kết đạt từ nghiên cứu cần thiết việc tìm khả thích nghi lồi với nhiệt độ tăng tìm biện pháp khắc phục với hậu gây tượng nóng lên tồn cầu Từ đề chiến lược đối phó với tượng nóng lên tồn cầu góp phần bền vững cho ngành ni trồng thủy sản tương lai Đồng thời, kết đạt từ nghiên cứu đóng vai trò quan trọng nguồn tài liệu sinh lý cá cho nghiên cứu tiếp sau đóng vài trò quan trọng giảng dạy nguồn tài liệu có lĩnh vực hạn chế CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung 1: Ảnh hưởng loại thuốc mê thường dùng nuôi trồng thủy sản lên thông số sinh lý máu cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) Cá thí nghiệm: P hypophthalmus 700-1000 g Thuốc mê: Benzocaine (100 mg l-1), Aqui-S (30 mg l-1), MS222 (100 mg l-1) Thiết kế thí nghiệm: Ba loại thuốc mê xem nghiệm thức Mỗi nghiệm thức lặp lại lần (1 cá thể /lần) Cá gây mê bể nhỏ (20 L) chứa loại thuốc mê chuẩn bị trạng thái thăng bất động Khi gây mê, cá đút ống ống nhựa y tế (I.D 0.58 mm, O.D 0.96 mm) chứa sẵn chất chống đông (heparin nồng độ 50 IE ml-1 nước muối sinh lý) vào động mạch lưng (theo Soivio ctv, 1975) Các mẫu máu thu thời điểm sau đút ống, sau 3, 6, 24, 48, 72 từ thời điểm cá phục hồi bể nước (200 L) có sục khí khơng có thuốc mê Trong q trình lấy máu phải thật cẩn thận để không làm cá hoảng sợ Các thông số sinh lý máu: PCO2, pHe, [lactate], Hct, [Hb], RBC, [glucose], [cortisol], [Cl-]e, [Cl-]i Thống kê: Phép phân tích thống kê nhân tố có lặp lại (One-way repeated measures ANOVA) áp dụng để xác định khác biệt có ý nghĩa thống kê lần thu mẫu cho thông số sinh lý máu 2.2 Nội dung 2: Khảo sát biến đổi hình thái mang tăng trưởng cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) tác động điều kiện nhiệt độ cao và/hoặc hàm lượng oxy thấp Cá thí nghiệm: P hypophthalmus 12 ± 0.8 g; 2.4 ± 0.05 g Thiết kế thí nghiệm: Thí nghiệm 1: Cá bố trí ngẫu nhiên bể (20 cá thể/bể 500L) nhiệt độ ban đầu 27ᵒC 92% oxy bão hòa (normoxic) Sau ngày, mẫu mang từ cá bể thu cố định dung dịch cố định formaline trung tính 4% dược mô tả bên Các mẫu mang xem mẫu đối chứng Số cá lại bể cho thích nghi với điều kiện nhiệt độ oxy khác nhau: 27ᵒC & normoxia; 27ᵒC & hypoxia; 33ᵒC & normoxia; 33ᵒC & hypoxia Mức nhiệt độ PO2 điều kiện thí nghiệm trì kiểm sốt thơng qua phần mềm Commander Pacific thuộc cơng ty OxyGuard® Pacific (Farum, Đan Mạch), với độ xác dao động ±0.5ᵒC ±5% oxy bão hòa Cá bố trí điều kiện tuần Sau đó, cá thể bể thu mẫu Khối lượng chiều dài thể cá ghi nhận; đồng đời mẫu mang cố định formaline trung tính 4% Thí nghiệm 2: Mỗi cá thể cá cân đo chiều dài thể, đánh dấu PIT tag (chiều dài khoảng 0.5cm) tiêm vào lưng cá Sau đó, cá bố trí bể (30 cá/bể 500L) nhiệt độ ban đầu 27ᵒC 92% oxy bão hòa (normoxic) Sau ngày, cá cho thích nghi với điều kiện nhiệt độ oxy nước sau: 27ᵒC & normoxia; 27ᵒC & hypoxia; 33ᵒC & normoxia; 33ᵒC & hypoxia Cá sau cho ăn lần ngày thức ăn viên, thức ăn thừa loại bỏ ngày Sau tuần, khối lượng chiều dài thể cá (đã đánh dấu) bể ghi nhận từ ước tính tỷ lệ tăng trưởng cá Thí nghiệm tiến hành khoảng thời gian tháng Sau tháng, mẫu mang (n=6/bể) thu cố định dung dịch cố định formaline trung tính 4% dược mơ tả bên Phương pháp Stereology: Quy trình xử lý, đúc khối cắt mẫu thực theo phương pháp mô tả da Costa ctv (2007) Trên cung mang, phần xương sụn cứng cẩn thận loại bỏ cho tia mang cung mang liên kết với không bị tổn hại Phần mô mang thu mẫu theo tỷ lệ phù hợp tùy theo kích cỡ (Gundersen ctv, 1988), khử nước dung dịch ethanol có nồng độ khác (từ 70% đến 99%) dung dịch Technovit 7100, đúc khối dung dịch methyl methacrylate Technovit®7100 Mỗi mơ mang khối xoay 40ᵒ so với mô mang đúc trước Khối cắt theo chiều dọc (vertical uniform random sections - VUR theo Baddeley ctv, 1986) máy cắt mẫu (microtorm) Tổng số 8-10 lát cắt (3 µm/lát cắt) chọn khối Các lát cắt chọn nhuộm với thuốc nhuộm Eosin & Haematoxylin trước khảo sát kính hiển vi Bằng cách áp dụng phần mềm NewCast (VIS®, Olympus, Denmark), thơng số thể tích diện tích bề mặt hô hấp mang định lượng hệ thống đếm điểm (Points counting system) hệ thống đếm đoạn (test lines system) (Gundersen ctv, 1988; Howard Reed, 1998; Michel Cruz-Orive, 1988); khoảng cách khuếch tán mang xác định theo Jensen ctv (1979) Thống kê: Phép kiểm định Two-way MANCOVA (Ramos ctv, 2012) áp dụng để kiểm tra tác động có ý nghĩa thống kê nhân tố nhiệt độ, oxy, ký sinh trùng lên thông số hô hấp mang Two-way ANOVA áp dụng để kiểm định tác động có ý nghĩa thống kê nhiệt độ và/hoặc oxy lên tăng trưởng cá Tra thí nghiệm đồng thời so sánh khác biệt có ý nghĩa thống kê nghiệm thức đợt thu mẫu 2.3 Nội dung 3: Khảo sát tương quan thông số hô hấp mang bong bóng khí với khối lượng cá tra (P hypophthalmus) Cá thí nghiệm: P hypophthalmus, 4.5 ± 0.8 g (n=6); 24.3 ± 0.7 g (n=6); 276 ± 19 g (n=6); 703 ±41 g (n=4); 1760 ± 160 g (n=2); 50.1±1.0 g (n=40) Thiết kế thí nghiệm: Thí nghiệm 1: Mang bong bóng khí cá Tra kích cỡ khác nhau: ± 0.8 g (n=6); 24.3 ± 0.7 g (n=6); 276 ± 19 g (n=6); 703 ±41 g (n=4); 1760 ± 160 g (n=2) thu cẩn thận cố định formalin trung tính 4%, sau xử lý phân tích theo phương pháp stereology mơ tả bên Thí nghiệm 2: Hai nhóm cá (50.1±1.0 g; n=20) 27°C 33ᵒC với điều kiện normoxia thời gian 30 ngày Mang cá nghiệm thức thu (n=6) xem nhóm đối chứng Các mẫu mang cố định phân tích phương pháp stereology mơ tả bên Cá lại sử dụng cho thí nghiệm bơi lội Mỗi cá thể cá đặt vào máy kích thích bơi lội (Swimming respirometer, Loligo Systems, Tjele, Denmark) 16h, với tốc độ bơi 1BL/s (1 body length/s), sau tăng dần đến BL/s Nước khơng khí khoang máy tự động làm mới; nhiệt độ oxy nước trì điều kiện cá ban đầu Nguyên lý hoạt động máy mô tả chi tiết Lefevre ctv (2013) Thí nghiệm kết thúc khoảng 20h, sau mang cá thu xử lý theo phương pháp stereology Thống kê: Phép phân tích thống kê hai nhân tố (Two-way ANOVA) áp dụng để kiểm định tác động có ý nghĩa hoạt động bơi lội nhiệt độ lên diện tích bề mặt hơ hấp mang; Phương pháp phân tích tương quan tuyến tính áp dụng để xác định tương quan thông số hơ hấp mang bong bóng khí với khối lượng cá 2.4 Nội dung 4: Khảo sát biến đổi cấu trúc mang lên khả điều hòa axit-bazo cá Tra P hypophthalmus Cá thí nghiệm: P hypophthalmus (400-500 g) Thiết kế thí nghiệm: Hai nhóm cá (433±28 g, n=6) điều kiện oxy khác nhau: hypoxia (30% khơng khí bão hòa) hyperoxia (>120% khơng khí bão hòa), 24h 30ᵒC Sau đó, cá nghiệm thức gây mê đút ống PE50 vào động mạch lưng mô tả thí nghiệm Nội dung (Soivio et al., 1975) Cá sau đút ống phục hồi điều kiện ban đầu Sau 24h, 3% khí CO2 (22mmHg) sục vào bể cá đút ống, mẫu máu thu sau 0, 4, 8, 18, 24h Khi kết thúc thí nghiệm, mang cá thu xử lý theo phương pháp stereology mô tả bên Các tiêu sinh lý máu: PaCO2, pHe, Hct, [Na+], [Cl-], áp suất thẩm thấu (ASTT) Thống kê: Phép phân tích thống kê hai nhân tố có lặp lại (Two-way repeated measures ANOVA) áp dụng để xác định khác biệt có ý nghĩa thống kê lần thu mẫu cho thông số sinh lý máu CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nội dung 1: Ảnh hưởng loại thuốc mê thường dùng nuôi trồng thủy sản lên thông số sinh lý máu cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) Ngay sau thời điểm đút ống, acid hóa huyết tương xãy đáng kể sau trở giá trị bình thường kể từ thời điểm đến 24 PCO2 động mạch tăng lên thời điểm đặc biệt nhóm cá gây mê Benzocaine (lên đến mmHg) Trong trình phục hồi, PCO2 giảm 2.5 mmHg tất nghiệm thức Ngay sau đút ống, [HCO3-] cá nghiệm thức MS-222 giảm số phục hồi sau mức mmol l-1 Đồ thị Davenport cho thấy trạng thái hô hấp cá tra (P hypophthalmus) sau tiến hành gây mê nghiệm thức, đồng thời cho thấy giảm thấp pHe sau đặt ống gây acid hóa máu Hiện có nhiều nghiên cứu điều hòa acid/base điều hòa ion nhiều lồi cá hơ hấp nước nghiên cứu tương tự loài cá hơ hấp khí trời (Shartau Brauner, 2014) Sự rối loạn điều hòa acid/base gây tình trạng tăng PCO2 giảm pHe xuất phát từ điều kiện môi trường bất lợi hàm lượng oxy thấp CO2 cao cá hoạt động mức (Baker ctv, 2009; Shartau Brauner, 2014) Hơ hấp khơng khí gắn liền với tăng lên PCO2 khác khả hòa tan CO2 nước khơng khí (Dejours, 1981) Thêm vào đó, khả điều hòa pHe cá hơ hấp khí trời thường thấp, điều tiêu giảm mang và giảm tuần hoàn máu qua cung mang cho thấy cần thiết phải có cân nhu cầu oxy hấp thu với khả trao đổi ion điều hòa pH cá hơ hấp khí trời (Ishimatsu Itazawa, 1983; Shartau Brauner, 2014) Nghiên cứu chứng tỏ khả điều hòa nhanh pHe cá tra điều đặc biệt lồi cá hơ hấp khí trời Đồng thời khả điều hòa nhanh acid/base lồi cá gây mê thực giống lồi cá hơ hấp hoàn toàn nước chẳng hạn cá hồi [HCO3-] (mmol l-1) 14 AquiS 12 10 6h 3h 72h 0h (a) [HCO3-] (mmol l-1) 14 MS222 12 10 3h 6h 72h 0h (b) [HCO3-] (mmol l-1) 14 Benzocaine 6h 12 3h 10 0h 72h (c) 7.4 7.6 7.8 8.0 8.2 pHe Hình 3.1 Biểu đồ Davenport: (a) Aqui-S, (b) MS222, (c) Benzocaine 3.2 Nội dung 2: Khảo sát biến đổi hình thái mang tăng trưởng cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) tác động điều kiện nhiệt độ cao và/hoặc hàm lượng oxy thấp Kết từ thí nghiệm cho thấy diện tích bề mặt mang cá có biến đổi theo thời gian thí nghiệm, theo biến đổi nhiệt độ oxy mơi trường nước (Hình 3.2A, B) Tại thời điểm bắt đầu thí nghiệm 27ᵒC & normoxic, cá có kích cỡ nhỏ (12.4±0.8 g) có diện tích bề mặt hô hấp mang cao (212±22 mm2 g-1) Tuy nhiên, sau tuần điều kiện 27ᵒC, however, diện tích mang giảm mạnh 12.9±7.9 mm2 g-1 nhóm normoxia, 4.9±2.3 mm2 g-1 nhóm hypoxia khơng có khác biệt ý nghĩa thống kê 10 nhóm (P>0.05) Qua hình ảnh mơ học mặt cắt ngang mang cá nhóm cho thấy mang bị lấp tế bào ILCM (Hình 3.3), giống tượng phát cá chép (Sollid ctv, 2003) Tuy nhiên, cá nhóm 33ᵒC hypoxia có diện tích bề mặt mang lớn (208±29 mm2 g-1) (Hình 3.2B) Kết thí nghiệm tương tự thí nghiệm đầu, sau 16 tuần thí nghiệm điều kiện thí nghiệm 1, cá nhóm nhiệt độ thấp có diện tích mang thấp nhiều so với nhóm nhiệt độ cao, với 133±25 mm2 g-1 nhóm 33ᵒC & normoxia, 160±19 mm2 g-1 nhóm 33ᵒC & hypoxia, gấp 6.5 đến 8.0 lần so với nhóm 27ᵒC Các thơng số diện tích mang cá Tra cho thấy tương đương lồi cá hơ hấp nước cao so với cá hơ hấp khí trời khác; ra, khoảng cách khuếch tán mang cá tra thấp (Hình 3.4) Kết chứng minh lồi hơ hấp khí trời, nhiên cá Tra có mang phát triển, giúp cá có khả trao đổi khí tốt mơi trường nước A 27oC & 92% (Beginning) B 250 27oC & 92% (I) 27oC & 35% (I) 14000 33oC & 35% (I) 200 27oC & 92% (II) 12000 27oC & 92%* (II) 33oC & 92% (II) 10000 a a 33oC & 92% (I) Surface area/Mass (mm2 g-1) Respiratory lamella surface area (mm2) 16000 33oC & 92%* (II) ac 150 8000 100 6000 4000 2000 50 b b 0 20 40 60 80 Fish mass (g) c b b Time (weeks) Hình 3.2 Diện tích bề mặt hơ hấp mang thứ cấp cá Tra (P hypophthalmus) điều kiện nhiệt độ và/hoặc oxy khác nhaua sau tuần (I) tuần phục hồi điều kiện oxy bình thường (II), với (A) trình bày kết cá thể; (B) trình bày kết trung bình nhóm theo khối lượng cá 11 Hình 3.3 Mang cá Tra Pangasianodon hypophthalmus 27ᵒC & Normoxia (hình trái) 33ᵒC & Hypoxia (hình phải) 12 Dogfish Water-blood diffusion distance ( m) Climbing perch Brown Bullhead 10 Arapaima Arapaima Icefish Rainbow trout Stinging catfish Wolf fish Tench Horse Mackerel Snakehead Walking catfish Striped catfish Mud Skipper Striped catfish Tuna Striped catfish Striped catfish Striped catfish 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 -1 Branchial surface area (mm g ) Hình 3.4 Diện tích bề mặt hơ hấp khoảng cách khuếch tán mang loài cá khác Cá hơ hấp nước (chấm tròn trắng); cá hơ hấp khí trời khơng bắt buộc (chấm trắng-đen); cá hơ hấp khí trời bắt buộc (chấm đen) Thí nghiệm tăng trưởng cá cho thấy nhiệt độ oxy tác động lớn đến tăng trưởng cá Trong q trình thí nghiệm, chúng tơi quan sát thấy cá nhóm nhiệt độ 33ᵒC bơi lội linh hoạt động lấy thức ăn, nhóm tăng trưởng nhanh so với nhóm 27ᵒC (P