MỤC LỤC A. MỞ ĐẦU 2 B. NỘI DUNG 5 1. Các nguyên tắc sinh học của kỹ thuật chuyển gen 5 2. Các bước trong kỹ thuật chuyển gen 6 3. Một số phương pháp chuyển gen ở thực vật 7 3.1. Các phương pháp chuyển gen gián tiếp 7 3.1.1. Chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens 7 3.1.2. Chuyển gen gián tiếp nhờ virus 11 3.2. Các phương pháp chuyển gen trực tiếp 12 3.2.1. Chuyển gen bằng súng bắn gen (gene gun) 12 3.2.2. Chuyển gen bằng xung điện (electroporation) 14 3.2.3. Chuyển gen bằng vi tiêm (microinjection) 14 3.2.4. Chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm 15 3.2.5. Chuyển gen bằng phương pháp hóa học 15 3.2.6. Chuyển gen trực tiếp qua ống phấn (pollen tube) 16 4. Lợi ích và nguy cơ của cây trồng chuyển gen 16 4.1. Lợi ích 16 4.2. Nguy cơ tiềm ẩn 18 5. Những thành tựu, triển vọng chủ yếu trong tạo giống cây trồng chuyển gen 20 6. Các hướng chính trong tạo cây trồng chuyển gen 21 6.1. Chuyển gen kháng sâu 21 6.2. Chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ 22 6.3. Chuyển gen tạo cây kháng virus gây bệnh 22 6.4. Chuyển gen tạo cây sản xuất protein động vật 24 6.5. Chuyển gen thay đổi hàm lượng và chất lượng các chất dinh dưỡng của cây 24 6.6. Chuyển gen tạo giống hoa có nhiều màu sắc 25 7. Quy trình tạo hoa hồng xanh bằng kỹ thuật RNA interference (RNAi) 26 C. KẾT LUẬN 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 A. MỞ ĐẦU Một trong các kỹ thuật của công nghệ tế bào thực vật là kỹ thuật chuyển gen. Trước đây, để tạo một giống mới các nhà tạo giống thường sử dụng phương pháp truyền thống để tổ hợp lại các gen giữa hai cá thể thực vật tạo ra cơ thể lai mang những tính trạng mong muốn. Phương pháp này được thực hiện bằng cách chuyển hạt phấn từ cây này sang nhụy hoa của cây khác. Tuy nhiên phép lai chéo này bị hạn chế bởi nó chỉ có thể thực hiện được giữa các cá thể cùng loài (lai gần), lai giữa những cá thể khác loài (lai xa) thường bị bất thụ do đó không thể tạo ra con lai được. Tuy nhiên, lai gần cũng phải mất nhiều thời gian mới thu được những kết quả mong muốn và thông thường những tính trạng quan tâm lại không tồn tại trong những loài có họ hàng gần nhau. Kể từ năm 1984, là lúc người ta bắt đầu tạo được cây trồng chuyển gen và đến nay đã có những bước tiến lớn. Nhiều cây trồng quan trọng chuyển gen ra đời như lúa, ngô, lúa mì, đậu tương, bông, khoai tây, cà chua, cải dầu, đậu Hà Lan, bắp cải… Các gen được chuyển là gen kháng vi sinh vật, virus gây bệnh, kháng côn trùng phá hại, gen có khả năng sản xuất những loại protein mới, gen chịu hạn, gen kháng thuốc diệt cỏ… Kỹ thuật chuyển gen cho phép nhà tạo giống cùng lúc đưa vào một loài cây trồng những gen mong muốn có nguồn gốc từ những cơ thể sống khác nhau, không chỉ giữa các loài có họ gần nhau mà còn ở những loài rất xa nhau. Phương pháp hữu hiệu này cho phép các nhà tạo giống thực vật thu được giống mới nhanh hơn và vượt qua những giới hạn của kỹ thuật tạo giống truyền thống. Kỹ thuật chuyển gen, ghép gen là kỹ thuật đưa một gen lạ (một đoạn ADN, ARN) vào tế bào vật chủ làm cho gen lạ tồn tại ở các plasmid trong tế bào chủ hoặc gắn bộ gen tế bào chủ, tồn tại và tái bản cùng với bộ gen của tế bào chủ. Gen lạ trong tế bào chủ hoạt động tổng hợp các protein đặc hiệu, gây biến đổi các đặc điểm đã có hoặc làm xuất hiện những đặc điểm mới của những cơ thể chuyển gen. Nhìn chung, việc ứng dụng cây chuyển gen đã có những lợi ích rõ rệt như sau: Tăng sản lượng Giảm chi phí sản xuất Tăng lợi nhuận nông nghiệp Cải thiện môi trường Những cây chuyển gen “thế hệ thứ nhất” đã giúp giảm chi phí sản xuất. Ngày nay, các nhà khoa học đang hướng đến việc tạo ra những cây chuyển gen “thế hệ thứ hai” nhằm tăng các giá trị dinh dưỡng hoặc có những đặc điểm thích hợp cho công nghiệp chế biến. Lợi ích của những cây trồng này hướng trực tiếp hơn vào người tiêu dùng. Chẳng hạn như: Lúa gạo giàu vitamin A và sắt Khoai tây tăng hàm lượng tinh bột Vacxin thực phẩm (edible vaccine) ở ngô và khoai tây Những giống ngô có thể trồng được trong điều kiện nghèo dinh dưỡng Dầu ăn có lợi cho sức khỏe hơn từ đậu nành và cải dầu Tuy nhiên, bên cạnh những ưu điểm cũng có những nguy cơ tiềm ẩn trong việc phát triển những kỹ thuật mới. Bao gồm: Mối nguy hiểm trong việc vô tình đưa những chất gây dị ứng hoặc làm giảm dinh dưỡng vào thực phẩm Khả năng phát tán những gen biến nạp trong cây trồng sang họ hoang dại Sâu bệnh có nguy cơ tăng cường tính kháng với các chất độc tiết ra từ cây chuyển gen Nguy cơ những chất độc này tác động tới các sinh vật không phải là loại sinh vật cần diệt, vì thế có thể làm mất cân bằng sinh thái Nhìn chung, mặc dù còn những điểm còn chưa rõ ràng về cây chuyển gen nhưng với khả năng tạo ra những giống cây trồng mới có giá trị kinh tế, công nghệ này có vai trò không thể phủ nhận được. Tuy vậy, vẫn còn một số vấn đề đáng lo ngại. Để giải quyết những vấn đề này thì những kết luận thu được phải dựa trên những thông tin tin cậy và có cơ sở khoa học. Triển vọng của công nghệ chuyển gen thực vật là rất lớn, cho phép tạo ra các giống cây trồng mang đặc tính di truyền hoàn toàn mới, có lợi cho con người mà trong chọn giống thông thường phải trông chờ vào đột biến tự nhiên, không thể luôn luôn có được. Đối với sự phát triển của công nghệ sinh học trong thế kỷ XXI thì công nghệ chuyển gen sẽ có một vị trí đặc biệt quan trọng. Có thể nói công nghệ chuyển gen là một hướng công nghệ cao của công nghệ sinh học hiện đại phục vụ sản xuất và đời sống.
MỤC LỤC A MỞ ĐẦU .Error: Reference source not found B NỘI DUNG Error: Reference source not found Các nguyên tắc sinh học kỹ thuật chuyển gen Error: Reference source not found Các bước kỹ thuật chuyển gen .Error: Reference source not found Một số phương pháp chuyển gen thực vật Error: Reference source not found 3.1 Các phương pháp chuyển gen gián tiếp Error: Reference source not found 3.1.1 Chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens Error: Reference source not found 3.1.2 Chuyển gen gián tiếp nhờ virus Error: Reference source not found 3.2 Các phương pháp chuyển gen trực tiếp Error: Reference source not found 3.2.1 Chuyển gen súng bắn gen (gene gun) Error: Reference source not found 3.2.2 Chuyển gen xung điện (electroporation) Error: Reference source not found 3.2.3 Chuyển gen vi tiêm (microinjection) Error: Reference source not found 3.2.4 Chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm .Error: Reference source not found 3.2.5 Chuyển gen phương pháp hóa học .Error: Reference source not found 3.2.6 Chuyển gen trực tiếp qua ống phấn (pollen tube) Error: Reference source not found Lợi ích nguy trồng chuyển genError: Reference source not found 4.1 Lợi ích Error: Reference source not found 4.2 Nguy tiềm ẩn Error: Reference source not found Những thành tựu, triển vọng chủ yếu tạo giống trồng chuyển gen Error: Reference source not found Các hướng tạo trồng chuyển gen Error: Reference source not found 6.1 Chuyển gen kháng sâu .Error: Reference source not found 6.2 Chuyển gen kháng thuốc diệt cỏError: Reference source not found 6.3 Chuyển gen tạo kháng virus gây bệnh Error: Reference source not found 6.4 Chuyển gen tạo sản xuất protein động vật Error: Reference source not found 6.5 Chuyển gen thay đổi hàm lượng chất lượng chất dinh dưỡng Error: Reference source not found 6.6 Chuyển gen tạo giống hoa có nhiều màu sắc Error: Reference source not found Quy trình tạo hoa hồng xanh kỹ thuật RNA interference (RNAi) Error: Reference source not found C KẾT LUẬN Error: Reference source not found TÀI LIỆU THAM KHẢO Error: Reference source not found A MỞ ĐẦU Một kỹ thuật công nghệ tế bào thực vật kỹ thuật chuyển gen Trước đây, để tạo giống nhà tạo giống thường sử dụng phương pháp truyền thống để tổ hợp lại gen hai cá thể thực vật tạo thể lai mang tính trạng mong muốn Phương pháp thực cách chuyển hạt phấn từ sang nhụy hoa khác Tuy nhiên phép lai chéo bị hạn chế thực cá thể loài (lai gần), lai cá thể khác loài (lai xa) thường bị bất thụ khơng thể tạo lai Tuy nhiên, lai gần phải nhiều thời gian thu kết mong muốn thơng thường tính trạng quan tâm lại khơng tồn lồi có họ hàng gần Kể từ năm 1984, lúc người ta bắt đầu tạo trồng chuyển gen đến có bước tiến lớn Nhiều trồng quan trọng chuyển gen đời lúa, ngơ, lúa mì, đậu tương, bông, khoai tây, cà chua, cải dầu, đậu Hà Lan, bắp cải… Các gen chuyển gen kháng vi sinh vật, virus gây bệnh, kháng côn trùng phá hại, gen có khả sản xuất loại protein mới, gen chịu hạn, gen kháng thuốc diệt cỏ… Kỹ thuật chuyển gen cho phép nhà tạo giống lúc đưa vào loài trồng gen mong muốn có nguồn gốc từ thể sống khác nhau, khơng lồi có họ gần mà lồi xa Phương pháp hữu hiệu cho phép nhà tạo giống thực vật thu giống nhanh vượt qua giới hạn kỹ thuật tạo giống truyền thống Kỹ thuật chuyển gen, ghép gen kỹ thuật đưa gen lạ (một đoạn ADN, ARN) vào tế bào vật chủ làm cho gen lạ tồn plasmid tế bào chủ gắn gen tế bào chủ, tồn tái với gen tế bào chủ Gen lạ tế bào chủ hoạt động tổng hợp protein đặc hiệu, gây biến đổi đặc điểm có làm xuất đặc điểm thể chuyển gen Nhìn chung, việc ứng dụng chuyển gen có lợi ích rõ rệt sau: - Tăng sản lượng - Giảm chi phí sản xuất - Tăng lợi nhuận nông nghiệp - Cải thiện môi trường Những chuyển gen “thế hệ thứ nhất” giúp giảm chi phí sản xuất Ngày nay, nhà khoa học hướng đến việc tạo chuyển gen “thế hệ thứ hai” nhằm tăng giá trị dinh dưỡng có đặc điểm thích hợp cho cơng nghiệp chế biến Lợi ích trồng hướng trực tiếp vào người tiêu dùng Chẳng hạn như: - Lúa gạo giàu vitamin A sắt - Khoai tây tăng hàm lượng tinh bột - Vacxin thực phẩm (edible vaccine) ngô khoai tây - Những giống ngơ trồng điều kiện nghèo dinh dưỡng - Dầu ăn có lợi cho sức khỏe từ đậu nành cải dầu Tuy nhiên, bên cạnh ưu điểm có nguy tiềm ẩn việc phát triển kỹ thuật Bao gồm: - Mối nguy hiểm việc vơ tình đưa chất gây dị ứng làm giảm dinh dưỡng vào thực phẩm - Khả phát tán gen biến nạp trồng sang họ hoang dại - Sâu bệnh có nguy tăng cường tính kháng với chất độc tiết từ chuyển gen - Nguy chất độc tác động tới sinh vật loại sinh vật cần diệt, làm cân sinh thái Nhìn chung, điểm chưa rõ ràng chuyển gen với khả tạo giống trồng có giá trị kinh tế, cơng nghệ có vai trò khơng thể phủ nhận Tuy vậy, số vấn đề đáng lo ngại Để giải vấn đề kết luận thu phải dựa thơng tin tin cậy có sở khoa học Triển vọng công nghệ chuyển gen thực vật lớn, cho phép tạo giống trồng mang đặc tính di truyền hồn tồn mới, có lợi cho người mà chọn giống thông thường phải trông chờ vào đột biến tự nhiên, ln có Đối với phát triển cơng nghệ sinh học kỷ XXI cơng nghệ chuyển gen có vị trí đặc biệt quan trọng Có thể nói cơng nghệ chuyển gen hướng công nghệ cao công nghệ sinh học đại phục vụ sản xuất đời sống B NỘI DUNG Các nguyên tắc sinh học kỹ thuật chuyển gen Khi đặt mục đích thực thí nghiệm chuyển gen cần ý số vấn đề sinh học ảnh hưởng đến trình chuyển gen sau: - Khơng phải tồn tế bào thể tính tồn (totipotency) - Các khác có phản ứng khơng giống với xâm nhập gen ngoại lai - Cây biến nạp tái sinh từ tế bào có khả tái sinh khả thu nhận gen biến nạp vào genome - Mô thực vật hỗn hợp quần thể tế bào có khả khác Cần xem xét số vấn đề như: có số tế bào có khả biến nạp tái sinh Ở tế bào khác có hai trường hợp xảy ra: số tế bào tạo điều kiện phù hợp trở nên có khả năng, số khác hồn tồn khơng có khả biến nạp tái sinh - Thành phần quần thể tế bào xác định loài, kiểu gen, quan, giai đoạn phát triển mô quan - Thành tế bào ngăn cản xâm nhập ADN ngoại lai Vì thế, chuyển gen vào tế bào có thành cellulose thông qua Agrobacterium, virus bắn gen phải phá bỏ thành tế bào để chuyển gen phương pháp xung điện, siêu âm vi tiêm - Khả xâm nhập ổn định gen vào genome không tỷ lệ với biểu tạm thời gen - Các ADN (trừ virus) xâm nhập vào genome tế bào vật chủ chưa đảm bảo liên kết ổn định với genome - Các ADN (trừ virus) không chuyển từ tế bào sang tế bào kia, nơi mà đưa vào - Trong đó, ADN virus xâm nhập vào genom chủ lại không liên kết với genome mà chuyển từ tế bào sang tế bào khác ngoại trừ mô phân sinh (meristem) Các bước kỹ thuật chuyển gen Từ người ta khám phá thí nghiệm chuyển gen thực nhờ loại vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens, nhà khoa học tin Agrobacterium chuyển gen vào tất trồng Nhưng sau kết thực tế cho thấy chuyển gen Agrobacterium thực ngũ cốc (một mầm) mà hàng loạt kỹ thuật chuyển gen khác phát triển kỹ thuật chuyển gen trực tiếp bắn gen vi đạn (bombardement/ gene gun), vi tiêm (microinjection), xung điện (electroporation), silicon carbide, điện di (electrophoresis), siêu âm (ultrasonic), chuyển gen qua ống phấn (pollen tube) Đến nay, nhờ cải tiến vector chuyển gen nên kỹ thuật chuyển gen A tumefaciens thành công ngũ cốc đặc biệt lúa Kỹ thuật trở nên kỹ thuật đầy triển vọng chuyển gen thực vật Quá trình chuyển gen thực qua bước sau: - Xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm - Phân lập gen (PCR sàng lọc từ thư viện cADN từ thư viện genomic ADN) - Gắn gen vào vector biểu (expression vector) để biến nạp - Biến nạp vào E coli - Tách chiết ADN plasmid - Biến nạp vào mô tế bào thực vật phương pháp khác kể - Chọn lọc thể biến nạp môi trường chọn lọc - Tái sinh biến nạp - Phân tích để xác nhận cá thể chuyển gen (PCR Southern blot) đánh giá mức độ biểu chúng (Northern blot, Western blot, ELISA thử nghiệm in vivo khác ) Nguyên liệu để thực biến nạp tế bào thực vật riêng rẽ, mơ hồn chỉnh Cản trở lớn tiếp nhận ADN phần lớn sinh vật thành tế bào Muốn làm thành tế bào thực vật người ta thường sử dụng enzym điều kiện thích hợp người ta tạo tế bào trần, tế bào trần tiếp nhận ADN nói chung dễ dàng Sau biến nạp người ta tách enzym phân giải tế bào phát triển, thành tế bào tạo thành Các tế bào biến nạp nuôi cấy mơi trường nhân tạo thích hợp với chất kích thích sinh trưởng để tạo thành hồn chỉnh Sau phương pháp phân tích genome PCR, Southern blot, Northern blot thực để tìm xác biến đổi gen Một số phương pháp chuyển gen thực vật Có hai hình thức chuyển gen chủ yếu chuyển gen trực tiếp chuyển gen gián tiếp 3.1 Các phương pháp chuyển gen gián tiếp 3.1.1 Chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens * Nguyên lý chung Sử dụng vi sinh vật đất Agrobacterium (là vi khuẩn Gram âm) để chuyển gen thực vật phương pháp hiệu phổ biến nhờ vào khả gắn gen ngoại lai vào hệ gen thực vật cách xác ổn định Sự chuyển gen thực vật dùng A tumefaciens dựa nguyên lý hình sau Hình1 Agrobacterium mang plasmid gây khối u thực vật (tumour inducing plasmid- Ti plasmid), plasmid chứa gen vir vùng gen cần chuyển (T-DNA) Gen quan tâm chèn vào vùng T-DNA Các tế bào tổn thương thực vật tiết hợp chất bảo vệ, hợp chất kích thích biểu gen vir Agrobacterium Vir protein tạo T-strand từ vùng T-DNA Ti-plasmid Sau vi khuẩn gắn vào tế bào thực vật, T-strand số protein vir chuyển vào tế bào thực vật qua kênh vận chuyển Trong tế bào thực vật, protein vir tương tác với T-strand tạo phức hệ (T- complex) Phức hệ vào nhân tế bào thực vật, T-DNA chèn vào gen thực vật biểu gen quan tâm Bộ gen vi khuẩn Ti plasmid Hình Vi khuẩn A.tumefaciens Cụ thể sau: Phương pháp sử dụng Ti plasmid A.tumefaciens Ti plasmid Arhizogenes làm vectơ đưa ADN vào tế bào Ti plamid gồm hai thành phần: T- DNA vùng Vir T- DNA chuyển từ Agrobacterium vào tế bào thực vật, nhờ mà gắn gen muốn chuyển vào T- DNA để đưa vào tế bào TDNA chứa gen điều hoà sinh trưởng cục (auxin, cytokinie), gen tổng hợp chất Opine gen gây khối u Đoạn cuối có 25 cặp bazơ lặp lại, đoạn vùng xâm nhập vào phân tử ADN thực vật Trong plasmid vị trí T- DNA giới hạn bờ trái bờ phải 10 6.2 Chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ Thuốc diệt cỏ glyphosat thuốc có tác dụng diệt cỏ tốt, dễ tự phân hủy gây nhiễm mơi trường Cơ chế diệt cỏ thuốc kìm hãm hoạt động enzym có tên enol pyruvat sikimat phosphat synthetase (EPSPS) Enzym EPSPS có chức chuyển hóa sản phẩm quang hợp thành axit mang mạch vòng có tên axit sikimic Axit sikimic khơng hình thành làm rối loạn tồn q trình trao đổi chất cỏ làm cỏ chết Cây trồng tạo có hàm lượng hoạt tính enzym EPSPS cao gấp lần so với trồng bình thường hồn tồn chống chịu với thuốc diệt cỏ glyphosat 6.3 Chuyển gen tạo kháng virus gây bệnh Có nhiều cách tạo kháng virus, chuyển gen mã hóa protein vỏ virus, chuyển gen tạo enzym phân giải virus (ví dụ enzym ribozyme), chuyển gen có trình tự đối (antisens) với ARN virus Các đối khóa lại chép phiên mã ARN virus Kỹ thuật chuyển gen mã hóa vỏ protein virus thường sử dụng phổ biến Virus có cấu tạo phần: phần lõi axit nucleic (ADN ARN) phần vỏ protein Khi có mặt gen mã hóa protein vỏ virus tế bào gây hiệu ứng kìm hãm tổng hợp protein vỏ gen tạo vỏ virus Do virus không nhân lên Nhiều loại trồng chuyển gen tạo vỏ nhiều loại virus nên kháng virus gây bệnh như: đu đủ kháng với virus gây bệnh đốm vòng; thuốc kháng với virus khảm dưa chuột; thuốc kháng với virus khảm alfa; khoai tây kháng với virus X, virus Y; khoai tây kháng với virus xoăn lá; cam, quýt kháng bệnh virus gây tàn lụi tristeza … 25 Hình Cây thuốc chuyển gen kháng virus CMV đối chứng Hình Lá đu đủ chuyển gen kháng PRSV đối chứng (PRSV: Papaya ringspor virus, gây bệnh đốm vòng) 6.4 Chuyển gen tạo sản xuất protein động vật Các nhà khoa học tìm cách giải trình tự gen mã hóa cho protein động vật, thiết kế lại, sau chuyển gen vào thực vật, biến thực vật thành thể sản xuất protein động vật Ví dụ: gen tổng hợp lactoferrin protein có sữa người, chuyển vào khoai tây, lúa thu khoai tây, lúa có khả tổng hợp lactoferrin Một hướng quan trọng khác sản xuất “thực phẩm chức năng” Điều có nghĩa cần chuyển nhiêu gen tổng hợp protein có tác dụng kháng nguyên vào đối tượng trồng rau, đậu, ăn Do tạo vacxin Nhờ ăn rau, đậu, hoa, 26 trồng chuyển gen tạo vacxin để thay cho việc tiêm vacxin phòng bệnh Hình Thực phẩm chức 6.5 Chuyển gen thay đổi hàm lượng chất lượng chất dinh dưỡng Đã nghiên cứu chuyển gen mã hóa cho protein chứa nhiều methionin vào đậu tương ngô, kết làm tăng loại protein giàu methionin lên 8% tổng số protein có hạt Người ta chuyển thành công gen mã hóa cho việc tổng hợp chất thaumatin (chất có độ gấp hàng nghìn lần so với đường mía) vào khoai tây Kết toàn thân, lá, rễ củ khoai tây Hình Hạt gạo vàng 27 Người ta chuyển nhóm gen mã hóa cho enzym chuyển hóa pyrophosphat thành β- caroten Gạo có hàm lượng β- caroten giải vấn đề thiếu vitamin A cho người 6.6 Chuyển gen tạo giống hoa có nhiều màu sắc Hình 10 Đa dạng màu hoa Màu sắc hoa, đặc biệt hoa có màu xanh, nhung đen có giá trị Trong mô cánh hoa, tế bào biểu bì thường chứa sắc tố tạo màu sắc hoa Có nhóm anthocyanin phát dẫn xuất chất pelargonidin, cyanidin delphinidin Các sắc tố dẫn xuất pelargonidin thường có màu da cam, hồng đỏ; cyanidin có màu đỏ màu hoa cà; delphinidin có màu tía, màu xanh màu xanh đen Sự phối hợp nhóm anthocyanin tạo phổ màu sắc hoa rộng Trên sở biết gen mã hóa cho enzym tham gia vào biến đổi sắc tố, người ta chuyển gen mã hóa, gen ức chế hoạt động enzym nhằm điều khiển hướng chuyển hóa sắc tố, từ tạo hoa có màu sắc khác 28 Quy trình tạo hoa hồng xanh kỹ thuật RNA interference (RNAi) Hội nghị hoa hồng giới 2006 tổ chức thành phố Osaka từ ngày 11- 17/5/2006 Trong hội nghị ban tổ chức đưa triển lãm nhiều giống hoa hồng đẹp ấn tượng Tuy nhiên trội hội nghị lần hoa hồng xanh tạo kỹ thuật RNAi hợp tác nhà khoa học hai công ty Florigene Suntory trợ giúp mặt kỹ thuật Viện Khoa Học Kỹ Thuật Úc Châu (CSIRO) Hoa hồng xanh coi chén thánh (Holy Grail) nhà lai tạo hoa hồng kể từ năm 1840 Khi hiệp hội làm vườn Anh Bỉ treo giải thưởng 500.000 francs cho người tạo hoa hồng màu xanh Các nhà di truyền học phân tử công ty Florigene Suntory đoạt giải thưởng này, giải thưởng làm nhụt chí nhà lai tạo hoa hồng truyền thống cách kết hợp yếu tố cũ, yếu tố mới, yếu tố vay mượn cuối yếu tố tạo màu xanh Yếu tố tạo màu xanh hoa hồng gen delphinidin mà nhà di truyền công ty Florigene clone từ loài hoa păng-xê để tổng hợp trực tiếp màu xanh hoa hồng Yếu tố vay mượn gen iris nhằm tạo enzyme DFR (the dihydroflavonol reductase), enzyme hồn thành chu trình phản ứng tổng hợp delphinidin hoa hồng Yếu tố gen nhân tạo Gen tạo nhóm nhà di truyền học cơng ty Suntory kỹ thuật RNA interference, viết tắt RNAi Kỹ thuật tư vấn viện CSIRO nhằm mục đích tắt hoạt động gen hình thành màu đỏ hoa hồng Chính gen đánh bại nỗ lực nhóm nghiên cứu Florigene nhằm làm hoạt hóa chu trình delphinidin hoa hồng gần thập kỷ Vì vậy, nhà 29 khoa học Suntory tạo gen “câm lặng” để vượt qua khó khăn kỹ thuật RNAi Trong trồng có loại phân tử gọi anthocyanin coi sắc tố chủ đạo hoa, trái mô tế bào khác Thơng thường, màu hoa bắt nguồn từ anthocyanin với có mặt chất carotenoid màu vàng Ngoài ra, anthocyanin dihydrokaempferol (DHK) lại enzyme chi phối cho chu trình hình thành sắc tố trồng bao gồm: cyanidin, pelargonidin delphinidin Gen cyanidin mã hóa enzyme làm thay đổi enzyme DHK nhằm hình thành chu trình cyanidin dẫn đến biểu màu đỏ, hồng hay màu tím hoa cà Trong gen delphinidin khơng diện hoa hồng mã hóa enzyme tương đồng cho việc thay đổi enzyme DHK nhằm hình thành tổng hợp màu theo chu trình delphinidin Một loại enzyme khác có tên gọi dihydroflavinol reductase (DFR) hỗ trợ màu thị ba chu trình Enzyme quan trọng khơng có khơng thể tạo màu cánh hoa Chính mà đột biến gen DFR cho hoa có màu trắng Trong hoa hồng khơng có gen delphinidin để hình thành màu theo chu trình Chu trình delphinidin hình thành màu đỏ xanh hoa tác động DRF pH Để tạo hồng màu xanh, nhà nghiên cứu Florigene cần loại bơng hồng trắng gene DFR bị bất hoạt Vào năm 2001, TS.Waterhouse thảo luận việc sử dụng kỹ thuật RNAi nhằm ức chế gen mong muốn để sau thay gen khác Do đó, nhà khoa học công ty Florigene nhận lợi ích việc dùng kỹ thuật RNAi nhằm ức chế hoạt động gen DFR hoa hồng đỏ dẫn đến ức chế chu trình cyanidin sau chuyển gen delphinidin với gen DFR hồn tồn nhằm hồn chỉnh chu trình tổng hợp 30 delphinidin hoa hồng Cùng lúc nhà nghiên cứu cơng ty Suntory, Nhật Bản có ý tưởng cách dùng kỹ thuật RNAi để ức chế gen DFR sau họ tạo dòng (clone) gen delphinidin từ loài hoa păng-xê (pansy) gen DFR từ hoa iris Các gen DFR hoa hồng iris tương tự chia sẻ nhiều đoạn mã DNA, kỹ thuật RNAi tinh tế ức chế gen DFR hoa hồng mà không ảnh hưởng đến gen DFR hoa iris việc tạo cấu trúc ức chế gen có tác dụng tạo phân tử dsRNA kẹp tóc (hairpin dsRNA) với trình tự tương đồng với gen DFR hoa hồng Vì để tạo hồng xanh, nhà khoa học Suntory áp dụng gen Một gen nhân tạo dùng cho kỹ thuật RNAi nhằm ức chế gen DFR hoa hồng làm cho hoa hồng khơng biểu màu Sau chuyển gen delphinidin từ loài hoa păng-xê gen DFR từ loài hoa iris tạo hoa hồng có hàm lượng delphinidin cao cánh hoa Tuy nhiên, phải lưu ý yếu tố ảnh hưởng đến màu xanh cánh hoa độ pH tế bào lý lồi hoa có chu trình anthocyanin lại có màu khác Khi nồng độ pH tế bào mang tính kiềm sắc tố anthocyanin thường trở nên xanh pH đất không ảnh hưởng hay ảnh hưởng đến pH tế bào cánh hoa Nồng độ pH tế bào cánh hoa thường mang tính di truyền Cánh hoa hồng thơng thường có nồng độ pH khoảng 4,5 Chính vậy, để tạo cánh hoa hồng có nồng độ pH thấp hạn chế Vì vậy, nhà khoa học nghĩ đến kỹ thuật ức chế gen kỹ thuật RNAi nhằm xác định gen ảnh hưởng đến tính axít cánh hoa hay điều chỉnh màu cánh hoa theo hướng khác 31 Hình 11 Quy trình hình thành hồng xanh với hỗ trợ kỹ thuật RNAi Nguồn hình từ CSIRO (http://www.csiro.au/files/files/p29z.pdf) Hình 12 Hoa hồng xanh (blue rose) Bông hồng xanh sản phẩm tạo từ việc ứng dụng kỹ thuật RNAi Đây hàng loạt ứng dụng RNAi nghiên cứu y sinh cơng cụ hữu ích cho việc tìm hiểu khám phá chức bí ẩn gen thời đại nghiên cứu hậu genome (post- genomic era) 32 C KẾT LUẬN Công nghệ tạo trồng chuyển gen ngày phát triển tạo hàng trăm giống trồng chuyển gen khác mang nhiều đặc tính quý Tuy nhiên vấn đề trồng chuyển gen (GMOs- Genetically Modified Organisms) vấn đề tranh cãi, chí gặp phải phản đối gay gắt từ nhiều nhà khoa học Sản phẩm chuyển gen bị nhiều người tiêu dùng lo ngại Các sản phẩm chuyển gen phải dán nhãn để người 33 tiêu dùng lựa chọn Nhiều nước chưa cho phép nhập sản phẩm chuyển gen trồng chuyển gen Các phương pháp nhận biết GMOs cấu trúc phân tử GMOs Việc nhận biết GMOs cần thiết nhiều ứng dụng để đánh giá mức độ hạt giống hay việc bắt buộc dán nhãn thực phẩm số quốc gia Vì nhiều kỹ thuật phân tích phát triển để đáp ứng nhu cầu Việc phát GMOs dẫn xuất thực nhờ nhận biết phân tử (ADN, ARN protein) mà phân tử có nguồn gốc từ gen chèn (hoặc gen biến đổi) Có ba phương pháp để xác định GMOs là: phương pháp khuyếch đại dựa sở nucleotit; phương pháp dựa cở sở protein; phương pháp dựa sở phát hoạt tính enzym * Phương pháp khuếch đại dựa sở nucleotit: bao gồm kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction), phản ứng LCP (Ligase Chain Reaction), khuếch đại dựa trình tự axit nucleic (NASBA), kỹ thuật dấu vân tay (RFLP, AFLP, RAPD…), lai mẫu dò, chép trình tự trì liên tục (3SR) khuếch đại enzym chép Q * Phương pháp dựa sở protein: bao gồm điện di gel SDS chiều, điện di gel SDS hai chiều, phân tích Western blot kỹ thuật ELISA (Enyme linked immunosorbent assays) * Phương pháp dựa sở phát hoạt tính enzym: phương pháp khơng thích hợp với thực phẩm qua chế biến lúc protein bị biến tính Cho đến phương pháp phát triển để phát GMOs dẫn xuất GMOs chủ yếu dựa việc phát ADN, 34 vài phương pháp phát triển để phát protein ARN Điều có nhiều lý do, ADN làm nhân lên hàng triệu thời gian ngắn nhờ kỹ thuật PCR Việc phân tích ARN protein trình phức tạp thời gian lâu ADN phân tử bền vững, ARN lại khơng ổn định Tính bền vững protein lại khác nhau, phụ thuộc vào loại protein Thường có mối tương quan số lượng GMOs ADN ADN biến đổi di truyền nhân, mối tương quan không xảy ADN ADN ngồi nhân (trong sinh vật nhân chuẩn, thể nhiễm sắc nhiễm sắc thể sinh vật nhân sơ) Trong lại khơng có nhiều mối tương quan số lượng GMOs protein ARN Cuối thân thể bị biến đổi di truyền bị tác động mức ADN Hiện nay, tất GMOs thương mại hoá thể bị biến đổi ADN nhân Tuy có nhiều kỹ thuật khác kỹ thuật lại có tính đặc hiệu mặt hạn chế riêng Phương pháp dựa sở protein Phương pháp nhờ vào liên kết đặc hiệu protein kháng thể Kháng thể tác nhân bảo vệ thể chống lại xâm nhập vi khuẩn virus Khi kháng thể nhận phân tử lạ liên kết với phân tử này, phân tích phát GMOs phức tạp mối liên kết nhận biết nhờ phản ứng hình thành sắc tố Đây kỹ thuật ELISA, kháng thể cần thiết để nhận biết protein khơng sinh không nhận protein Protein phải làm từ thân GMOs tổng hợp thư viện thành phần axit amin protein biết rõ Kỹ thuật phát 35 protein đặc hiệu sử dụng ELISA thích hợp với việc phân tích ngun liệu thơ Phương pháp khuyếch đại dựa sở nucleotit + Phương pháp dựa sở ARN: phương pháp nhờ vào liên kết đặc hiệu phân tử ARN phân tử ADN ARN tổng hợp gọi đoạn mồi (primer) Primer phải bổ sung với trình tự nucleotit điểm khởi đầu phân tử ARN Kết phân tử tách đôi tương tự ADN Thường liên kết ARN primer dẫn đến chuyển hóa phân tử ARN thành phân tử ADN thơng qua q trình chép ngược Cuối cùng, ADN nhân lên nhờ PCR Hoặc ARN phiên mã thành hàng trăm copy phân tử ARN gốc q trình lặp lại nhờ sử dụng phân tử ARN copy mẫu chuẩn kỹ thuật NASBA (Nucleic acid sequence-based amplification) + Phương pháp dựa sở AND: chủ yếu nhờ vào nhân đôi ADN đặc hiệu với kỹ thuật PCR Kỹ thuật dùng để xác định sản phẩm GM, với đoạn mồi (primer) thiết kế dựa trình tự điều tiết gen cấu trúc đoạn gen chuyển Các đoạn primer thiết kế có vài đặc điểm đặc biệt sử dụng để sàng lọc sản phẩm phát sản phẩm đặc hiệu Hai mạch ADN tổng hợp có vai trò quan trọng chuỗi phản ứng trùng hợp này, mạch ADN bổ sung với mạch cặp mồi Primer thứ cặp đôi mã hố cho chuỗi ADN nhân đơi, primer thứ bắt cặp với mạch ADN lại khơng mã hố chuỗi ADN Trong phản ứng PCR, giai đoạn chu kỳ: phân tử ADN tách đôi Giai đoạn 2, diễn bắt cặp đoạn primer với chuỗi ADN bổ sung chúng Giai đoạn tạo thành hoàn hảo chuỗi ADN gốc nhờ bổ sung nucleotit thích hợp để kết thúc đoạn primer Khi chu trình hồn thành 36 ta lặp lại chu trình này, chu kỳ kết thúc số lượng lại tăng lên gấp đơi, kết sản phẩm khuếch đại nhanh Sau 20 chu kỳ, số lượng tăng gấp triệu lần Tuy nhiên, chu kỳ định số lượng sản phẩm khuếch đại bị ức chế, không tăng lên Kỹ thuật PCR khơng thích hợp để phát thực phẩm qua chế biến mức độ cao đoạn ADN thực phẩm bị đứt thành mảnh nhỏ Tuy nhiên, PCR kỹ thuật phổ biến sử dụng rộng rãi, phương pháp nhạy có tính đặc hiệu cao, phát axit nucleic khối lượng nhỏ Kỹ thuật PCR không sử dụng để xác định sản phẩm GM mà sử dụng vào mục đích định lượng, định tính Vì mà có quantitative- PCR, multiplex- PCR, real- time PCR, qualitative- PCR… Để tuân theo ngưỡng dán nhãn GMOs có thành phần thực phẩm, real- time PCR, quantitative competitive PCR (QC- PCR) ứng dụng nhiều phòng thí nghiệm để kiểm sốt thức sản phẩm thực phẩm Khi đưa gen chèn vào thể thực vật gen thường chứa trình tự điều khiển chứa gen đặc hiệu (gen quy định tính trạng mong muốn) Hiện nay, hầu hết thực vật chuyển gen có chứa trình tự khởi động promoter 35S CaMV (small subunits of cauliflower mosuic virus) virus khảm súp lơ đoạn kết thúc terminator NOS (Nopalin synthase) plasmid vi khuẩn Agrobacterium, trình tự mã hố gen chuyển Chính mà sử dụng PCR để xác định xem có phải GMOs hay khơng, thường sử dụng cặp primer 35S primers NOS primers đặc hiệu cho gen chuyển, primer tổng hợp phần hay tồn trình tự gen 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Quốc Dung Công nghệ chuyển gen ĐH Huế, 2006 Trịnh Đình Đạt Cơng nghệ sinh học Tập bốn NXB Giáo dục http://vietsciences.org 38 http://agbiotech.com.vn http://sinhhocvietnam.com.vn http://isa-cnsh.org http://www.hcmbiotech.com.vn http://kenh14.vn 39 ... thâm nhập vào tế bào thực vật (mang gen vir) Plasmid thứ mang gen chọn lọc thực vật gen ghép vào gen thực vật Khi plasmid đưa vào chủng Agrobacterium có chứa Ti plasmid, sản phẩm mang gen vir đưa... biến nhờ vào khả gắn gen ngoại lai vào hệ gen thực vật cách xác ổn định Sự chuyển gen thực vật dùng A tumefaciens dựa nguyên lý hình sau Hình1 Agrobacterium mang plasmid gây khối u thực vật (tumour... virus để chuyển gen thực vật sử dụng ADN virus khó ghép nối với hệ gen thực vật 3.2 Các phương pháp chuyển gen trực tiếp 3.2.1 Chuyển gen súng bắn gen (gene gun) Hình Súng bắn gen * Nguyên lý