Nghiên cứu di truyền hàm lượng protein cao ở lúa

Header Page ofVăn 128 thạc sĩ khoa học Luận Nghiên cứu di truyền hàm lượng protein cao lúa Nguyễn Thị Thu Hương Trường Đại học Khoa học Tự nhiên; Khoa Sinh học Chuyên ngành: Di truyền học; Mã số: 60 42 70 Người hướng dẫn: TS Lã Tuấn Nghĩa Năm bảo vệ: 2011 Abstract Phân tích thành phần hàm lượng acid amin protein bố mẹ lai hạt lúa Đánh giá sự liên quan di truyề n ở mức đô ̣ phân tử giữa bố me ̣ và lai ở lúa Nghiên cứu di truyề n số lươ ̣ng liên quan đế n hàm lượng protein cao lúa Nghiên cứu tương quan số biểu hinh thái với hàm lượng protein hạt lúa Nghiên cứu tương quan giữa mô ̣t số tính tra ̣ng chấ t lươ ̣ng khác với hàm lươ ̣ng protein ở ̣t lúa Xác định chỉ số chọn lọc chọn giống lúa có hàm lượng protei n cao Keywords Di truyền học; Hạt lúa; Protein; Gen Content PHẦN 1: MỞ ĐẦU Tính cấp thiết ý nghĩa đề tài: Lúa gạo loại lương thực quan trọng giới nói chung Việt Nam nói riêng Lúa gạo trồng rộng khắp 112 nước giới; nguồn cung cấp lương thực chủ yếu 54% dân số giới (Nguyễn Minh Công cs., 2004) Ở số nước Ấn Độ, Trung Quốc, Indonesia, Nhật Bản, Việt Nam, lúa gạo lương thực Về mặt diện tích gieo trồng, lúa gạo lương thực có diện tích lớn thứ hai đứng sau lúa mì; Về sản lượng hàng năm, lúa gạo đứng thứ ba sau lúa mì ngơ (Nguyễn Minh Công cs., 2004) Về giá trị kinh tế, lúa gạo nguồn thu nhập nơng dân nhiều nơi giới mặt hàng xuất quan trọng số quốc gia đó có Việt Nam (hàng năm Việt Nam xuất khoảng 4,5 triệu gạo sang thị trường khác giới) Vì việc đầu luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page of 128 Header Page ofVăn 128 thạc sĩ khoa học Luận tư nghiên cứu nhằm nâng cao suất,chất lượng lúa gạo Việt Nam ln Chính phủ quan tâm,đặc biệt chất lượng gạo xuất vấn đề thách thức nhà chọn giống nhiều năm qua Ở Việt Nam năm gần đây,việc chọn tạo giống lúa đẩy mạnh, nhiều giống lúa suất, chất lượng tạo chuyển giao vào sản xuất Tuy nhiên ,về chất lượng gạo nói chung chưa cải thiện rõ rệt Để đánh giá chất lượng dinh dưỡng lúa gạo có nhiều chỉ tiêu khác nhau, chỉ tiêu quan trọng hàm lượng Protein hạt gạo Protein là nguồ n cung cấp dinh dưỡng và lươ ̣ng chủ yếu hàng ngày ; Là loại hợp chất hữu rấ t quan trọng và thiếu đố i với mỗi thể sống ; nó cung cấp từ 10 đến 15% lượng sống giúp thể sinh trưởng phát triển tốt Theo tính tốn, thể trưởng thành nam giới lượng protein thiết yếu ngày cần khoảng 55,5g phụ nữ 45g So với loại trồng khác nuôi sống người, lúa loại trồng có hàm lượng protein thấp (612%) Ở Việt Nam , các giố ng lúa đươ ̣c trồ ng và sử du ̣ng phổ biế n Khang dân 18, Q5, CR203.v.v lại giống lúa có hàm lươ ̣ng protein mức thấp, trung biǹ h chỉ đạt khoảng 7% (các giống cho có hàm lượng protein cao có hàm lượng trung bình đạt từ đến 10%) (Vũ Tun Hồng cs., 2005).Vì việc “Nghiên cứu di truyền hàm lƣợng protein cao lúa” việc làm cần thiết góp phần cung cấp thông tin,cơ sở liệu phục vụ cho việc tuyển chọn vật liệu lai tạo nhằm chọn giống lúa chất lượng cao phục vụ sản xuất Mục tiêu nghiên cứu: -Phân tích xác định di truyền hàm lượng protein hạt lúa - Phân tích hiệu gen tham gia qui định hàm lượng protein lúa -Phân tích tham số di truyền tính trạng GPC số giống lúa trồng Việt Nam -Xác định chỉ số chọn lọc chọn giống lúa có hàm lượng protein caonhằm định hướng chọn giống lúa chất lượng gạo tốt phục vụ sản xuất Nội dung nghiên cứu đề tài: -Phân tích thành phần hàm lượng acid amin protein bố mẹ lai luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page of 128 Header Page ofVăn 128 thạc sĩ khoa học Luận -Đánh giá sự liên quan di truyề n ở mức đô ̣ phân tử giữa bố me ̣ và lai -Nghiên cứu di truyề n số lươ ̣ng liên quan đế n hàm lươ ng ̣ protein cao ở lúa - Nghiên cứu tương quan số biểu hinh thái với hàm lượng protein hạt lúa - Nghiên cứu tương quan giữa mô ̣t số tính tra ̣ng chấ t lươ ̣ng khác với hàm lươ ̣ng protein ở hạt lúa - Xác định chỉ số chọn lọc cho ̣n giố ng lúa có hàm lươ ̣ng protein cao Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu giống lúa:Khang dân 18, Q5, P1, P4, P6, P290, AC5 quần thể lai F1, F2, BC Thời gian nghiên cứu: năm PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU - Các giống lúa: Khang dân 18, Q5, P290, P6, P4, P1, AC5, quần thể lai F1, F2 BC1(150-200 hạt/dòng) - Các vật tư hóa chất phục vụ công tác nghiên cứu, danh sách mồi SSR STT Tên mồi Mồi xuôi Mồi ngƣợc 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 RM8069 RM8133 RM8084 RM4355 RM6911 RM4499 RM2634 RM3515 RM1367 RM5303 RM5626 RM1359 RM6909 RM5579 RM4710 RM6836 RM2229 RM3827 RM5314 RM5509 5' AAA CCT CTC GCT GTA ATT AG 3' 5' AAA ACT GAC TGT TTG TTT AAATGAAAT3' 5' TGC GTT TCG ATT TCT TTT TA 3' 5' GGG ATG AGA GTA GAA GGC A 3' 5' GGT GAT TGC TAT TTA ACT TC 3' 5' AGC AAC TTG CAA GCT TTA AT 3' 5' GAT TGA AAA TTA GAG TTT GCA C 3' 5' ACG CTT GTG GTG TTT AAT AC 3' 5' GCA TCG TTC ATG TAC ACT GG 3' 5' GCC ATT TCT GCT CTT TCT TA 3' 5' GAT CAG TCG GTC ATA AAC G 3' 5' CCA AAG GTC AAC GAA TTC TA 3' 5"AAGTACTCTCCCGTTTCAAA3" 5' CAA ATA TTG GCA AAT AAA CT 3' 5"AACTGGTTACAAAGACATGG3" 5' TTG TTG TAT ACC TCA TCG AC 3' 5' AGC ACC TAA GCA TCT AGC AC 3' 5' CAC CAG CTT CAC TTC ATC TC 3' 5' AAT AAC CCT TGC ATA CAC AT 3' GATGATCCATGCTTTGGCC 5' TGA ACA TTT ATT GAT ATG GTA AA 3' 5' GTT ACT GCT GTA ATG TGA ATT GCT 3' 5' GGA AAG TTG TGT TCT TTG GC 3' 5' TAT ATG GCA AGC CTA GCG 3' 5' ACT TTT TCC AAA TTA TGC T 3' 5' GCT GAA CCC TGA GAA TAT GT 3' 5' TGC CGA GAT TTA GTC AAC TA 3' 5' CAC TGT GAA TAC ACA GGA AC 3' 5' CTG CTA CGC TGC TAC TCC TAG 3' 5' GTT TGC ATG GAG AAG AAG AA 3' 5' CAC CTT CCT CTT CTG CTG 3' 5' CGG CTG GTT AAT TAA TCA AA 3' CCTCCCATAAAAATCTTGTC 5' ATA TTG CCT CAT GGT AAT AA 3' TCATCTACATATGGGGACAC 5' AGG GTA AGA CGT TTA ACT TG 3' 5' CAT GTC ACC CAA AAC AAT TA 3' 5' CCT TTC TTC AAT CTG CAT TC 3' 5' CAT TTT GGT TGA GAG GTT TG 3' TTCCAGCAGAAAGAAGACGC luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page of 128 Header Page ofVăn 128 thạc sĩ khoa học Luận 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Xác định hàm lƣợng protein thành phần acid amin ̣t ga ̣o -Phân tích hàm lượng protein tổng số máy Kjeldahl -Định tính định lượng protein máy HPLC 2.2.2 Đánh giá sƣ ̣ liên quan đến di truyền mức độ hân p tử giƣ̃a bố me ̣ và lai -Tách chiết ADN theoqui trình sử dụng CTAB KebLlanes(2002) -Phương pháp PCR sử dụng mồi SSR McCouch -Điện di kiểm tra sản phẩm 2.2.3.Phương pháp nghiên cứu di truyền số lượng liên quan đến hàm lượng protein cao lúa -Phân tích hiệu gen tham gia qui định hàm lượng protein lúa -Phân tích tham số di truyền liên quan đến tính trạng GPC lúa - Nghiên cứu di truyền phân tử,di truyền hình thái -Phương pháp xử lý số liệu : Phân tích đa dạng di truyền giống lúa thực với phần mềm NTSYSpc 2.1 (Rohlf, F J., 2001) Số liệu xử lý chương trình thống kê Excel 2007 chương trình IRRISTART 5.0 for windows Phần 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Axid amine protein bố/mẹ lai (Bảng 3.1) Trong số liệu kết phân tích thành phần hàm lượng axit amin protein giống lúa bố, mẹ lai ghi nhận (Bảng 3.1) Ta thấy lai có đầy đủ thành phần axit amin thay bố, mẹ chúng Trong thành phần acid amine protein lai (từ a đến j) số có số lượng nhỏ lớn không đáng kể so với bố mẹ chúng; Tuy nhiên đại đa số lại có hàm lượng cao bố mẹ chúng, Do đó ta có thề kết luận, thành phần protein gạo bố mẹ lai có loại acid amine tương tự nhau, chúng lại có khác hàm lượng luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page of 128 Header Page ofVăn 128 thạc sĩ khoa học Luận chất (% chiếm chất khô % chiếm protein) Qua bảng ta thấy rõ được, lai có hàm lượng protein cao bố, mẹ chúng có nhiều loại acid amine bố mẹ mà % acid amine chiếm chất khô lượng protein cao bố mẹ Các phân tích phù hợp với phân tích trước Vũ Tun Hồng cộng (2005): Khi phân tích hàm lượng acid amine hạt lúa gạo cho thấy, acid amine (alanine, cystein, methionine, leusine, ) lai thường vượt trội bố mẹ có đóng góp quan trọng vào việc nâng cao hàm lượng protein tổng số 3.2 Sƣ ̣ liên quan di truyền mức độ phân tử giữa bố/mẹ lai Phân tích kiểu gen thị SSR F2(hình 3.1) Thống kê 20 locus SSR, sản phẩm PCR băng (bank) có kích thước nằm khoảng 120-300 bp, nhiên phổ biến nằm khoảng 130-250 (hình 3.1) Hình 3.1 Hình ảnh ADN bố mẹ lai sử dụng thị SSR (locus RM5626) Ghi chú: M: Marker; 1: KD18; 2: Q5; 3: a; 4: b; 5: c; 6: d; 7: e; 8: f; 9: g; 10: h; 11: i; 12: j; 13: AC5; 14: P1; 15: P4; 16: P6; 17: P290 Tổng số alen phát 20 locus 152 Số allen đa hình vị trí locus biến động từ 3-8, trung bình đạt 7,6 alen/locus Số lượng alen nhiều locus (locus RM5626-hình 3.1), locus cho số lượng alen (locus RM5314) Sau phân tích mức độ tương đồng kiểu gen sử dụng mồi SSR-PCR thấy lai có kiểu gen SSR giống với cặp bố, mẹ ban đầu chúng từ khoảng 65% trở lên (hình 3.1; hình 3.2, hình 3.3 ,bảng 3.2) luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page of 128 Header Page ofVăn 128 thạc sĩ khoa học Luận Qua bảng 3.2 ta thấy, a có kiểu gen giống với P1 (giống bố) 69%, giống với KD18 (giống mẹ) 82%; b có kiểu gen giống với P4 (giống bố) 64%, giống với KD18 (giống mẹ) 75% Như lai giống với bố, mẹ chúng (từ 65% trở lên) đặc biệt chúng giống mẹ so với bố Điều phù hợp với phân tích biến động hàm lượng protein nêu 3.3 Nghiên cƣ́u di truyề n số lƣơ ̣ng liên quan đế n hàm lƣơ ̣ng protein ở lúa (Bảng 3.3.) Hiệu gen tham gia qui định hàm lượng protein Hàm lượng protein gạo chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng dinh dưỡng lúa gạo Di truyền tính trạng hàm lượng protein phức tạp, có nhiều gen qui định hàm lượng acid amine thành phần, di truyên acid amine đó lại chịu ảnh hưởng hai nhóm cộng tính (additve) tính trội (dominance) Để hiểu rõ hơn, tiến hành thiết lập tổ hợp lai giống có hàm lượng protein cao giống có hàm lượng protein thấp: KD 18 x P1; KD 18 x P4; KD18 x P6; KD 18 x P290; KD 18 x AC5; Q5 x P1; Q5 x P4; Q5 x P6; Q5 x P290; Q5 x AC5 - Lấy 100 hạt F1 để nhân F2; (Bảng 3.3) - Qua bảng 3.3 thấy, hệ F1 tổ hợp lai cho giá trị nằm khoảng giá trị giống bố mẹ (có hàm lượng protein nằm khoảng trung gian giống có hàm lượng protein cao giống có hàm lượng protein thấp) Tuy nhiên, hệ F2 trung bình hàm lượng protein lại cao F1 ,do đó ta có thể tìm quần thể F2 cá thể có hàm lượng protein cao (thậm chí cao bố mẹ) Ở BC1 hàm lượng protein cao F1, điều chứng tỏ di truyền tính trạng hàm lượng protein cao có ảnh hưởng mẹ Khi tiến hành tính giá trị kiểu gen Pr1 (qui định hàm lượng protein thấp) Pr2 (qui định hàm lượng protein cao) tỷ số d/a (mức độ trội) thấy được,(ở bảng 3.4 )tất giá trị d < giá trị a; d>0 (nếu d trội phần) Điều chứng tỏ, gen tham gia qui định hàm lượng protein hạt gen tham gia qui định hàm lượng protein cao trội so với gen qui định hàm lượng protein thấp (d>o); nhiên tính trội khơng hồn tồn (d F crit (1.778927), với giống khác có khác hàm lượng chất amino acid cấu thành lên hàm lượng protein tổng số chất khô nội nhũ hạt Kết phù hợp với công bố trước IRRI ảnh ảnh hưởng yếu tố giống tới hàm lượng protein tổng số (Qui định 25% hàm lượng protein) Thành phần chất hay gen điều khiển hình thành tổng hợp amino acid chịu tác động yếu tố di truyền (giống) * Phương sai nhân tố (Ảnh hưởng nhân tố giống: Chiều cao cây, thời gian sinh trưởng lên hàm lượng protein)(Bảng 3.8) luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page of 128 Header Page ofVăn 128 thạc sĩ khoa học Luận Qua bảng 3.8 ta thấy, Ftn (=3.810192) > F crit (=2.333484), ta kết luận, hàm lượng protein giống chịu tác động đặc điểm hình thái (chiều cao cây, thời gian sinh trưởng) * Phương sai nhân tố (Ảnh hưởng nhân tố giống: Chiều cao cây, thời gian sinh trưởng khối lượng 1000 hạt lên hàm lượng protein)(Bảng 3.9) Qua bảng 3.9 ta thấy, dp P-value (=0.049519) < 0.05 nên ta có thể kết luận, đặc điểm hình thái ảnh hưởng khác tới hàm lượng protein tổng số Các kiểu tác động gen lên hàm lượng protein lúa(Bảng 3.10) Qua phân tích ta thấy, hàm lượng protein F1 nằm khoảng (cây có hàm lượng protein cao có hàm lượng protein thấp), nhiên tới F2 BC1, hàm lượng protein trung bình quần thể cao so với F1, điều chứng tỏ có cá thể có hàm lượng protein cao (thậm chí cao bố mẹ) (Bảng 3.10 – F1 KD18 x AC5 (8,35%); F2 KD18 xAC5 (9,15%), ) từ đó ta có thể đến nhận xét, di truyền tính trạng protein cao lai mang tính cộng hưởng bố mẹ Bảng 3.11 Thiết lập hệ di truyền tổ hợp lai Qua bảng thấy, giá trị E dương có khác tổ hợp lai, Điều chứng tỏ tác động mơi trường lên tính trạng protein cao, tác động có khác tổ hợp lai hay có tác động giống lên hàm lượng protein tổng số Điều khẳng định biến động hàm lượng protein lớn hệ số di truyền theo nghĩa rộng nhỏ, H bs cao ảnh hưởng trội cao Do đó, chương trình lai tạo, nên chọn dòng mẹ có hàm lượng protein cao có hệ số di truyền lớn để có thể chọn lọc cá có hàm lượng protein cao 3.4 Tƣơng quan giƣ̃a mô ̣t sớ biểu hình thái với hàm lƣơ ̣ng protein ở lúa 3.4.1 Phân tích tính trạng nơng học (cao cây, suất, thời gian sinh trưởng ) lúa F2 (Bảng 3.12) Về thời gian sinh trƣởng: qua bảng 3.12., giống lúa bố, mẹ thấy, giống P6 giống có thời gian sinh trưởng dài (169 ngày), giống Khang dân 18 có thời gian sinh trưởng ngắn (109 ngày); Ở F2, có thời gian sinh trưởng dao động từ 110 ngày đến 150 ngày Giống có th ời gian luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page of 128 Header Page ofVăn 128 thạc sĩ khoa học Luận sinh trưởng ngắn đặc điểm có lợi cho công tác chọn tạo giống mà nhà chọn tạo giống hướng tới Chúng ta thấy, đặc điểm trì số F2 a, d, f, i, tổ hợp lai tương ứng KD 18 x P1, KD 18xP290, Q5 x P1, Q5 x P290 Như vậy, muốn có giống có thời gian sinh trưởng ngắn ngày, bố mẹ phải có thời gian sinh trưởng ngắn đồng thời F2 tổ hợp lai có ý nghĩa định cho trình chọn tạo giống Về chiều cao cây: Theo hệ thống tiêu chuẩn đáng giá nguồn gen lúa IRRI, chiều cao lúa chia làm mức ứng với thang điểm: 1-Bán lùn; (130 cm) (SES, 2002) Theo số liệu bảng 3.12 thấy, chiều cao bố mẹ ban đầu nằm thang điểm 1, Ở F2 có dạng hình chiều cao bán lùn, (thang điểm 1, ứng với chiều cao 0); hàm lượng protein với khối lượng 1000 hạt, chiều dài, rộng đòng có mối tương quan nghịch biến (hệ số tương quan tương ứng là: 0.468259, -0.70611, -0.561560) Hàm lượng protein với khối lượng 1000 hạt, chiều dài, rộng đòng có mối tương quan nghịch biến (hệ số tương quan tương ứng là: -0.468259, -0.70611, -0.56156