Tiêu bản cắt ngang qua cơ thể giun đũa và cơ thể giun đất

Nguyên tắc định hình : Mẫu vật khi định hình phải theo các nguyên tắc : - Định hình nhanh : tức là mô , một bộ phận cơ thể hay cả cơ thể con vật sau khi vừa được tách ra là phải cho ng

Trang 1

Luận văn tốt nghiệp

2 CÁC PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN :

2.1.1.2 Giun đất ( Pheretima sp ):

Ở Việt Nam giống Pheretima thường gặp ở nhiều nơi , gồm nhiều loài

Giun đất sống chui rúc trong đất ẩm nhiều mùn rác Giun đất là động vật có ích trong nông nghiệp , vì nó làm xốp đất , góp phần làm cho đất trở nên có cấu tượng và màu

sẽ phát triển thành một con giun mới hoàn chỉnh Bằng cách này cũng có thể làm gia tăng số lượng giun dự trữ trong các bễ nhân nuôi

làm tiêu bản về sau (Thanh ; 1980).

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Trang 2

2.1.2.2 Nguyên tắc định hình :

Mẫu vật khi định hình phải theo các nguyên tắc :

- Định hình nhanh : tức là mô , một bộ phận cơ thể hay cả cơ thể con vật sau khi vừa được tách ra là phải cho ngay vào dung dịch định hình Nếu vì lý do nào đó chưa định hình được thì phải ngâm ngay mẫu vật vào dung dịch sinh lý Đối với các mẫu vật có kích thước lớn thì cần thiết phải tiêm thuốc định hình vào bên trong rồi mới ngâm vào dung dịch định hình Đối với những mẫu vật có xoang cơ thể rỗng ở trong phải tiêm thuốc định hình vào đầy xoang trước để tránh mẫu không bị nhăn nhúm khi ngâm vào dung dịch định hình

- Thể tích của dung dịch định hình phải lớn hơn thể tích của mẫu vật từ 20-30 lần Bề mặt của mẫu vật phải được tiếp xúc đồng đều với chất định hình , vì thế nếu mẫu vật nổi thì có thể ghim vào một tấm cao su hay gỗ nhỏ rồi ngâm lật úp vào trong dung dịch định hình Nếu mẫu vật chìm sát dưới đáy thì cần phải lót ở đáy lọ một lớp bông thủy tinh rồi để mẫu vật lên trên

Sau khi định hình mẫu vật cần được rữa sạch trong nước hay trong cồn tùy theo từng loại thuốc định hình Nếu mẫu vật chưa làm tiêu bản được ngay thì có thể lưu trữ lâu dài trong cồn 700 (Thanh , 1980 ).

+ Dung dịch Boanh ( Bouin ) là chất định hình rất tốt , được dùng phổ biến

để định hình trong thực hiện tiêu bản lát cắt của nhiều loại động vật khác nhau

Thành phần : gồm dung dịch acid picric bão hòa : 15 phần ; formalin nguyên chất : 5 phần ; acid acetic : 1 phần

+ Dung dịch Carnau (Carnoy ) gồm cồn 1000 : 6 ml ; chloroform : 30 ml ; acid acetic đặc : 10 ml Dung dịch pha trước khi dùng

Sau khi định hình rữa mẫu vật trong cồn 1000 Dung dịch định hình này xuất hiện rất nhanh trong mẫu vật nên thường dùng để định hình những mẫu vật có vỏ

cứng ít thấm như côn trùng , giun (Thanh , 1980 ).

HgCl2 tới bão hòa (khoảng 25g ) ( Gray , 1968 )

Trang 3

2.1.2.4 Tiêu chuẩn của một chất định hình tốt :

- Ngấm nhanh vào tổ chức , giết nhanh tế bào

- Bảo toàn hay chỉ làm thay đổi rất ít những cấu trúc cơ bản của tổ chức tế bào , chống lại sự tiêu hủy do men nội bào , nhất là làm cho protein thành axit amin

- Những thành phần của tế bào cần tìm không được hòa tan , không những chịu được những khâu tác động của các khâu kỹ thuật về sau mà còn chuẩn bị tốt cho các khâu kỹ thuật ấy

- Không làm cho tổ chức , tế bào và những thành phần của chúng bị méo

mó , biến dạng , nhất là không sinh ra những hình giả tạo ( Gray , 1968 ).

2.1.2.5 Thời gian định hình thích hợp :

Thời gian định hình phải được lựa chọn tùy theo mục đích , đối tượng nghiên cứu và chất định hình Định hình quá lâu hoặc quá nhanh đều không có lợi cho

việc làm tiêu bản sau này , đặc biệt là tiêu bản lát cắt (Thanh , 1980 ).

- Rất khó qui định cụ thể vì thời gian này phụ thuộc vào loại mẫu vật , độ dày mẫu vật , vận tốc xuyên thấm và vận tốc cố định của dung dịch cố định , nồng độ dung dịch cố định … Ngay đối với một dung dịch cố định đã biết kinh nghiệm của các tác giả cũng không thống nhất về thời gian cố định

- Thông thường những mẫu vật cố định trong dung dịch Bouin theo những yêu cầu đã nêu trên cần được ngâm trung bình từ 1 đến 3 ngày

- Hậu quả của những thiếu sót trong kỹ thuật cố định là mẫu vật bị “sống” hoặc “ chín quá ”

+ Mẫu “sống” thường mềm , tổ chức bị thoái hóa hoại tử dễ sinh ra những tổn thương và hình giả tạo Khi nhuộm bắt màu tồi Mẫu quá dày thời gian cố định ngắn , dung dịch cố định không đủ lượng , lại đã dùng nhiều lần v.v…sẽ làm cho mẫu bị “ sống”

+ Trái lại mẫu quá “ chín” quá cứng chắc , giòn khi cắt Dù cẩn thận khi cắt mảnh nó vẫn bị vỡ hoặc dễ nát và khi nhuộm tính bắt màu cũng giảm rõ , nhân tế

bào dễ bị nhăn nhúm Mẫu quá “chín” do thời gian cố định quá dài (Hoè, 1976).

2.1.3 Phương pháp làm tiêu bản lát cắt :

Khi cần nghiên cứu cấu trúc cơ thể hoặc một cơ quan của loài sinh vật nào người ta thường làm tiêu bản lát cắt Hiện nay có nhiều phương pháp làm tiêu bản lát cắt như phương pháp cắt lạnh , phương pháp cắt mẫu trong cenloidin , trong gelatin… phương pháp thông dụng là cắt mẫu trong paraffin Có thể chia quá trình cắt mẫu trong paraffin thành 3 giai đoạn

2.1.3.1 Chuẩn bị mẫu và đúc mẫu :

Sau khi định hình , mẫu vật cần được rữa sạch bằng cồn hoặc nước cất

và rút thật hết nước bằng cồn có nồng độ tăng dần 400_ 700 – 960 – 1000 (2 lần ) Đối với các mẫu vật mềm nên dùng cồn với nồng độ tăng dần dần 400- 500- 600- 700- 800-

Trang 4

thuộc vào tính chất của mẫu vật Sau khi rút hết nước thì chuyển mẫu vật sang một chất trung gian như : xylen , toluen hay benzen, chloroform , v.v…

Trước khi cho mẫu vật vào chất trung gian nên chuyển qua hỗn hợp cồn - chất trung gian ( tỉ lệ 1:1 ) Thời gian ngâm mẫu trong chất trung gian thay đổi từ 20 phút đến 2 giờ tùy thuộc vào tính chất và kích thước mẫu vật Sau đó chuyển mẫu vật vào lọ có nắp kín chứa paraffin và chất trung gian rồi cho vào tủ ấm và giữ nhiệt độ

370C trong khoảng 2 đến 12 giờ Bước tiếp theo là chuyển mẫu vật sang lọ chứa paraffin nguyên chất nóng chảy giữ trong tủ sấy với nhiệt độ bằng nhiệt độ nóng chảy của paraffin (55- 560C) từ 1 đến 2 ngày Nên đổi paraffin 2 lần

Để đúc mẫu trong paraffin cần có các khuôn đúc bằng kim loại , bằng dĩa kính hay bằng giấy bóng mờ Tốt nhất là nên gấp những khuôn đúc bằng giấy bóng mờ

có kích thước thích hợp với từng loại mẫu vật

Paraffin nóng chảy được đổ vào các khuôn cho vừa đầy hoặc cũng có thể pha thêm từ 5 – 10 % sáp ong , tùy thuộc vào điều kiện thời tiết Dùng kẹp đã hơ nóng điều chỉnh cho mẫu vật ngay ngắn

2.1.3.2 Cắt mẫu :

Để có được lát cắt đúng tiêu chuẩn cần có máy cắt microtome

Trước khi cắt cần chuẩn bị đầy đủ những dụng cụ cần thiết Dung dịch dán lát cắt như hỗn hợp albumin và glycerin Có thể sử dụng hỗn hợp này theo 2 cách :

+ Nhỏ một giọt hỗn hợp lên trên lame rồi dùng ngón tay sạch quệt nhiều lần để tạo thành một lớp mỏng , sau đó nhỏ một giọt nước lên rồi đặt lát cắt vào

+ Pha một giọt hỗn hợp với 4 ml nước cất , sau đó nhỏ một giọt dung dịch này lên lame và đặt lát cắt lên trên

Đặt lame vào tủ sấy với nhiệt độ 500C Khi nước đã bay hết , sấy với nhiệt độ 37-400C tối thiểu là 24 giờ rồi sau đó tiến hành nhuộm

2.1.3.3 Nhuộm và gắn tiêu bản :

Tùy theo đối tượng , mục đích nghiên cứu và chất định hình đã dùng mà lựa chọn các loại thuốc nhuộm cho thích hợp Tuỳ theo nguồn gốc mà các loại thuốc nhuộm được chia thành 3 nhóm là : nhóm có nguồn gốc từ thực vật , nhóm có nguồn gốc động vật và nhóm được tổng hợp bằng phương pháp hóa học Theo tính chất hóa học người ta cũng chia thuốc nhuộm thành 3 loại : thuốc nhuộm axít , thuốc nhuộm bazờ và thuốc nhuộm trung tính Thuốc nhuộm được pha trong cồn hay nước cất

Có hai phương pháp nhuộm là : nhuộm tiến và nhuộm lùi

+ Phương pháp nhuộm tiến : Thuốc nhuộm được pha với nồng độ loãng

và quá trình nhuộm diễn ra tư từ trong khoảng thời gian từ một vài phút cho tới khi các cấu trúc của m ẫu vật bắt màu rỏ là được

+ Phương pháp nhuộm lùi : là nhuộm lát cắt trong thuốc nhuộm có nồng

độ cao nên bắt màu đậm hơn mức cần thiết Sau đó tiến hành biệt hóa trong các chất riêng biệt để nhận được màu thích hợp Thực chất của vấn đề này là do một số cấu

Trang 5

trúc của mô và tế bào có khả năng bắt màu thuốc nhuộm như nhau nhưng khi nhã màu trong các chất biệt hóa lại xảy ra với tốc độ khác nhau nên lát cắt trở nên rỏ nét hơn trên tiêu bản Trước khi nhuộm lát cắt cần được giải phóng khỏi paraffin bằng cách như sau :

- Ngâm tiêu bản vào xylen ( hay trong các dung môi tương tự như : toluen , benzen ) 3-5 phút

- Rút xylen ra khỏi lát cắt bằng cách ngâm tiêu bản vào cồn tuyệt đối 2-3 phút

- Chuyển tiêu bản sang các dung dịch cồn có nồng độ giảm dần từ từ 960 - 700 -

- Ngâm tiêu bản vào hỗn hợp dung dịch xylen – phenol để rút kiệt nước

- Làm trong tiêu bản trong xylen 3-5 phút

- Gắn tiêu bản bằng keo gắn Canada và sấy khô trong tủ sấy với nhiệt độ

Trang 6

Khi nhuộm có thể dùng một loại thuốc nhuộm gọi là nhuộm đơn , có thể dùng phối hợp 2 hay một số thuốc nhuộm gọi là nhuộm kép Trong đó phương pháp nhuộm kép có nhiều ưu việt hơn cho thấy rỏ nét hơn các cấu trúc của tiêu bản

Nhuộm 2 màu Hematoxylin - Eosin:

Đây là phương pháp thông thường và phổ biến nhất được dùng để nhuộm lát cắt

Các tiêu bản lát cắt sau khi được giải phóng paraffin và ngâm vào cồn có nồng độ thấp dần được đem nhuộm theo tuần tự như sau :

- Nhuộm hematoxylin từ 3 đến 45 phút tùy theo loại thuốc dùng và tính chất của tiêu bản

- Rữa kỹ tiêu bản trong nước chảy cho đến khi tiêu bản có màu xanh

- Có thể biệt hóa vài giây trong cồn : axít clohydric (HCl) loãng

- Phễu thủy tinh

- Máy cắt vi mẫu (microtome)

Trang 7

Trang 9

3 CÁC BƯỚC THỰC HIỆN ĐỀ TÀI :

3.1 Chọn và thu mẫu :

3.1.1 Giun đũa heo (A suum) :

Mẫu vật được thu tại lò giết mỗ gia súc (xưởng chế biến thực phẩm 1) trực thuộc Công ty Thương Mại Tổng Hợp Cần Thơ Số 1 – Ngô Quyền

Thời gian thu mẫu từ 12 giờ đêm đến 4 giờ sáng

Sau khi thu , mẫu được rữa sạch rồi cho vào dung dịch sinh lý đã chuẩn

bị sẵn

3.1.2 Giun đất (Pheretima sp ) :

Thường thu ở nơi đất xốp , nhiều mùn Việc thu mẫu Giun đất vào mùa mưa thường thuận lợi hơn nhiều so với thu mẫu trong mùa nắng Vì mùa mưa đất ẩm , mùn ẩm dễ tìm thấy Giun đất ở lớp đất mặt không sâu và dễ đào Mùa nắng đất khô Giun đất chui rúc xuống lớp đất sâu bên dưới , nơi vùng trũng ẩm hoặc bề mặt phủ đầy

cỏ , mùn , rác Một số Giun đất có ở cạnh các bờ mương nơi đất ẩm ướt

Khi đào Giun đất ta dùng len đào thành tảng đất lớn , sau đó bẻ ra tìm Giun đất Mục đích là tránh làm tổn thương thuận tiện cho việc nuôi làm sạch phân Chọn mẫu : thông thường ta nên chọn những con có kích thước lớn , còn mạnh để khi làm sạch phân giun không bị chết

3.2 Định hình :

3.2.1 Chuẩn bị mẫu trước khi định hình:

3.2.1.1 Giun đất :

Trước khi định hình ta phải làm thật sạch phân trong ruột của nó Có 2

cách làm sạch phân trong ruột Giun đất :

* Cho giun bò trên giấy thấm có đủ độ ẩm , phải thay giấy hằng ngày cho đến khi giun thải hết phân , đồng thời giấy thấm cũng hút sạch hết chất nhờn bên ngoài

cơ thể Giun đất Cách này tốn công và cần có thời gian tương đối dài, nhưng có ưu điểm là vẫn giữ được trạng thái tự nhiên của Giun đất

* Cầm giun ở phần đầu , phần đuôi để buông thỏng , dùng hai ngón tay cái và trỏ của tay còn lại vuốt nhẹ dọc theo cơ thể Giun đất từ đầu đến đuôi cho phân thải ra từ từ Tránh đừng để giun chết Lặp lại nhiều lần đến khi thấy toàn thân con vật hơi trong suốt , từ màu xám ngã sang màu đỏ hồng thì dừng lại Lúc đó ruột Giun đất đã sạch phân Cách này có nhược điểm là dù có vuốt nhẹ tay đi nữa nhưng cũng làm cho nội quan của con vật bị xáo trộn và dễ tổn thương do sự cọ sát giữa tay và thân Giun đất , đồng thời cũng có sự cọ sát giữa đất và thành ruột gây nên Cách này làm nhanh nhưng kết quả không tốt bằng cách trên

Trang 10

* Sau khi làm sạch phân trong ruột Giun đất đến mức tối đa , ta để giun

bò trên giấy thấm vài giờ để hút sạch chất nhờn rồi đem định hình ngay Điều tối kỵ là tránh để giun chết

- Đối với Giun đũa heo định hình trong : 3 giờ

- Đối với Giun đất định hình trong : 5 giờ + Định hình bằng dung dịch Carnoy – Lebrun :

- Đối với Giun đũa heo định hình trong : 2 giờ

- Đối với Giun đất định hình trong : 3 gi ờ

3.2.4 Rữa chất định hình (Thao tác phụ sau khi cố định):

Việc cố định mẫu vật bằng dung dịch Bouin , Carnoy – Lebrun có thể làm sai khác cấu trúc mẫu vật nên phải rữa sạch để loại đi chất định hình có trong mẫu Tuy nhiên việc rữa này thì không đơn giản trong trường hợp chất định hình chứa mercuric chloric (HgCl2 ) hoặc picric acid

+ Bouin :Những mô được định hình trong dung dịch này thì có màu sáng chói của picric acid Tất cả những màu vàng sáng chói này không thể loại đi do nó đã hình thành nên một cấu trúc phức tạp với protein

Phương pháp để loại màu vàng ra khỏi mẫu là ngâm mẫu vật vào dung dịch Lenoir ( cách pha phần phụ lục ) Với dung dịch này thì hầu hết picric acid được loại ra khỏi mẫu vật rất tốt

Sau đó rữa mẫu vật bằng nước máy và tráng lại bằng nước cất

+ Carnoy – Lebrun : HgCl2 hiện diện lâu dài với những tinh thể nhỏ trong mô Những tinh thể nhỏ này có thể được ngăn chặn bằng cách ngâm mẫu vật sau khi định hình qua đêm vào trong dung dịch Lugol ( Cách pha phần phụ lục )

Trang 11

Sau khi mẫu được ngâm trong dung dịch Lugol qua đêm sẽ được chuyển tới cồn 700 cho đến khi mẫu không còn màu trôi ra nữa Mẫu vật được xử lý như vậy sẽ không bao giờ thấy những tinh thể nhỏ hiện diện khi định hình bằng dung dịch Carnoy – Lebrun

3.3 Đúc khuôn :

3.3.1 Mục đích :

Cố định chỉ mới giết chết tế bào và giữ cho những thành phần của nó được bất động trong tình trạng tĩnh Nếu mẫu vật cố định đem cắt mỏng ngay , mối liên hệ giữa tế bào và tổ chức cũng như cơ cấu của tế bào sẽ bị thay đổi biến dạng , thậm chí đảo lộn do tác động cơ học của lưỡi dao và mẫu vật Do đó đúc khuôn tạo thuận lợi cho việc cắt mẫu và đảm bảo cấu trúc của tổ chức không bị xáo trộn khi cắt thành lát

3.3.2 Môi trường tẩm :

Để giải quyết khuyết điểm trên , cần phải có một chất làm nền cho mẫu

vật , vừa như một cái khuôn giữ vững mẫu vật , vừa thâm nhập được vào trong tế bào , giữ cho các thành phần của tế bào cũng như của tổ chức được yên vị khi cắt mảnh , đó

là sự tẩm Như vậy , tẩm không chỉ là một sự bọc đơn thuần mà chính là một sự tẩm thực sự vào trong tổ chức thuộc lĩnh vực tế bào

Chất tẩm tốt phải có mật độ thích hợp và dễ ngấm Mật độ có đủ chắc thì làm khuôn mới cứng , cố định mới chặt , nhưng đồng thời cũng phải đủ mềm thì dao mới dễ cắt Muốn ngấm tốt thì chất tẩm phải có một thời gian được xử lý ở trạng thái lỏng

Như vậy là một chất tẩm phải vừa chắc vừa mềm , vừa đặc ,vừa lỏng khi cần

Mỗi chất tẩm đều có những ưu điểm và những hạn chế nhất định Ở đây , dùng chất tẩm là paraffin và đây cũng là chất tẩm thông dụng nhất trong khi cắt mẫu Paraffin là một chất dễ tìm , có mật độ rất thích hợp nhưng lại không hòa tan trong nước Vì vậy , mẫu vật phải được xử lý nước trước khi tẩm paraffin

3.3.3 Khử nước mẫu vật :

Mẫu vật sau khi định hình và rửa kỷ được cắt thành từng đoạn ngắn dài

khoảng 2cm trở lại Sau đó cho vào cồn để rút kiệt nước Tuy nhiên , nếu để ngay vào cồn cao độ do mất nước đột ngột , nhanh chóng sẽ gây tác hại là làm sụp đỗ các xoang cơ thể dẫn đến sự méo mó mẫu vật Do đó ta cần cho mẫu vật lần lượt vào các

Trang 12

- Cồn 700 x 1 giờ

- Cồn 960 x 1 giờ

- Cồn 96 x 1 giờ

- Cồn 1000 x 2giờ hoặc n- Butanol x 2 giờ

- Cồn 1000 x 2giờ n- Butanol x 2 giờ

+ Mẫu vật định hình trong dung dịch Carnoy – Lebrun :

- Cồn 700 x 1 giờ

- Cồn 700 x 1 giờ

- Cồn 960 x 1 giờ

- Cồn 1000 x 2 giờ hoặc n- Butanol x 2 giờ

- Cồn 1000 x 2 giờ n- Butanol x 2 giờ

+ Việc rút nước có ảnh hưởng rất quan trọng đến khả năng ngấm paraffin về sau của mẫu vật nên thể tích cồn trong từng lọ phải gấp 20 – 30 lần thể tích mẫu vật để tránh làm loãng cồn

+ Khi chuyển mẫu cần cho mẫu lên giấy thấm để thấm bớt nồng độ cồn cũ nhằm hạn chế làm giảm nồng độ cồn mới

+ Trên thị trường cồn tuyệt đối (9905) nên việc loại bỏ nước được thực hiện bằng cách dùng sulfate đồng (CuSO4 )

3.3.4 Tẩm paraffin :

Vì paraffin không tan trong nước và cồn nên trước khi tẩm paraffin , cho mẫu vật vào lọ đựng chất dung môi trung gian vừa làm tan paraffin vừa tan trong cồn , chẳng hạn như : xylene , toluen , benzen , chloroform , …

Giun đũa , Giun đất là những mẫu vật tương đối nhỏ và mềm nên ở giai đoạn này ta sử dụng dung môi trung gian là chloroform

Khi chuyển mẫu vật sang chloroform nếu thấy hiện tượng đục thì chứng

tỏ mẫu vật chưa được rút hết nước Khi đó cần phải xử lý rút nước thêm một lần nũa Cách tốt nhất là trước khi cho mẫu vật vào chloroform nên chuyển qua lọ đựng hỗn hợp cồn tuyệt đối : chloroform (tỉ lệ 1:1) Thời gian ngâm là 1 giờ

Sau đó , ngâm mẫu trong chloroform , 10 giờ

Chuyển mẫu sang lọ có nắp kín đựng hỗn hợp paraffin : chloroform (tỉ lệ 1:1)

Trang 13

Chuyển mẫu sang lọ đựng paraffin nóng chảy giữ trong tủ sấy nhiệt độ khoảng 600C để paraffin nóng chảy , thời gian ngâm mẫu là 24 giờ Các lọ đựng mẫu này cần phải để hở nắp cho chloroform bay hơi hết

Thay paraffin mới và tẩm mẫu trong thời gian 24 giờ ở nhiệt độ vẫn là khoảng 600C

+ Có thể sử dụng paraflast thay thế cho paraffin , nhưng khi sử dụng dể việc cắt mẫu được dễ dàng cần pha thêm khỏang 5% sáp ong

3.3.5 Đúc mẫu :

+ Xếp khuôn đúc :

Để đúc được mẫu ta cần phải có các khuôn đúc

Dùng giấy bìa cứng (không màu ) xếp thành các khuôn có kích thước ( 3

Trang 14

Khi đúc mẫu xong , khối mẫu được dự trữ trong tủ lạnh Sau 24 giờ tiến hành cắt mẫu

3.4 Cắt mẫu :

3.4.1 Mục đích :

Muốn quan sát cấu tạo lát cắt ngang cơ thể mẫu vật dưới kính hiển vi , ta phải cắt chúng thành những lát rất mỏng gọi là vi mẫu Bề dày của lát cắt chỉ nên gồm vài lớp tế bào và phải trong suốt để ánh sáng có thể xuyên qua

3.4.2 Thao tác :

~ Chuẩn bị :

Trước khi cắt chuẩn bị sẵn phương tiện và khối mẫu sẵn sàng

+ Phương tiện :

Máy cắt : được tra lưỡi lam vào dao cố định

Vài miếng gỗ nhỏ , kẹp, ống nhỏ giọt , bút lông , nước đá , nước ấm (500C ) , đèn cồn , dao , v.v…

+ Khối mẫu :

Lấy khối paraffin có chứa mẫu ra khỏi khuôn

Dùng dao gọt khối mẫu thành hình khối chữ nhật chứa mẫu ở giữa lớp paraffin cách đều mẫu khoảng 3cm Sau đó gắn khối mẫu vào miếng gỗ Có 2 cách gắn :

Trang 15

- Gọt khối mẫu hình khối chữ nhật thành khối mẫu hình thang cân rồi gắn lên khối gỗ

- Gắn khối mẫu hình khối chữ nhật lên miếng gỗ rồi mới tiến hành gọt thành hình thang cân

Khi thực hiện thì cách thứ hai có lợi hơn vì paraffin dễ bị mềm khi nhiệt

độ cao Nếu gọt trước thành khối có hình thang thì sẽ bị biến dạng khi hơ nóng và gắn

nó lên miếng gỗ Do đó ta gắn khối paraffin lên miếng gỗ trước chờ cho paraffin cứng lại mới gọt thành khối hình thang cân

Để khối mẫu gắn chặt vào miếng gỗ ( bàn giữ khối mẫu ) ta hơ nóng mặt đáy của khối mẫu và miếng gỗ đến khi paraffin bắt đầu chảy ra thì ép chặt mặt đáy khối mẫu vào miếng gỗ ở tư thế vuông góc

Dùng dao gọt khối mẫu thành hình thang cân , hai mặt đáy phải thật song song nhau và lớp paraffin chỉ còn cách mẫu khỏang 2mm Gắn miếng gỗ mang khối mẫu vào

Hình : Chuẩn bị cắt mẫu

Hình : mẫu được cắt thành băng

~ Điều chỉnh máy cắt và tiến hành cắt mẫu :

+ Điều chỉnh độ nghiêng của dao theo 1 góc khoảng 15 - 200

Trang 16

+ Đưa mẫu vật vào sát lưỡi dao , điều chỉnh sao cho mặt cắt của khối mẫu và lưỡi dao song song nhau

+ Điều chỉnh độ dày lát cắt từ 15 – 20 μm , quay đều tay , các lát cắt nằm ở trên mặt dao sẽ tạo thành dải băng dài Sau đó , điều chỉnh độ dày của lát cắt xuống 8 – 10 μm Và bắt đầu hứng lấy các lát cắt về sau :

3.4.3 Tải mẫu lên lame :

+ Cũng có thể chỉ ngâm vào dung dịch HCl 2% trong một giờ rồi rữa sạch acid bằng nước máy , tráng lại bằng nước cất

+ Đối với lame đã sử dụng rồi thì cần ngâm vào dung dịch Bicromate Kali (cách pha phần phụ lục ) Sau đó rữa bằng nước máy , tráng nước cất rồi lau khô

+ Khi dã có lame sạch , khô , ta nhỏ một giọt dung dịch dán Albumin : Glycerin (cách pha phần phụ lục ) lên lame và dùng một lame khác ép sát vào giọt keo dán kéo dài theo chiều dọc của lame để dung dịch dán tráng đều trên mặt lame một lớp mỏng

+ Cho lame vào tủ sấy , sấy khoảng một giờ ở nhiệt độ 500C để dung dịch dán bám vào lame

*Lưu ý : không nên tráng một lớp dày Albumin : Glycerin vì khi nhuộm dung dịch này sẽ bắt màu và dơ mẫu vật

~ Tiến hành :

Trên dải băng cắt ta chọn những mẫu tròn , nguyên vẹn , mỏng Dùng lưỡi lam cắt rời mẫu ra khỏi băng , dùng kẹp gắp mẫu đặt lên lame đã nhỏ sẵn một giọt nước ấm khỏang 500C Khi đó , lát cắt sẽ dãn ra , rồi để nghiêng lame cho nước chảy ra bớt

Đặt lame lên khay cho vào tủ sấy , sấy một ngày ở nhiệt độ 500C để cho nước bốc hơi đoạn băng sẽ dãn ra và dính vào lame Không nên để nhiệt độ cao hơn vì paraffin nóng chảy sẽ làm hỏng lát cắt

Hạ nhiệt độ tủ sấy xuống 370C trong 24 giờ rồi tiến hành nhuộm mẫu

3.5 Nhuộm mẫu :

3.5.1 Mục đích :

Để phân biệt rõ các cấu trúc của mẫu vật cần quan sát , vì các cơ quan bộ phận trong cơ thể ở đây là các cấu trúc trên tiết diện cắt ngang ăn màu thuốc nhuộm khác nhau

Trang 17

+ Các giai đoạn thực hiện :

Vì mẫu được tẩm và bao bọc trong paraffin nên trước khi nhuộm phải làm tan paraffin loại chúng ra khỏi lát cắt

Loại paraffin

Trang 18

Lấy tiêu bản đã được sấy trong tủ sấy ra hơ trên ngọn lửa đèn cồn cho paraffin hơi chảy ra rối ngâm vào xylen (I) để paraffin loại ra khỏi lát cắt Giai đoạn này thực hiện trong 15 phút

* Lưu ý : Để thuận tiện cho việc nhuộm liên tục ta cần đánh số vào tiêu bản

- Chuyển qua lọ xylen (II) ngâm trong 10 phút để làm trong và sạch tiêu bản Rút xylen:

- Ngâm tiêu bản vào cồn tuyệt đối trong 5 phút Nhuộm kép Hematoxylin – Eosin :

- Nhuộm hematoxylin 1 phút , tiêu bản có màu tím đỏ

- Rửa tiêu bản trong nước máy

- Dùng khăn lau bớt hematoxylin bám xung quanh mẫu , tránh chạm mẫu làm bễ mẫu

- Ngâm tiêu bản trong nước cất 1 phút

- Biệt hóa tiêu bản trong cồn 700 - HCl loãng (0,1%) , 5 giây (tùy theo độ mỏng dày của lát cắt mà có thể tăng hoặc giảm thời gian biệt hóa ) Tiêu bản ngã sang màu hồng đỏ

- Rữa tiêu bản trong nước máy chứa 1% Sodium bicarbonate , tiêu bản chuyển

từ màu hồng đỏ sang màu tím xanh và rữa cho đến khi không còn màu trôi ra nữa

§ Nhuộm Eosin :

Vì thuốc nhuộm Eosin (cách pha phần phụ lục ) là thuốc nhuộm tương phản dùng với thuốc nhuộm hematoxylin để làm nổi rỏ thuốc nhuộm chính, từ đó làm cấu trúc mẫu vật rỏ nét hơn

Thuốc nhuộm Eosin được pha trong cồn nên trước khi nhuộm phải ngâm tiêu bản vào loạt cồn có nồng độ tăng dần

Sau khi rữa tiêu bản trong nước máy chứa 1% sodium bicarbonate , ngâm vào nước cất 1 phút

Ngâm tiêu bản vào trong loạt cồn có nồng độ tăng dần : 300 –500 – 700 – 96 0, mỗi lọ 2 phút

Trang 19

Nhuộm Eosin B 10 phút / Eosin Y 5 phút

Rữa tiêu bản trong nước máy đến khi không còn màu trôi ra nữa

Tráng tiêu bản bằng nước cất 1 phút

*Lưu ý :

+ Quá trình nhuộm được thực hiện trong các lọ thủy tinh có chiều cao bằng hoặc hơn chiều dài của tấm lame và có nắp đậy kín Mỗi lọ có ghi nhãn rõ ràng để tránh nhằm lẫn

+ Khi chuyển ta dùng kẹp gắp các tiêu bản từ lọ này đem đặt trên tờ giấy thấm

để hút bớt các chất còn bám trên lame , xong ngâm vào lọ khác Nhằm tránh gây bẩn tới mức tối đa ở các lọ mới Nhưng một điều có tính chất nguyên tắc là không được để tiêu bản khô ngoài không khí

+ Sau khi dùng , đậy kín các lọ này lại để các lần sau có thể sử dụng lại Sau một thời gian khi các chất trong lọ bị bẩn thì phải thay các chất khác

3.6 Khử nước , làm trong và dán mẫu :

3.6.1 Khử nước :

Sau khi nhuộm xong tiêu bản phải qua giai đoạn khử nước để rút kiệt nước trong lát cắt vì phần lớn môi trường dán không thích hợp với nước Đồng thời để giữ tiêu bản cố định lâu dài không bị nổ tiêu bản dán cố định

Để tránh tiêu bản mất nước đột ngột ảnh hưởng đến cấu trúc tế bào , cho tiêu bản vào một lọat cồn có nồng độ tăng dần :300 – 500 – 700 – 960 , mỗi lọ 2 phút Ngâm tiêu bản vào hỗn hợp xylen : phênol (cách pha phần phụ lục ) để rút kiệt nước Dung dịch này hút nước rất mạnh Có thể chuyển trực tiếp từ cồn 960sang dung dịch này , thời gian ngâm 5 phút

* Lưu ý:

Việc khử nước và làm trong là những khâu rất quan trọng trong việc thực hiện những tiêu bản hiển vi cố định Do đó phải lưu ý làm thật kỹ các khâu này nhằm hạn chế gây thất bại về sau

Trang 20

3.6.3 Dán mẫu :

Sau khi đã thực hiện qua đầy đủ tất cả các giai đoạn trên ta tiến hành dán mẫu , nhằm bảo vệ mẫu vật và tiện cho việc quan sát dưới kính hiển vi

Mẫu được dán trong Baume canada Đây là một loại chất nhựa được tiết

ra từ cây nhựa thơm Abies balsamea hoặc Abies fraseri … Baume canada là một chất lỏng sánh , trong , màu hơi vàng Để tiện cho việc dán được dễ dàng ta pha loãng trong xylen ( cách pha phần phụ lục )

Có hai phương pháp dán mẫu :

+ Nhỏ một giọt Baume canada lên tiêu bản có lát cắt , dùng ngón tay cái và ngón trỏ cầm lammelle và đặt xuống lame , hợp với lame một góc 450 , hạ lammelle từ từ xuống đến khi lammelle tiếp xúc với Baume canada thì buông tay ra ấn nhẹ cho Baume canada tràn đều khắp các cạnh của lammelle và tràn ra ngòai khỏang 1mm Phương pháp này rất dễ bị bọt khí

+ Nhỏ một giọt Baume canada lên lame có mẫu vật và một giọt lên lamelle Sau

đó áp hai giọt này lại với nhau Phương pháp này tránh được bọt khí

Để khắc phục cách thứ nhất ta thực hiện các bước sau :

- Nhỏ hai giọt Baume canada lên lame cạnh mẫu vật

- Các thao tác trong khi dán mẫu phải nhẹ nhàng

- Hạn chế tối đa bọt khí trong mẫu

- Sau khi làm trong phải dán tiêu bản ngay tránh để lâu ngoài không khí làm mẫu bị khô

- Sau khi dán sấy tiêu bản một tuần ở nhiệt độ 45 – 500C Khi tiêu bản khô hẳn thì lấy ra , dùng dao cạo bỏ lớp Baume canada dư trên tiêu bản Sau đó , dùng tấm vải tẩm xylen chùi lại cho thật sạch

3.6.4 Bảo quản tiêu bản :

+ Dán nhãn vào tiêu ở góc trái ( ghi rỏ tên mẫu vật , dung dịch nhuộm , )

+ Để tiêu bản trong hộp kín dùng cho việc đựng tiêu bản Hộp đựng tiêu bản bảo quản nơi sạch sẽ , tránh ánh sáng , ẩm ướt , nhiệt độ cao

+ Tiêu bản cố định có thể bảo quản được trong thời gian khá dài nếu thực hiện tốt các thao tác trên

Trang 21

TÓM TẮT QUI TRÌNH THỰC HIỆN TIÊU BẢN LÁT CẮT CỦA GIUN ĐŨA ( Acaris suum ) VÀ GIUN ĐẤT ( Pheretima.sp )

STT GIAI ĐOẠN HÓA CHẤT / DỤNG CỤ NHIỆT ĐỘ/THỜI GIAN

- Dung dịch Carnoy và Lebrun

- Rữa nước máy (đối với dung dịch Bouin)

- Ngâm cồn 700 (đối với dung dịch Carnoy và Lebrun )

- Dung dịch Lugol (đối với mẫu định hình trong dung dịch Carnoy và Lebrun )

- Dung dịch Lenoir (đối với mẫu định hình trong dung dịch Bouin)

- Nước máy

- Cắt mẫu một đoạn ngắn khoảng 2 cm

- Chloroform

- Paraffin : Chloroffom (tỉ lệ 1:1)

- Paraffin I / Tủ sấy

- Paraffin II / Tủ sấy

- Paraffin / Khuôn đúc

- Trữ trong tủ lạnh

- Máy cắt vi mẫu (microtome)

- Albumin : glycerin dán mẫu

- Tải mẫu lên lame

- Sấy lame / Tủ sấy

-3 giờ (Giun đũa heo ) -5 giờ ( Giun đất ) -2 giờ (Giun đũa heo ) -3 giờ (Giun đất ) -Đến khi không còn màu trôi ra

-2 giờ -1 đêm

-24 giờ

-30 phút

-1 phút -2 giờ -2 giờ -2 giờ -2 giờ -4 giờ -1 giờ

-10 giờ -12 giờ / 370C

-24 giờ / 600C -24 giờ / 600C

-24 giờ

-1 giờ / 500C

-1ngày / 500C -24 giờ / 270C

Trang 22

5 Khử nước ,

làm trong và dán mẫu :

- Đến khi không còn màu trôi ra

-1 phút -5 giây -Đến khi không còn màu trôi ra

-1 phút -2 phút -2 phút -2 phút -2 phút -10 phút (EosinB ) ; 5 phút (Eosin Y)

-Đến khi không còn màu trôi ra

-1 phút -2 phút -2 phút -2 phút -2 phút -2 phút -5 phút -10 phút

-50 0C / 1 tuần

Trang 23

NỘI DUNG

1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU:

1.1 Giun đũa heo (Ascaris suum) :

Loài : Ascaris suum

1.1.2 Đặc điểm cấu tạo :

1.1.2.1 Hình dạng ngoài :

Giun đũa heo (Ascaris suum ) có hình trụ dài , hai đầu thuôn nhỏ , phía đầu thuôn nhỏ hơn phía đuôi Con đực thường có kích thước nhỏ và ngắn hơn con cái (con cái có cơ thể dài tới 30 cm ) Con đực có đuôi cong tròn về phía bụng và có mang hai gai giao cấu

Ở phần thước cơ thể có chỏm đầu được phân biệt với đầu còn lại của cơ thể bằng chỗ thắt nhỏ Tận cùng trước của chỏm đầu có lỗ miệng nằm ở giữa ba thùy môi Quan sát lát cắt mặt trước của chỏm đầu thấy rỏ cấu tạo của ba thùy môi : một thùy môi và hai thùy bên - bụng Thùy lưng có kích thước lớn hơn thùy bên – bụngvà phủ

ở phía trên lỗ miệng Hai thùy bên – bụng có kích bằng nhau và phủ ở hai bên và phía bụng Lỗ miệng khi đó nằm ở giữa ba thùy môi và có dạng khe ba nhánh Mặt ngòai của các thùy môi có các núm cảm giác Đó là phần lồi của lớp cuticun , bên trong có tận cùng của đấu dây thần kinh thực hiện chức năng cảm giác Thùy lưng có hai núm kép nằm lệch về phía bụng của mép môi Ngòai núm kép ra , ở mỗi thùy môi còn có hai núm đơn kề nhau , nằm lệch về phía lưng và hơi lùi về phía trong so với mép của thùy môi

Tại vị trí 1/3 cơ thể về phía trước của con cái , các vòng cuticun thắt lại và kết với nhau tạo thành một cấu trúc được gọi là đai sinh dục Đây chính là chỗ tựa cho con đực khi giao phối Ở đó có lỗ sinh dục cái , là một khe rất nhỏ nằm ở mặt lưng Hậu môn cũng là một khe nhỏ nằm ở gần cuối cơ thể Đuôi của cơ thể nằm ở phía sau hậu môn

Trang 24

Qua lớp cuticun trong suốt , có thể thấy nổi rỏ bốn gờ hạ bì chạy dọc suốt

cơ thể : gờ hạ bì lưng và bụng lớn có màu trắng , hai gờ hạ bì bên nhỏ và có màu thẫm hơn

1.1.2.2 Cấu tạo lát cắt ngang :

- Lớp hạ bì : nằm ngay dưới lớp cuticun có cấu trúc hợp bào Chiều dài hạ bì thay đổi trong khoảng 26- 32 μm Trong dãy nguyên sinh chất liên tục có nhân tế bào

và các không bào nằm rải rác theo từng nhóm Tại bốn vị trí gần như cách đều nhau : giữa lưng , giữa bụng và hai bên cơ thể lớp hạ bì dày lên rỏ rệt theo chiều dọc tạo thành bốn gờ hạ bì : gờ lưng , gờ bụng và hai gờ bên Gờ bên có kích thước lớn hơn , bên trong có chứa tiết diện cắt ngang của ống bài tiết Các gờ lưng và gờ bụng khác

gờ lưng ở chỗ phần gốc của chúng teo nhỏ như cái cuống nâng lấy phần ngọn , đưa sâu vào xoang cơ thể Trong gờ lưng và gờ bụng có tiết diện cắt ngang của dây thần kinh lưng và dây thần kinh bụng

-Lớp cơ : là lớp trong cùng của thành cơ thể Do bị các gờ hạ bì phân cách , lớp

cơ phân thành bốn dãy kéo dài suốt chiều dọc cơ thể : hai dãy bên – lưng và hai dãy bên – bụng Hệ cơ cấu tạo theo kiểu đa tế bào Mỗi tế bào bao bọc trong màng riêng

và gồm có sợi co rút của mỗi tế bào xép theo chiều dọc và áp sát vào hạ bì Trên tiêu bản cắt ngang , phần này bắt màu đậm nhất Các túi nguyên sinh chất hướng vào bên trong xoang cơ thể Các chồi nguyên sinh chất liên kết với nhau và hướng về các gờ

hạ bì lưng và bụng Nhân tế bào tương đối lớn , song trên tiêu bản khó nhìn thấy

+ Xoang cơ thể :

- Xoang cơ thể của Giun đũa heo ( A suum ) là xoang nguyên sinh Đó là một xoang kín chạy suốt từ đầu tới phía đuôi con vật tiếp xúc trực tiếp với thành cơ thể ở phía ngoài và với thành ruột ở phía trong không có màng ngăn cách Đặc tính này để phân biệt với xoang thứ sinh ở Giun đất

- Tiết diện cắt ngang ruột của A suum là một vòng các tế bào hình trụ nằm hơi lệch về phía lưng Căn cứ vào đặc điểm này để định hướng mặt lưng và mặt bụng của lát cắt ngang con vật

- Giữa thành cơ thể và ruột là xoang nguyên sinh chứa các phần khác nhau của

hệ sinh dục

Trang 25

~ Ở con cái : các tiết diện cắt ngang có kích thước nhỏ nhất và trông giống như bánh xe có nan hoa đó là tuyến trứng Ống dẫn trứng là những tiết diện có kích lớn hơn , bên trong chứa nhiều trứng có dạng những chấm tròn Hai tử cung có tiết diện lớn nhất nằm cạnh nhau và lệch về phía bụng , chứa đầy trứng đã chín Thành tử cung

có cấu trúc khá rõ

~ Ở con đực : tuyến tinh có cấu trúc cắt ngang giống như tuyến trứng Các phần tiếp theo cũng có cấu tạo tương tự như hệ thống ống dẫn của con cái Ống phóng tinh có kích thước lớn nhất và có thành khá dày , tinh trùng Giun đũa có dạng hình tháp nhỏ không có đuôi

Mặt ngòai cơ thể khá nhẳn nhụi , luôn luôn nhờn ẩm , rất thích ứng với đời sống chui luồn trong đất Chất nhờn là do các tuyến trong lớp biểu bì tiết ra bao phủ mặt ngoài thích nghi với đời sống ở cạn của Giun đất

Dùng tay sờ kỹ hoặc quan sát dưới kính lúp mới nhận thấy ở giữa mỗi đốt

có một vòng tơ , gồm những tơ ngắn và phân bố đều đặn

Ở giữa mặt lưng tại ranh giới giữa các đốt bắt đầu từ đốt thứ XI – XII trở

về sau đều có lỗ lưng xếp thành hàng Có khi giết giun bằng nước nóng qua các lỗ này dịch cơ thể phun mạnh ra ngoài thành tia

Đai sinh dục được hình thành từ 3 đốt : đốt thứ XIV , XV và XV Ở mặt ngoài không còn ranh giới giữa các đốt và ở mỗi đốt không có vòng tơ Đai sinh dục bao quanh cơ thể Ở giữa đốt XV về phía bụng có lỗ sinh dục cái

Lùi về phía sau đai sinh dục một đốt có hai lỗ sinh dục nằm trên hai nhú lồi của đốt XVIII Quanh lỗ sinh dục đực thường có các nhú nhỏ Số nhú thay đổi từ

5 đến 10 ở mỗi bên , nằm ở trước và sau lỗ sinh dục đực Xa về phía trước của đai

Trang 26

sinh dục có lỗ của túi nhận tinh xếp thành hai đôi nằm ở giữa các vách của các đốt VII / VIII và VIII / IX

1.2.2.2 Cấu tạo lát cắt ngang :

Quan sát từ ngòai vào trong lát cắt ngang qua phần thân Giun đất , ta lần lượt nghiên cứu thành cơ thể , xoang cơ thể và ống tiêu hóa

Thành cơ thể : cũng còn giữ kiểu cấu tạo bao biểu mô cơ Ngoài cùng là lớp cuticun mỏng , trong suốt rồi đến lớp biểu bì Bên trong là cơ Cơ gồm có lớp cơ vòng mỏng và lớp cơ dọc rất dày Lớp cơ ở Giun đất cấu tạo đồng đều , không phân hóa thành các dãy cơ dọc như ở một số Giun đốt khác

Trên thành cơ thể có thể thấy được cả những tơ cứng đâm xuyên ngang ra phía ngoài tạo thành các vòng tơ

Giun đất có xoang cơ thể thứ sinh Xoang cơ thể được giới hạn với thành

cơ thể bởi lá thành ( parietal ) và với ruột bởi lá tạng ( visceral ) Trên tiết diện cắt ngang có thể thấy các lá đó là lớp tế bào mỏng Cấu tạo xoang cơ thể chia thành từng phần riêng biệt ở mỗi đốt và ngăn cách với thành cơ thể và thàng ruột bằng các vách xoang Đó là những đặc điểm sai khác cơ bản so với xoang cơ thể nguyên sinh ở Giun tròn

Trong xoang cơ thể thứ sinh , thấy được các tiết diện cắt ngang của mạch máu lưng , mạch máu bụng , chuỗi thần kinh bụng gồm hai hạch thần kinh nằm sát cạnh nhau , mạch máu dưới dây thần kinh và lớp tế bào quanh ruột Trên vách xoang còn có vi thận , nhưng nhỏ và khó nhìn thấy

Vách xoang còn tạo thành màng treo ruột lưng và màng treo ruột bụng , nhưng trên tiêu bản lát cắt ngang màng này thường khó nhìn thấy rỏ

Tiết diện cắt ngang của ruột gần như tròn , nằm chính giữa lát cắt Mặt lưng ruột có vết lõm của rãnh ruột Mạch máu lưng nằm ngay trên rãnh này Ruột được cấu tạo bởi một lớp tế bào biểu mô ruột và có một lớp cơ vòng mỏng bao bọc

bên ngoài (Thanh ; 1980 , Học ; 2001 )

Trang 27

2 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN :

2 Kết quả :

Sau một thời gian dài thực hiện đề tài tiêu bản lát cắt ở hai ngành:

- Giun tròn với đại diện là Giun đũa heo ( A suum )

- Giun đốt với đại diện là Giun đất (Pheretima sp )

Kết quả đạt được khoảng 100 tiêu bản Trong đó : + 40 tiêu bản Giun đũa cái

+ 10 tiêu bản Giun đũa đực

+ 50 tiêu bản Giun đất Qua các tiêu bản này sẽ giúp cho chúng ta quan sát được một số cấu trúc của cơ thể ở hai loài này

2.1.1 Đối với Giun đũa heo (A suum ) :

+ Thành cơ thể : có thể thấy rõ được ba lớp :

- Lớp cuticun : ngoài cùng , trong suốt

- Lớp hạ bì : nằm ngay dưới lớp cuticun , gồm nhiều tế bào không vách ngăn nằm cạnh nhau

- Lớp cơ : nằm trong lớp hạ bì có màu hồng đỏ Lớp này được chia thành bốn dãy rất rỏ rệt : hai dãi bên – lưng và hai dãy bên - bụng

Trên thành cơ thể ta phân biệt được các gờ : gờ lưng , gờ bụng và hai gờ bên

- Gờ bên : chứa tiết diện cắt ngang của ống bài tiết

- Gờ lưng : chứa tiết diện cắt ngang của dây thần kinh lưng

- Gờ bụng : chứa tiết diện cắt ngang của dây thần kinh bụng

+ Xoang cơ thể : xoang nguyên sinh chứa nội quan và dịch thể xoang

~ Giun đũa cái : ta quan sát được một số tiết diện cắt ngang :

- Ruột : là một vòng các tế bào hình trụ nằm lệch về phía lưng và bắt màu hồng Tiết diện này khá lớn nhưng bị ép bởi các tiết diện của hệ sinh dục

- Tuyến trứng : kích thước nhỏ , tương đối tròn ( có thể thấy dạng bầu dục dài – nguyên nhân do lát cắt bị xéo ) trông giống như bánh xe có nan hoa , quan sát được rất rõ

- Ống dẫn trứng : kích thước lớn hơn tuyến trứng , chứa nhiều trứng có dạng những chấm tròn , lòng ống rỗng

- Tử cung : hai tử cung có tiết diện lớn nhất , nằm cạnh nhau , lệch về phía bụng , trong chứa đầy trứng đã chín Quan sát được cấu trúc tế bào của thành tử

Trang 28

cung khá rõ và bắt màu tím đỏ Bên trong trứng thấy dược vùng nhân bắt màu đậm hơn tế bào chất

~ Giun đũa đực : quan sát được :

Ruột : tương tự như ở con cái nhưng kích thước nhỏ hơn

Tuyến tinh :kích thước nhỏ nhất

Ống dẫn tinh : kích thước lớn hơn tuyến tinh

Ống phóng tinh : kích thước lớn nhất

2.1.2 Đối với Giun đất (Pheretima sp):

+ Thành cơ thể : phân biệt 3 lớp

Lớp cuticun : ngoài cùng , mỏng , trong suốt

Lớp biểu bì : nằm trong lớp cuticun , có màu hồng

Lớp cơ : phân biệt được hai lớp : cơ vòng và cơ dọc

Trên thành cơ thể còn quan sát được các tơ đâm ra phía ngoài

+ Xoang cơ thể : là xoang thứ sinh do ba lá phôi tạo thành Quan sát được tiết diện cắt ngang của một số cơ quan :

Tiết diện ruột tương đối tròn , lớn , nằm giữa mẫu và có một chỗ lõm vào là rãnh ruột lưng Trên rãnh ruột lưng có mạch máu lưng Đối diện mạch máu lưmg thấy được tiết diện cắt ngang của mạch máu bụng Tại vị trí mạch máu bụng có thể thấy được thêm hai thành phần , ở giữa là hạch thần kinh bụng và ngoài là mạch máu dưới dây thần kinh Các tiết diện này có màu hồng đỏ

Tiết diện ruột có thể quan sát được từng tế bào biểu mô ruột , một lớp cơ vòng bọc quanh ruột và lớp tế bào vàng

Ngoài ra , còn thấy được những ống bài tiết nằm rải rác trong xoang cơ thể 2.2 Thảo luận :

Trãi qua nhiều giai đoạn trong qui trình thực hiện tiêu bản hiển vi cố định tôi dã ghi nhận được một số nhận xét sau :

2.2.1 Chuẩn bị phương tiện trước khi thực hiện :

Bất kỳ một giai đoạn nào , trước khi thực hiện ta phải chuẩn bị sẵn những dụng cụ và hoá chất cần thiết Vì trong qui trình thực hiện đề tài này mang tính chất là phụ thuộc vào thời gian khá nhiều Do đó việc chuẩn bị sẵn sàng sẽ khắc phục bớt những trở ngại trong quá trình thực hiện

Trang 29

Chuẩn bị dung dịch sinh lý với nồng độ thích hợp

+ Giun đất :

Chọn những con giun đất tương đối mạnh để tiện cho việc thải phân Khi

sử dụng giấy vệ sinh làm giấy lót cho giun đất thải phân , không để quá khô hay quá ướt làm ảnh hưởng đến sự hô hấp của giun dẫn đến việc là giun đất sẽ mau chết và việc thải phân không đạt hiệu quả cao sẽ làm cho mẫu bị bẫn và khó cắt

2.2.2.2 Định hình :

Trong giai đoạn này tôi đã thử nghiệm qua hai loại dung dịch định hình là Bouin , Carnoy và Lebrun Đây là hai dung dịch định hình thích hợp cho cả hai đối tượng này Tuy nhiên qua thời gian thử nghiệm tôi nhận thấy rằng mỗi dung dịch định hình đều có ưu và khuyết điểm riêng

+ Dung dịch Bouin : mẫu vật định hình không quá cứng nên thuận tiện cho việc cắt mẫu được dễ dàng Tuy nhiên dung dịch này làm co mẫu mặc dù mẫu được bom

cả dung dịch định hình vào trong xoang cơ thể

+ Dung dịch Carnoy và Lebrun : mẫu vật được bảo tồn rất tốt về hình dạng và các tổ chức của tế bào Khuyết điểm của dung dịch này là mẫu vật bị quá cứng , đặc biệt là sau khi ngâm bằng dung dịch Lugol và khử nước bằng cồn

Sau khi thử nghiệm hai loại dung dịch định hình trên tôi đã chọn ra dung dịch định hình hợp lý nhất đó là định hình trong dung dịch Bouin , vì tôi nhận thấy rằng mẫu định hình trong dung dịch này dễ cắt hơn , giữ được cấu trúc mẫu , tuy tiết diện có hơi bị méo mó

Sau khi định hình phải rữa thật kỹ để màu vàng của axit picric không làm loãng bớt đi nồng độ cồn khi khử nước

2.2.2.3 Đúc mẫu:

Để đúc mẫu được tốt thì việc khử nước trong mẫu vật phải được thực hiện thật kỹ Trong giai đoạn khử nước này tôi đã sử dụng cả hai loại : cồn 1000 và n – Butanol Kết quả nhận thấy là cả hai đều khử nước tốt và không ảnh hưởng gì rỏ rệt đến các quá trình sau

Đúc mẫu được thử nghiệm qua nhiều lần :

+ Paraffin 100% : mẫu bị cứng , khó cắt , dễ vỡ

+ Paraffin 95% : sáp ong 5% : mẫu còn hơi cứng

+ Paraffin 90% : sáp ong 10% :mẫu có thể cắt được

+ Paraffin 85% : sáp ong 15% : mẫu vừa hơi mềm , dễ cắt thành lát

+ Paraflast 80% : paraffin 20% mẫu hơi bị cứng

+ Paraflast 100% : mẫu có thể cắt được

+ Paraflast 95% : sáp ong 5% : mẫu vừa dễ cắt thành lát

Để thuận tiện cho việc pha trộn và lọc paraffin , paraflast ta cần phải tăng nhiệt độ tủ sấy lên quá ngưỡng nóng chảy để thực hiện được nhanh và dễ dàng ( khi không có mẫu )

Trang 30

Để paraffin ( paraflast ) ngấm vào mẫu được dễ dàng ta nâng nhiệt độ tủ sấy từ 600C đến tối đa là 630C để paraffin ( paraflast ) luôn luôn ở trạng thái lỏng

* Một số biến cố xảy ra trong quá trình đúc mẫu Nguyên nhân và biện

- Tốc độ đông của paraffin ở xung quanh khuôn đúc nhanh hơn ở giữa

- Paraffin còn quá lỏng

- Thay paraffin mới , lọc paraffin nhiều lần trước khi dùng , sau đó đúc lại

- Thường xuyên lắc paraffin đã pha trộn

- Đổ paraffin đầy khuôn / Để mẫu không quá cao / Có thể đổ thêm paraffin sau khi vừa để mẫu vào khuôn

- Chờ cho paraffin hơi đông khỏang 1/3 khuôn phía dưới rồi cho mẫu vào

2.2.2.4 Cắt mẫu :

Cắt mẫu là giai đoạn có vai trò quyết định đến cấu trúc vi mẫu và kết quả thực hiện Các giai đoạn định hình , đúc mẫu đều có ảnh hưởng rất nhiều đến giai đoạn này

Cắt mẫu chịu ảnh hưởng rất nhiều đến nhiệt độ bên ngoài Thông thường việc cắt mẫu được thực hiện vào lúc sáng sớm , chiều tối hoặc sau cơn mưa Đó chính

là những lúc nhiệt độ bên ngoài tương đối thấp thuận tiện cho việc cắt mẫu ở phòng không có máy lạnh

Lưỡi lam phải luôn được thay đổi vị trí và thay đổi mới để tránh mẫu bị cào xước và nát

Để đạt được tiêu bản tốt quan sát được thì việc cắt mẫu được thực hiện rất công phu Cắt mẫu phải không quá dày , không quá mỏng Mẫu dày sau khicố định sẽ khó phân biệt được cácloại tế bào trên kính hiển vi Mẫu quá mỏng thì tiết diện dễ vỡ không quan sát được Do đó tôi nhận thấy rằng việc cắt mẫu ở độ dày 8 μm là tương đối hợp lý nhất tuy mẫu vẫn còn hơi bị vỡ ở thành cơ thể Lát cắt bị vỡ , đây là một giai đoạn rất khó khắc phục trong việc làm tiêu bản ở hai đối tượng này Nguyên nhân chủ yếu là do cắt mẫu trên tiết diện khá lớn ( dễ quan sát được cấu từng thành phần )

và do trên một lát cắt có nhiều tổ chức tế bào thì ít nhiều cũng khó giữ nguyên vẹn được tổng thể

Trang 31

Tải mẫu lên lame : nên nhỏ lên lame giọt nước ấm khoảng 500C để làm căng mẫu thẳng ra , nếu dùng nước lạnh quá mẫu sẽ bị nhăn , còn nóng quá thì dễ làm teo mẫu

* Những biến cố xảy ra trong quá trình cắt mẫu Nguyên nhân và biện pháp khắc phục :

Biến cố Nguyên nhân Khắc phục

- Paraffin nguội khi đúc

- Chưa rút hết nước trong mẫu vật

- Lưỡi lame bị mẻ hay trng mẫu có chỗ quá cứng hoặc

có những hạt bụi , hạt cát

- Thời gian tẩm paraffin chưa đủ nên paraffin chưa ngấm hết vào trong mẫu

- Cắt quá mỏng / nhiệt độ quá cao / độ nghiêng của dao lớn

- Paraffin quá cứng

- Paraffin mềm quá và nhiệt độ phòng quá cao

- Cắt quá mỏng / độ nghiêng của dao lớn

- Kiểm tra lại máy cắt , đặc biệt

là bộ phận điều chỉnh độ dày , vặn chặt óc

- Tăng độ nghiêng của lưỡi dao

- Dùng dao sửa lại

- Đúc lại

- Khử nước lại từ cồn 960

- Thay lưỡi lame mới hay chuyển sang cắt ở vị trí khác của lưỡi lam

- Tẩm lại paraffin để trong tủ sấy ở 600C thêm một thời gian nữa

- Cắt dày hơn / tăng lượng nước đá ở xung quang chỗ cắt / giảm độ nghiêng của dao

- Cắt mỏng hơn / tẩm lại trong paraffin mềm hơn

- Đúc lại trong paraffin cứng hơn và cắt gần nguồn lạnh (tăng lượng nước đá )

- Cắt dày hơn , vặn chặt các óc kiểm tra / giảm độ nghiêng của dao

Trang 32

- Khó cắt hay không

cắt được , mẫu bễ ra

- Mẫu quá cứng , giòn khi định hình hay khi tẩm ở nhiệt độ quá cao

- Khó khắc phục ( rút kinh nghiệm cho lần sau , không,tẩm ở nhiệt độ cao

2.2.2.5 Nhuộm mẫu :

Quá trình nhuộm mẫu được thực hiện qua nhiều giai đoạn Ở những thời điểm khác nhau kết quả đạt được cũng khác nhau :

+ Dung dịch nhuộm hematoxylin :

Hematoxylin pha trong 2 tháng nhuộm : tiêu bản chỉ bắt màu tím rất nhạt , sau giai đoạn khử nước thì màu càng nhạt hơn

Hematoxylin pha trong 3 tháng , 4 tháng : nhuộm chỉ hơi bắt màu nhưng cũng chưa thực sự bắt màu của thuốc nhuộm

Hematoxylin pha sau 5 tháng :nhuộm đã thực sự bắt màu tím đỏ Thời gian nhuộm là 5 phút

Hematoxylin pha sau 6 tháng : nhuộm tiêu bản bắt màu rất đậm Thời gian nhuộm khoảng 1 phút

Hematoxylin pha sau 7 tháng : khi nhuộm phải pha loãng với tỉ lệ 1:1

Nhuộm trong 1 phút

Hematoxylin pha sau 8 tháng : khi nhuộm phải pha loãng với tỉ lệ 1:1

Nhuộm trong 30 giây

Hematixylin pha sau 9 tháng : khi nhuộm phải pha loãng với tỉ lệ 1 hematoxylin : 2 nước cất Nhuộm trong 1 phút

Qua thời gian thực hiện tôi nhận thấy rằng Hematoxylin được pha sau 5 tháng thì trở thành dung dịch nhuộm đã chín thực sự Hematoxylin sau khi chín càng lâuthì độ bắt màu càng đậm

+ Dung dịch nhuộm Eosin:

Eosin B pha sử dụng ngay thì khả năng bắt màu rất kém , đồng thời dễ bị phai dần sau thời gian khử nước tiêu bản chỉ còn màu của hematoxylin

Eosin B pha sau 2 tháng sử dụng đã bắt màu tương đối nhưng chưa thể hiện được sự tương phản với màu của hematoxylin

Eosin B pha sau 3 tháng sự dụng đã thực sự bắt màu tương phản với hematoxylin

Để thử nghiệm xem Eosin B và Eosin Y thì khả năng bắt màu và kết quả tiêu bản có gì khác nhau , tôi đã tiến hành nhuộm song song Eosin B va Eosin Y

Thời gian nhuộm Eosin B là : 10 phút

Thời gian nhuộm Eosin Y là : 5 phút

Định dạng
Số trang	65
Dung lượng	1,5 MB