Công nghệ sinh học đông lạnh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM-ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐÔNG LẠNH Đà nẵng, tháng 11 năm 2017 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM-ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐÔNG LẠNH Giáo viên hướng dẫn: Nguyễn Thị Mộng Điệp Nhóm thực hiện: Phạm Thị Hằng Hồ Thị Thu Hiền Nguyễn Thị Thanh Hiền Nguyễn Thị Hiệp Đinh Công Duy Hiệu Đà nẵng, tháng 11 năm 2017 MỤC LỤC KHÁI NIỆM Sinh học đông lạnh ngành khoa học ứng dụng kỹ thuật trữ tế bào sống nhiệt độ thấp thời gian dài Ở nhiệt độ nitơ lỏng (-196), hầu hết phản ứng hóa học khơng xảy ra, tất hoạt động bên tế bào ngừng lại Các phân tử nước lúc tồn dạng kết hợp, tinh thể dạng kính Thời gian không mang đến tổn hại cho tế bào trữ Theo cách này, tế bào mơ hồi phục tới lúc người cần sử dụng MỤC ĐÍCH - Giảm thiểu biến đổi kiểu gen, biểu gen, đảm bảo ổn định di truyền - Ngăn ngừa lão hóa tế bào - Ngăn cản q trình biệt hóa tế bào - Giảm rủi ro nhiễm vi khuẩn chết tế bào - Giảm nhiễm chéo dòng tế bào khác invitro - Giảm rủi ro biến đổi cấu trúc thay đổi hình thái - Giảm chi phí ni cấy - Thuận lợi cho việc phân loại, tạo dòng - Thuận lợi cho việc bảo tồn gen - Thuận lợi cho việc vận chuyển - Thuận lợi cho việc thương mại hóa - Giảm thiểu thao tác, nuôi cấy không cần thiết nhiều dòng tế bào lúc, nơi, tiết kiệm thời gian, công sức CÁC BƯỚC BẢO QUẢN TẾ BÀO BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG LẠNH - Quá trình thu nhận thao tác tế bào - Quá trình làm lạnh - Quá trình trữ lạnh - Quá trình giải đơng - Pha lỗng loại bỏ chất bảo quản lạnh trước nuôi cấy CÁC BIẾN ĐỔI TRONG Q TRÌNH ĐƠNG LẠNH 4.1 Sự hình thành tinh thể nước đá Khi nhiệt độ hạ thấp, xuất tinh thể nước đá dấu hiệu bắt đầu biến đổi giai đoạn Điều xảy nhiệt độ bên tế bào với độ hạ băng điểm dung dịch mà băng điểm dung dịch lại phụ thuộc vào nồng độ chất hòa tan Tuy nhiên, nồng độ bên tế bào đậm đặc bên tế bào nên biến đổi giai đoạn bên tế bào xảy nhiệt độ thấp bên tế bào Trong q trình đơng lạnh, tinh thể nước đá tạo thành trước tiên môi trường ngồi tế bào, nồng độ chất hòa tan tăng áp suất thẩm thấu tăng làm cho nước chuyển động ngồi tế bào dung tích tế bào giảm Tốc độ nước tế bào lại phụ thuộc vào tốc độ đông lạnh Ở tốc độ giới hạn (tốc độ thích hợp tối ưu) khả tạo băng đá nội bào tăng; tinh thể nước đá tăng kích thước đó, tổn hại tế bào nhiều Ngược lại, tốc độ giới hạn, sống tế bào giảm nồng độ chất hòa tan nội bào tăng lên Người ta nhận thấy môi trường huyền phù, nước biến đổi chậm nước nội bào trì cho có cân thẩm thấu với mơi trường bên ngồi, gây tổn hại tế bào Sự có mặt băng đá nội bào “hiệu ứng dung dịch” hai yếu tố chủ yếu chuyển biến theo tốc độ đông lạnh, định khả sống tế bào Sự hoạt động phối hợp yếu tố sau định hình dạng tinh thể nước đá tạo thành q trình đơng lạnh: • • • • Nhiệt độ thời điểm biến đổi giai đoạn Tốc độ làm lạnh Thành phần chất hòa tan dung dịch Nồng độ dung dịch Hình 1: Sự hình thành tinh thể đá Ở mơi trường đẳng trương (áp suất thẩm thấu khoảng 300mOsm/kg), tinh thể đá thường hình thành nhiệt độ -5 đến -15 0C Tuy nhiên, đá tạo thành tự nhiên nhiệt độ -100C Ở nhiệt độ -5 đến -100 C cần có điều kiện kết hợp Đó tham gia phần nhỏ chất rắn (ví dụ hạt bụi tinh thể đá nhân tạo) Sự tạo đá tăng nhiệt độ giảm Ở nhiệt độ khoảng -130 0C, tất chất liệu không dạng lỏng mà dạng hạt kết tinh hay dạng thủy tinh.Đây tượng kết tinh hóa hay gọi thủy tinh hóa Hiện tượng xảy mơi trường có pha chất hòa tan chất bảo quản đơng lạnh có nhiệt độ đơng đá thấp bình thường Những tinh thể nước hình thành bên sát bên ngồi tế bào có khả gây tổn thương học lên màng tế bào bào quan Hình 2: Sự biến đổi vật lý tế bào đông lạnh Sự tăng thêm nồng độ chất hòa tan mơi trường đơng lạnh ảnh hưởng đến việc hình thành tinh thể đá Khi nước chuyển sang dạng tinh thể, lượng nước thể lỏng giảm Do đó, nồng độ chất hòa tan tăng lên gây cân áp suất thẩm thấu, kéo nước bên tế bào làm tổn thương màng tế bào Việc tăng nhiệt độ tiềm hậu hình thành tinh thể nước đá Phân tử nước chuyển từ thẻ lỏng sang thể rắn thoát nhiệt lượng Nếu nhiều phân tử chuyển sang thể rắn lượng nhiệt đủ lớn để làm thay đổi nhiệt độ môi trường từ vài độ âm lên lại 0⁰C Thay đổi ảnh hưởng đến chức tế bào sau giải đông 4.2 Độ thẩm thấu môi trường đông lạnh Nhiệt độ xác để kết tinh thủy tinh hóa hồn tồn phụ thuộc vào phức hợp có nước Trong dung dịch NaCl có áp suất, tượng thủy tinh hóa xảy nhiệt độ -20⁰C đến -30⁰C Nhiệt độ gọi điểm Eutecti Vì vậy, trước đạt đến điểm NaCl dạng dung dịch Số lượng phân tử nước có dạng dung dịch giảm xuống với nhiệt độ, kết trực tiếp giảm độ thẩm thấu môi trường, mơi trường trở nên ưu trương Hình 3: Khi nhiệt độ dung dịch NaCl đẳng trương hạ thấp liên tục đến điểm đông tượng kết tinh đá nồng độ NaCl tăng lên Làm lạnh nhiệt độ xấp xỉ 00C làm giảm khuếch tán chiều protein màng Ở nhiệt độ thấp hơn, màng tế bào hướng nồng độ muối cao, q trình đơng lạnh chậm Màng tế bào bị sốc thẩm thấu với co thể tích q trình nước Sau đó, màng tế bào giãn ra, nồng độ ion tăng lên, vậy, tế bào trở nên nhạy cảm với stress q trình đơng lạnh nhiệt độ giảm pha lỗng mơi trường q trình giải đơng 4.3 Tốc độ khử nước Tốc độ nước tế bào phụ thuộc vào nhiều yếu tố Các yếu tố thay đổi khác tùy theo loài tế bào đóng vai trò định việc xác định q trình bảo quản đơng lạnh điều kiện tốt Các yếu tố liên quan tính thẩm thấu nước màng tế bào (Lp), lượng hoạt hóa tính thấm nước (dH*) tỉ lệ diện tích bề mặt/ thể tích tế bào (SA/V) Bằng cách đo tỷ lệ thay đổi diện tích bề mặt tế bào thể tích tế bào độ thẩm thấu khác nhau, xác định tính thấm màng tế bào (Lp) Diện tích bề mặt lớn, tỉ lệ SA/V cao tính thấm màng tế bào (Lp) lớn Đối với hầu hết tế bào động vật có vú, tính thấm màng tế bào (Lp) có giá trị khoảng 0.43 m3/m2.phút.atmosphere Tuy nhiên hồng cầu tinh trùng tính thấm màng tế bào (Lp) lớn nhiều Điều có nghĩa hồng cầu tinh trùng nước nhanh dung dịch ưu trương; đó, tốc độ bảo quản đông lạnh tốt loại tế bào quan trọng Yếu tố quan trọng thứ hai trình khử nước lượng hoạt hóa cho tính thấm nước (dH*) Năng lượng (ở dạng nhiệt) làm cho tế bào có khả thấm nước Trước đây, cách đo tính thấu màng tế bào (Lp) nhiệt độ khác để xác định dH* trứng Về thực hành, khoảng nhiệt độ điểm đông lạnh Kết đo 14.5 Kcal/mol Giá trị tương đối cao nói chung, nhiệt độ hạ 10% tốc độ khử nước giảm nửa Cuối cùng, tỉ lệ diện tích bề mặt thể tích góp phần quan trọng tốc độ khử nước tế bào Nếu tỉ lệ cao tế bào khử nước nhanh Hình 4: Tốc độ nước tế bào môi trường ưu trương phụ thuộc vào nhiệt độ 4.4 Thể tích tế bào Sự thay đổi thể tích tế bào đo để biểu thị q trình khử nước Q trình khử nước phụ thuộc vào tính thấm nước màng tế bào (Lp) lượng hoạt hóa tính thấm nước (dH*) tế bào Các giá trị phụ thuộc vào tốc độ làm lạnh Dựa sở tính tốn, phạm vi thể tích giảm xác định tốc độ làm lạnh khác Ở tốc độ làm lạnh cao, tế bào khơng bị nước nhiều, thể tích tế bào không bị giảm nhiều tốc độ làm lạnh thấp Tốc độ làm lạnh thấp làm cho tế bào nước Tuy nhiên, thể tích giảm thực so với tính tốn, điều sai lầm phép ngoại suy lượng hoạt hóa tính thấm nước (dH*) (được xác định nhiệt độ điểm đông lạnh) 4.5 Hoạt động Enzyme Nghiên cứu cho thấy nhiệt độ giảm từ 37 0C xuống 70C, hoạt động Enzyme giảm lần Tốc độ phản ứng Enzyme phụ thuộc vào lượng hoạt hóa phân tử phẩn ứng Từ 200C, tốc độ phản ứng Enzyme giảm theo nhiệt độ cách ổn định theo trình tự 2-3 lần với khoảng giảm 10 0C (Q10) Tuy nhiên, số trường hợp, hạ nhiệt độ thay đổi tốc độ phản ứng Enzyme (ở nhiệt độ tương ứng) khơng rõ rệt, dẫn đến biến đổi cấu trúc hoạt động protein Các chất bảo quản đông lạnh đề phòng biến đổi 4.6 Sự tủa muối pH dung dịch Trong trình đông lạnh, độ pH dung dịch tăng theo giảm nhiệt độ, cân acid-base môi trường biển đổi sau: lực ion tăng lên, kết tủa hợp chất protein hòa tan môi trường trở nên dễ dàng (salting out) Các chất bảo quản đơng lạnh biến đổi cân acid-base dung dịch, chẳng hạn glycerol glycol hoạt động base yếu, ester hoạt động base mạnh (DMSO chẳng hạn) Sự biến đổi độ pH dung dịch theo nhiệt độ khác theo loại chất bảo quản sử dụng: với nồng độ DMSO hay glycerol tăng thêm 50%, độ pH dung dịch PBS tăng nhanh, lại ổn định với propanediol hay methanol; với nồng độ giảm (10-20%) độ pH dung dịch PBS glycerol ổn định, đó, pH dung dịch đệm Tris có thay đổi bật Tuy nhiên, pH thích hợp để trì hoạt động sinh lí tế bào phụ thuộc vào nhiệt độ Người ta nhận thấy tế bào sống sau bảo quản nhiệt độ xấp xỉ 0⁰C với pH 4.7 Sự hình thành bọt khí Tế bào chết theo nhiều cách khác hình thành đá Hơn nữa, tinh thể nước đá tạo lỗ gây rò rỉ thể tích nước bị đơng lạnh tăng lên (tỉ trọng đá thấp tỉ trọng nước) Do đó, bọt khí hình thành giải đông tế bào Năm 1988, Ashwood-Smith mô tả hình thành bọt khí tác động hình thành đá Kích thước bọt khí thay đổi từ 25 đến 100µm tỉ lệ nghịch với tốc độ làm lạnh Số lượng bọt khí tương ứng với tốc độ làm lạnh Bên cạnh khí hòa tan theo nồng độ, môi trường nuôi cấy tế bào thường dung CO2 làm hệ đệm để cân độ pH mơi trường Khi làm lạnh, khí khơng dạng hòa tan mà tách thành bọt khí có khả gây hại tế bào Trong q trình giải đơng, vài phút, bọt khí phát triển thành không bào lớn bên tế bào, làm tế bào phình to Trong thực tế, bọt khí hình thành nhanh, dẫn đến vỡ tế bào Sự hình thành khí xảy nhiều sử dụng mơi trường đơng lạnh có chứa bicarbonate Vì vậy, PBS thường sử dụng Thuyết hai yếu tố Căn vào quan sát thực nghiệm mối quan hệ sống sót tế bào với nhiệt độ làm lạnh chúng, Mazur đưa giả thuyết hai yếu tố tổn thương đông lạnh tế bào Hai yếu tố đặt nên tảng sở cho hai chế khác nhau, chúng nguyên nhân trực tiếp, gây tổn hại cho tế bào, suốt trình tiến hành đông lạnh lưu giữ BẢNG 1: Khả phản ứng tế bào gặp phải tác nhân gây stress tiến trình đơng lạnh Hiện tượng Phản ứng tế bào - Biến đổi lipid màng - Giải trùng hợp xương tế bào - Co thẩm thấu - Tác động trực tiếp lên màng tế bào, làm hòa tan protein màng - Mất ổn định lớp photpholipid kép - Làm thay đổi pH dung dịch, ảnh hưởng đến hoạt động protein - Tổn thương học màng Giảm nhiệt độ Tăng nồng độ chất hòa tan Tăng nồng độ ion Khử nước Kết tủa muối Sự hình thành bọt khí 10 Mặc dù, từ chứng thực nghiệm thấy rằng, thuyết hai yếu tố nói lời giải thích hiển nhiên, hợp lí tổn thương tế bào suốt trình làm lạnh, phương pháp bảo quản đơng lạnh tốt khác tuỳ vào loại tế bào Bổ sung thêm cho hai chế tổn thương này, có chế khác đáng quan tâm, chẳng hạn làm lạnh gây nên tổn thương hệ miễn dịch kích hoạt tế bào chết theo chương trình (apoptosis), vấn đề nêu nguyên nhân gây tổn thương tế bào Tế bào tiếp xúc trực tiếp với tinh thể nước đá, chúng tập hợp vào nơi khơng có đóng băng, đồng thời vị trí này, tế bào lập tác nhân vật lý, điều tạo nên stress cho tế bào Đó phản ứng tự nhiên tế bào tác nhân để chúng sống sót tồn Tế bào phải chịu tác động tác nhân nói ln ln thay đổi suốt q trình đông lạnh Tuy nhiên, phản ứng thẩm thấu qua màng sinh chất yếu tố có tính định cho tồn tế bào Trong môi trường ưu trương, tế bào gặp phải tính thấm với nước, giới hạn tổn thương phụ thuộc vào nhiệt độ đông lạnh Sức chịu đựng tế bào đông lạnh thang nhiệt độ chậm phụ thuộc vào khả tế bào, nhằm chống lại thâm nhập tác nhân stress Sức chống chịu tế bào trước áp lực tăng khuếch tán nước, nhiệt độ làm lạnh tăng thành phần tế bào chậm đơng hơn, trước tất phần nước đóng băng bị loại thải Dưới điều kiện này, tế bào co lại tổn thương màng giảm đến mức tối thiểu Những tượng xảy tốc độ làm lạnh cho tốt PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG LẠNH 6.1 Đơng lạnh chậm chương trình (Programmed slow freezing method)  Đặc điểm: - Sử dụng chất bảo quản với nồng độ thấp (1-2M) 12 - Tốc độ làm lạnh chậm (0,1 – 5oC/phút giai đoạn giảm nhiệt xuống -80C) - Hạ nhiệt tự động - Sự khử nước diễn suốt trình làm lạnh - Cân tốc độ nước rời khỏi tế bào nước chuyển sang dạng đá - Chi phí cao (máy tự động), tổn thương tế bào tác động nồng độ chất tan  Ưu, nhược điểm phương pháp: - Nhược điểm: Tỷ lệ phôi sống không cao, nhiều thời gian, cần sử dụng máy trữ lạnh, sử dụng nhiều nitơ, chương trình khơng ổn định Trong hạ nhiệt độ chậm, trình nước cần diễn từ từ để hạn chế thành lập tinh thể nước đá Do đó, thời gian cần thiết để hồn tất quy trình đơng lạnh phương pháp hạ nhiệt độ chậm kéo dài gấp 10 lần so với hạ nhiệt độ cực nhanh Để đảm bảo tốc độ hạ nhiệt phương pháp đông lạnh chậm, người ta cần trang bị hệ thống hạ nhiệt độ nitơ lỏng Chi phí đầu tư cho hệ thống cao, chưa kể đến chi phí bảo trì sửa chữa năm Khó khăn phải có phơi giai đoạn muộn, hay nói cách khác phải ni cấy phôi đến giai đoạn phôi nang (blastocyst) - Ưu điểm: Do sử dụng chất bảo quản nồng độ thấp nên gây tổn thương cấu trúc tế bào 6.2 Đông lạnh nhanh ba bước (Stepwise freezing method)  Đặc điểm: - Nồng độ chất bảo quản thấp - Tốc độ làm lạnh nhanh - Hạ nhiệt: ba bước (Đặt cryotube tủ mát oC 30 phút chuyển sang tủ lạnh -200C 45 phút, sau chuyển sang tủ lạnh -80 oC bảo quản qua đêm) 13 - Khử nước khơng hồn tồn, hình thành đá nội bào - Cải tiến - Đơng lạnh in situ (đơng lạnh bình ni) Ưu, nhược điểm phương pháp: - Nhược điểm: + Khử nước khơng hồn tồn, hình thành đá nội bào  ảnh hưởng cấu trúc tế  bào + Tốn nhiều thời gian cho q trình đơng lạnh - Ưu điểm: + Tỉ lệ tế bào sống cao + Cải tiến thêm phương pháp đông lạnh in situ mang nhiều ưu điểm như: Không sử dụng cryotube-lọ lưu trữ sinh phẩm, giảm thao tác thu nhận tế bào nên giảm nguy nhiễm, tiến hành nhanh, chi phí thấp 6.3 Đơng lạnh cực nhanh (Thuỷ tinh hố) Khái niệm Thủy tinh hóa q trình làm lạnh mẫu trứng phơi với thời gian  nhanh.Trong suốt q trình hạ nhiệt độ toàn khối vật chất bên bên tế bào chuyển thành dạng khối đặc, suốt giống thủy tinh (glasslike), đặc biệt hình thành tinh thể đá bên mẫu tế bào, mơi trường bên ngồi q trình đơng lạnh Sau cân với mơi trường có nồng độ chất bảo quản đơng lạnh cao (4 -8M), mẫu trứng phôi cho vào dụng cụ chứa nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng, khơng qua q trình hạ nhiệt độ theo bước đông lạnh chậm Tốc độ làm lạnh phương pháp lớn, khoảng 2000 - 25000 C /phút  Đặc điểm: - Nồng độ chất bảo quản cao (>5M) - Tốc độ làm lạnh cực nhanh (2000 – 2500oC/ phút) - Tế bào bị khử nước với nhờ tiếp xúc với nồng độ chất bảo quản cao, nước dạng băng vơ định hình - Có thể ảnh hưởng đến tế bào nồng độ chất bảo quản - Quy trình thực dễ dàng, nhanh chóng, chi phí thấp  Ưu, nhược điểm phương pháp: 14 - Ưu điểm: + Ưu điểm vượt trội thời gian trữ lạnh nhanh, tỷ lệ phôi sống nguyên vẹn đạt đến 99% Tỷ lệ thụ thai từ kỹ thuật đạt tỷ lệ 50%, gấp đơi phương pháp cũ Do đó, đơng lạnh phơi cực nhanh với kỹ thuật thủy tinh hóa khắc phục nhiều nhược điểm phương pháp cũ, đồng thời giảm thiểu chi phí điều trị, giảm nguy biến chứng, gia tăng tỷ lệ thành công cho người muộn + Chi phí đầu tư cho trang thiết bị khơng cần nhiều + Nồng độ chất bảo vệ đông lạnh sử dụng phương pháp thủy tinh hóa cao gấp 4-5 lần so với nồng độ chất bảo vệ đông lạnh sử dụng phương pháp đông lạnh chậm trước Ưu giúp cho trình khử nước bên tế bào xảy nhanh hoàn toàn Kết khơng có hình thành thể đá bên tế bào, nhờ mà tế bào tránh tổn thương màng bào quan tinh thể đá gây Phương pháp thủy tinh hóa cho tỉ lệ sống sau rã đông phôi trứng cao nhiều so với phương pháp đông lạnh chậm - Nhượu điểm: + Trong kỹ thuật thủy tinh hóa, đòi hỏi người thực phải thục xác kỹ thuật cao Sự thay đổi nhiệt độ ngẫu nhiên hay “tai nạn” trình lưu trữ di chuyển mẫu đơng lạnh rủi ro thường gặp Do thể tích mơi trường xung quanh trứng/phôi nhỏ, vài thay đổi nhiệt độ nhỏ làm ảnh hưởng lớn đến chất lượng trứng/phôi sau rã đông + Nồng độ chất bảo vệ đông lạnh sử dụng kỹ thuật thủy tinh hóa cao nhiều so với kỹ thuật đơng lạnh chậm trước Điều gây ảnh hưởng không nhỏ đến sức sống trứng phôi Đặc biệt ảnh hưởng lớn đến hệ thoi vô sắc trứng sua rã đông Nhiều ý kiến cho rằng, với nồng độ chất bảo vệ đông lạnh cao, tế bào nhạy cảm trứng/ phơi bị tổn thương vật 15 liệu di truyền Nhưng chưa có chứng cho thấy em bé sinh rừ kỹ thuật đông lạnh trứng/ phôi phương pháp thủy tinh hóa có tỉ lệ dị tật bẩm sinh cao phương pháp đông lạnh chậm trước CÁC KĨ THUẬT ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO 7.1 Nguồn tế bào Chỉ đông lạnh tế bào tăng sinh tốt không bị phơi nhiễm - Khả sống sót cao Tình trạng tang trưởng/ sinh lí tốt (log phase, mật độ 90%) Quan sát bên kiểm tra nhiễm: + Nuôi môi trường không kháng sinh vài lần trước kiểm tra + Quan sát trực tiếp kính hiển vi Thay đổi mơi trường ni 24 tiếng trước đông lạnh 7.2 Môi trường đông lạnh - Đệm Hepes: Vì q trình đơng lạnh làm tan đơng thực ngồi tủ ấm CO nên mơi trường có đệm HEPES thường sử dụng Mơi trường làm mơi trường ni cấy - Huyết thanh: Mặc dù vai trò huyết trữ lạnh tế bào chưa làm rõ Một số nghiên cứu chứng tỏ sử dụng môi trường có bổ sung huyết thanh, sau giả đơng, khả sống tế bào tăng; tế bào phôi, ngồi sức sống tế bào tăng, tỉ lệ có thai tỉ lệ thai làm tổ sau chuyển phôi gia tăng Tuy nhiên, việc dùng huyết trữ lạnh làm gia tăng nguy bệnh truyền nhiễm phải chấp nhận tính khơng ổn định huyết với nhiều thành phần xác định - Kháng sinh: Việc sử dụng kháng sinh nhằm mục đích hạn chế nhiễm khuẩn q trình đơng lạnh giải đơng - Muối: Đóng vai trò làm đệm sinh lí cho tế bào 16 - Đường: Đường nguồn cung cấp lượng xem tác nhân bảo quản đơng lạnh có tương tác trực tiếp với màng tế bào Đường ngăn cản khử nước mức màng làm giảm chuyển phase phospholipid hạ nhiệt độ Sucrose loại đường sử dụng với mục đích - Chất bảo quản lạnh: + Là chất tan nước, có khả tạo liên kết hydro với phân tử nước có khả xâm nhập vào bên tế bào + Tác dụng: • • • • • Thâm nhập thay chỗ cho nước bên tế bào Giảm hình thành tinh thể nước đá bên tế bào Giảm tổn thương gây nên tinh thể nước đá Hạn chế gia tăng nồng độ chất hòa tan Kết lên màng bào tương để bảo vệ cho tế bào + Đặc tính chất bảo quản đơng lạnh: • • • Có thể thấm qua màng tế bào cách bị động Có khả hoạt động thay nước Chỉ độc với tế bào nồng độ cao + Phân loại chất bảo quản đơng lạnh: • Chất bảo quản ngoại bào: BSA, saccharide, disaccharide (trehalose,…), • trisaccharide (raffinose,…), polymer (PVP, polyethylenglycol,…) Chất bảo quản nội bào: methanol, ethanol, ethylenglycol, glycerol, dimethyl sulfoxide (DMSO) + Nguyên tắc hoạt động chất bảo quản đông lạnh: Hoạt động chất bảo quản đông lạnh thể qua tượng “khử nước” q trình đơng lạnh “bù nước “ q trình giải đơng • Sự khử nước 17 Theo nguyên tắc, phôi môi trường nuôi cấy có sử dụng chất bảo quản đơng lạnh phải trải qua phản ứng thẩm thấu, nước Sau thời gian (thời gian nhanh nhiệt độ cao so với nhiệt độ thấp), tế bào hấp thụ chất bảo quản đông lạnh trở lại thể tích ban đầu Khi tế bào trở lại thể tích bình thường q trình đơng lạnh bắt đầu Do có bổ sung chất bảo quản đơng lạnh nên nước tế bào có đó, hình thành tinh thể đá • Sự bù nước Sau tan đơng, q trình bù lại nước, phản ứng phơi hồn tồn ngược lại Q trình diễn chậm Nếu có q chất bảo quản đơng lạnh mơi trường bù nước, tế bào phồng lên vỡ áp suất thẩm thấu tế bào cao Vì vậy, trình bù nước xảy bước một, tế bào ni mơi trường có nồng độ chất bảo quản đông lạnh giảm dần Mỗi lần vậy, thể tích phơi tăng lên hấp thu nước, trở lại bình thường chất bảo quản đơng lạnh Hình 6: Q trình đơng lạnh khơng chất bảo quản 18 Hình 7: Q trình đơng lạnh có chất bảo quản + Chất phụ trợ đơng lạnh: • • • Khơng có khả thấm vào tế bào Bảo vệ tế bào trình bù nước Thường mono-, di- tri-saccharide Sucrose dextran sử dụng phổ biến QUY TRÌNH ĐƠNG LẠNH TẾ BÀO - Đông lạnh tế bào động vật sử dụng môi trường đông lạnh, nhiệt độ thấp (80oC, -196oC) để lưu trữ tế bào động vật phục vụ cho nghiên cứu ứng - dụng Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình đơng lạnh như: tốc độ đông lạnh, kỹ thuật đông lạnh, chất bảo quản lạnh, môi trường dinh dưỡng, nhiệt độ bảo quản, đặc - trưng tế bào đơng lạnh… Quy trình đơng lạnh có khác biệt phương pháp đông lạnh khác (nhanh, chậm hay cực nhanh) Tuy nhiên, nhìn trình đơng lạnh tế bào gồm bước sau: 8.1.Kiểm tra tình trạng tế bào Đầu tiên, tế bào đơng lạnh phải tình trạng tăng trưởng mạnh để đảm bảo chất lượng khả phục hồi sau giải đông tốt Tế bào pha log chu kì tăng trưởng tốt (2 - ngày sau cấy chuyền, tuỳ loại tế 19 bào) 24 trước tiến hành đông lạnh, môi trường nuôi cấy thu tình trạng tế bào dấu hiệu nhiễm khuẩn ghi nhận qua việc quan sát kính hiển vi Đồng thời khuẩn lạc nấm xuất mặt phân cách pha lỏng pha khí phát cách quan sát mắt thường (quan sát kính hiển vi khơng thể phát được) Bằng cách khác, môi trường không bổ sung kháng sinh sử dụng để ni tế bào tuần trước đông lạnh nhằm dễ dàng phát nhiễm giảm thiểu khả phục hồi vi khuẩn tiềm ẩn 8.2 Bảo dưỡng thu nhận tế bào 8.3 Sử dụng chất bảo quản lạnh phù hợp - Dung dịch bảo quản lạnh: thành phần dung dịch chất bảo quản lạnh pha lỗng dung mơi thích hợp Dung mơi mơi trường nuối cấy tế bào dung dịch muối sinh lí bổ sung thêm số thành phần huyết thanh, kháng sinh…Trong số trường hợp, tế bào khó, dung dịch bảo quản gồm huyết (90 - 95%) chất bảo quản đông lạnh Việc lựa chọn chất bảo quản đông lạnh phù hợp với loại tế bào nồng độ thích hợp quan trọng, định đến hiệu đông lạnh DMSO glycerol sử dụng phổ biến có khả áp dụng cho nhiều loại tế bào khác Nồng độ chất bảo quản đông - lạnh thường từ - 10% Trypsin hay tác nhân tách tế bào Thuốc nhuộm trypan blue để xác định tỉ lệ tế bào sống, chết trước sau đông lạnh 8.4 Sử dụng dụng cụ trữ phù hợp với điều kiện đông lạnh - Việc sử dụng thiết bị dụng cụ trữ phải phù hợp với điều kiện đông lạnh Đông lạnh in situ tiến hành trực tiếp dụng cụ nuôi tế bào tủ đông -80oC 20 - Đông lạnh nitơ lỏng cần có dụng cụ chuyên biệt, bề chịu nhiệt ống đông lạnh (cryotube), cọng rạ (straw) nhiều thiết bị tủ lạnh (4oC), tủ đông (-20oC, -80oC), bình trữ nitơ 8.5 Đánh dấu 8.6 Điều chỉnh tốc độ làm lạnh Tuỳ vào phương pháp đông lạnh mà tuỳ chỉnh tốc độ làm lạnh, ví dụ như: - Phương Đơng lạnh chậm chương trình tốc độ làm lạnh chậm (0,1 – - 5oC/phút giai đoạn giảm nhiệt xuống -80C) Phương pháp đông lạnh nhanh bước tốc độ làm lạnh nhanh (4 oC 30 - phút, -20 oC 45 phút, -80oC bảo quản qua đêm) Phương pháp Thuỷ tinh hoá tốc độ làm lạnh cực nhanh (2000 – 2500 oC/ phút) 8.7 Trữ tế bào nhiệt độ -130oC 8.8 Kiểm tra mức nitơ lỏng 8.9 Ghi nhận định kì Q TRÌNH THU NHẬN TẾ BÀO SAU ĐƠNG LẠNH Quy trình thu nhận tế bào khác loại tế bào khác Thông thường, chia loại: tế bào bám dính tế bào khơng bám dính (tế bào huyền phù) Và quy trình thu nhận loại tế bào sau: Quy trình thu nhận tế bào bám dính Loại môi trường cũ cách hút bỏ Rửa đĩa tế bào PBS vài lần Tách toàn tế bào khỏi đĩa ni dung dịch trypsin Sau đó, bổ sung chất ức chế protease để làm ngừng hoạt động trypsin Ly tâm thu cặn tế bào loại bỏ trypsin, chất ức chế protease Rửa tế bào PBS vài lần Quy trình thu nhận tế bào huyền phù Ly tâm thu cặn tế bào loại bỏ môi trường cũ Rửa đĩa tế bào PBS vài lần 21 Xác định số lượng tế bào sống Xác định số lượng tế bào sống Huyền phù cặn tế bào vào môi trường Huyền phù cặn tế bào vào môi trường đông lạnh đông lạnh Phân phối dịch tế bào vào ống Phân phối dịch tế bào vào ống đông lạnh đông lạnh Chuyển ống đông lạnh vào thiết bị Chuyển ống đông lạnh vào thiết bị làm lạnh (tuỳ theo phương pháp đông làm lạnh (tuỳ theo phương pháp đông lạnh) lạnh) BẢNG 2: Quy trình thu nhận loại tế bào Loại mơi trường cũ Tách tế bào Ly tâm thu cặn tế bào Đếm mật độ tế bào Huyền phù vào môi trường đông lạnh Bổ sung vào dụng cụ đông lạnh Đưa vào nhiệt độ đông lạnh phù hợp Giải đông 37oC Loại môi trường bảo quản 22 Tái nuôi cấy môi trường Đếm mật độ tế bào 10 GIẢI ĐƠNG TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 10.1 Mục đích Khơi phục lại trạng thái hoạt động, đặc điểm, tính chất tế bào nuôi cấy tế bào động vật 10.2 Quy trình giải đơng tế bào động vật có vú trữ lạnh theo quy trình Schrieber’s • Lấy ống tế bào đơng lạnh từ bình Nitơ lỏng, đặt vào bình ổn nhiệt có lắc 370C • Chuyển dịch huyền phù tế bào vào ống đơng lạnh sang ống ly tâm 15ml vơ trùng • Bổ sung huyết tế bào thai FBS • Ly tâm phút với tốc độ 1000 vòng/phút • Bổ sung - 6ml môi trường dung dịch làm ấm • Chuyển sang bình ni ủ 370C điều kiện nồng độ CO2 5% • Sau 24h kiểm tra kết ni cấy, bỏ mơi trường cũ bổ sung - 6ml môi trường làm ấm nuôi cấy 10.3   Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng tế bào q trình giải đơng Nếu q trình giả đơng chậm, tế bào bị tổn thương bị chết nhiều, ảnh hưởng đến kết nuôi cấy Nếu trình giải đơng nhanh, kỹ thuật chất lượng tế bào tốt 11.MỘT SỐ ỨNG DỤNG 11.1 Ứng dụng kĩ thuật đông lạnh tinh trùng 23 - a) Đối với động vật: Giúp người dễ dàng thuận lợi việc xuất nhập trao đổi giống - nước, vùng, địa phương thương mại hóa Bảo tồn nguồn gen q phục hồi lồi động vật có nguy tiệc chủng Nâng cao khả sinh sản, sản phẩm thịt sữa chăn nuôi Hạn chế mức tối thiểu số lượng gia súc làm giống, từ giảm chi phí khác - kèm Bảo tồn thành lập ngân hàng tinh trùng động vật Vào ngày 6/1/2016 giới chức Trung Quốc thông báo gấu trúc giới tạo từ tinh trùng đông lạnh chào đời nước - b) Đối với người Đơng tinh mẫu hiến tự nhằm góp mẫu vào ngân hàng tinh trùng, theo dõi - điều trị cho trường hợp khơng có tinh trùng, tinh trùng ít, di dạng nhiều Trữ lạnh tinh trùng để trì khả sinh sản trước thủ thuật, phẫu thuật - điều trị hóa chất, xạ trị Gây ảnh hưởng đến khả sinh sản sau Người đàn ông muốn triệt sản phẫu thuật chuyển giới lấy tinh trùng - bảo quản phòng muốn có sau Đơng lạnh tinh trùng làm giảm nguy lây nhiễm bệnh nhân bị bệnh lây - nhiễm qua đường tình dục AIDS Vào năm 2014, cậu bé Xavier đời từ tinh trùng đông lạnh người cha Alex Powell từ 22 năm trước, năm 1992 Alex phát bị ung thư phải hóa trị anh định đơng lạnh tinh trùng nguy vơ sinh hóa trị cao 11.2 Ứng dụng kĩ thuật đông lạnh trứng - Đơng lạnh trứng để bảo tồn trứng chưa thụ tinh người phụ nữ để sử - dụng thụ thai sinh em bé sau Tạo điều kiện cho phụ nữ lưu trữ số lượng trứng có chất lượng tốt trẻ Đơng lạnh trứng sớm cải thiện khả có lai so với việc đơng lạnh trứng muộn Đơng trứng mở nhiều hội cho phụ nữ chưa chịu lấy chồng sớm tiền mãn kinh mang thai 24 - Bảo toàn hội làm mẹ cho bệnh nhân nữ bị ung thư, chuẩn bị điều trị hóa trị, xạ trị, hóa trị xạ trị độc hại buồng trứng nang noãn Khi việc điều trị ung thư kết thúc, trứng rã đơng họ có phụ nữ bình thường 11.3 - Ứng dụng kĩ thuật đông lạnh phôi Lưu trữ phôi đông lạnh kỹ thuật hầu hết trung tâm hỗ trợ sinh sản giới áp dụng giúp giảm chi phí nhiều khơng phải sử dụng - thuốc kích thích buồng trứng để tạo phơi tươi Đông lạnh phôi trở thành kĩ thuật thiếu trung tâm thụ tinh ống nghiệm giới, mở hướng - công nghệ hỗ trợ sinh sản Đông lạnh phôi trữ lạnh phôi nhiệt độ cực thấp (-196 0C) nitơ lỏng làm ngưng hồn tồn phản ứng enzyme nội bào, hơ hấp tế bào, chuyển hóa, phát triển Giúp lưu giữ chúng thời gian dài mà sau rã đơng phơi phát triển bình thường a) Đối với động vật - Khai thác triệt để tiềm di truyền thể cao sản thông qua việc - lấy phôi chúng Nâng cao hiệu chọn lọc, đẩy mạnh công tác giống Bảo quản phôi gọn nhẹ, vận chuyển dễ dàng, đồng thời kho bảo tồn quỹ - gen Hạn chế bệnh tật thú y Mang lại hiệu kinh tế cao b) Đối với người Bảo quản đông lạnh phôi phương pháp hàng đầu việc giúp tăng hội thụ thai cho bệnh nhân điều trị bệnh vô sinh, cho phép người bệnh chủ động điều trị vô sinh Bên cạnh đó, đơng lạnh phơi cho phép người bệnh chuyển phôi với số lượng giới hạn để giảm tỷ lệ đa thai, hỗn chuyển phơi có nguy q kích buồng trứng nặng 25 - Chuyển phơi đơng lạnh giúp tăng tỉ lệ có thai, tăng tỉ lệ sinh sống, giảm sảy thai, tăng trọng lượng bé sơ sinh, người mẹ em bé khỏe 11.4 Ứng dụng kĩ thuật đông lạnh tế bào gốc - a) Đối với động vật Tế bào gốc đông lạnh giúp phục hồi đa dạng sinh học lồi có nguy tuyệt - chủng tê giác trắng khỉ đầu chó Sử dụng tế bào gốc để làm cho tinh trùng trứng từ tế bào da động vật chết sở thú đơng lạnh, họ giúp đa dạng di truyền tăng dân số - loài động vật b) Đối với người Sử dụng tế bào gốc vào mục đích nghiên cứu chế sinh lí bệnh lí - thể, nghiên cứu phát triển thuốc biện pháp điều trị Ứng dụng tế bào gốc chữa nhiều chứng bệnh như: trí nhớ, Parkinson, tiểu đường type 1, bệnh tim, đột quỵ, ung thư, chấn thương cột sống, viêm khớp xương - mãn tính viêm khớp dạng thấp Nghiên cứu tế bào gốc mở hướng khả quan tái tạo cấy ghép - mô, quan nội tạng Ứng dụng để điều trị tổn thương da, bệnh lí da liễu chăm sóc da thẩm mĩ 26 ... môi trường đông lạnh đông lạnh Phân phối dịch tế bào vào ống Phân phối dịch tế bào vào ống đông lạnh đông lạnh Chuyển ống đông lạnh vào thiết bị Chuyển ống đông lạnh vào thiết bị làm lạnh (tuỳ... lạnh như: tốc độ đông lạnh, kỹ thuật đông lạnh, chất bảo quản lạnh, môi trường dinh dưỡng, nhiệt độ bảo quản, đặc - trưng tế bào đơng lạnh Quy trình đơng lạnh có khác biệt phương pháp đơng lạnh. .. điều kiện đông lạnh - Việc sử dụng thiết bị dụng cụ trữ phải phù hợp với điều kiện đông lạnh Đông lạnh in situ tiến hành trực tiếp dụng cụ nuôi tế bào tủ đông -80oC 20 - Đông lạnh nitơ lỏng cần