Giáo trình công nghệ sinh học động vật

MỞ ĐẦU I KHÁI NIỆM Công nghệ Sinh học (CNSH) (Biotechnology) đòi hỏi tập hợp trí tuệ, kỹ thuật dựa tảng khoa học sống Đó kết việc ứng dụng nguyên lý khoa học công nghệ để chế tạo, sản xuất nguyên vật liệu tác nhân sinh học, nhằm tạo hàng hóa dịch vụ phục vụ người Công nghệ Sinh học người động vật (CNSH N&ĐV) kỹ thuật CNSH tiến hành ứng dụng đối tượng người động vật Ở nước ta, CNSH người chưa thực phát triển thành lĩnh vực độc lập, nên thường gọi chung Công nghệ Sinh học Động vật (CNSH ĐV) CNSH ĐV có lịch sử tiềm tàng lâu dài, kiến thức ứng dụng sơ khai diễn cách 8.000 năm khu vực Tây Bắc Á, người lần biết săn bắt loài động vật hoang dại nuôi để lấy thịt, lông, sữa…và sau hóa chúng làm phương tiện vận chuyển Cách nhiều thập niên, người có nhiều cải tiến mạnh mẽ chăn nuôi động vật, biết chọn lọc cá thể khỏe mạnh, tiêm chủng để phòng ngừa bệnh, thực nhiều kỹ thuật khác để tăng cường khả sinh sản chúng Tuy nhiên, CNSH ĐV đại (dựa thành tựu tế bào học di truyền học) thật bắt đầu vào năm 60 kỉ XX bùng nổ hai thập kỷ gần II NỀN TẢNG KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT II.1 GENOMICS VÀ BỘ GEN NGƯỜI II.1.1 Genomics Genomics lĩnh vực nghiên cứu thành phần, tổ chức, chức tiến hóa thông tin di truyền chứa gen Ba lĩnh vực genomics: hệ gen cấu trúc (structure genomics), hệ gen chức (functional genomics), hệ gen so sánh (comparative genomics) Genomics xem tâm điểm sinh học, kết từ nghiên cứu genomics đã, đóng góp tích cực vào lĩnh vực ứng dụng chăm sóc sức khỏe người, nông nghiệp, lâm nghiệp nhiều lĩnh vực khác Sự phát triển nhanh chóng genomics có trợ giúp ngành khoa học kỹ thuật khác, chẳng hạn thiết bị giải trình tự… Ngoài ra, “đua nhau” giải mã gen sinh vật từ năm 1990 với nhiều quy mô, nhiều mức độ khiến công việc trở nên sôi động Đến nay, có 100 loài giải mã gen II.1.2 Bộ gen người Ý tưởng giải trình tự gen người đưa từ họp tổ chức vào năm 1984-1986 Cơ quan Năng lượng Mỹ (U.S Department of Energy) Chương trình khai trương Cơ quan Năng lượng Viện sức khỏe Mỹ kết hợp Vào thời điểm này, việc giải trình gen người bắt đầu Pháp, Anh Nhật Với xu hướng này, việc thành lập Tổ chức Bộ gen Người (Human Genome Organisation_HUGO) vào mùa xuân năm 1988, kéo theo số quốc gia khác tham gia chương trình có đóng góp vào kế hoạch này, đặc biệt Đức Trung Quốc Tháng 6-1988, họp quan trọng việc giải trình tự lập đồ gen (Genome Mapping Sequencing Meeting) tổ chức Cold Spring Harbor chứng kiến nỗ lực kế hoạch giải trình tự gen người Celera Genomics (nhóm thứ hai giải trình tự gen người Craig Venter chủ trì) Cuộc họp xem điểm nhấn ban đầu cho HGP Nhờ phát triển, hợp tác quốc tế, nhờ tiến genomics, kỹ thuật máy tính, phác thảo hành động (working draft) gen người hoàn thành vào 26/6/2000 Tháng 2/2001, phân tích phác thảo hành động công bố Dự án gen người hoàn thành tuyên bố kết thúc vào ngày 14/4/2003, sớm năm Hội nghị khoa học NIH kỉ niệm 50 năm chuỗi xoắn kép DNA Tháng 5-2006, trình tự NST người cuối công bố tạp chí Nature Mặc dù hầu hết báo cho gen người hoàn thành, thật đến năm 2006, chưa hoàn tất nhiều năm hoàn thành trọn vẹn, vùng trung tâm NST (như centromere) bao gồm trình tự DNA lặp lại cao, khó giải trình tự chúng với kỹ thuật * Ứng dụng triển vọng việc nghiên cứu gen người Các kỹ thuật công nghệ mới, tiền đề tạo từ HGP, nghiên cứu genomics khác, có nhiều tác động mạnh lên khắp ngành khoa học sống Một số ứng dụng tiềm việc nghiên cứu gen: - Thuốc phân tử (Molecular medicine) - Các nguồn lượng ứng dụng môi trường - Đánh giá rủi ro - Sinh khảo cổ, nhân loại học, tiến hóa di cư người - DNA pháp y (DNA forensic) - Nông nghiệp, sinh sản vật nuôi chế biến sinh học II.2 PROTEOMICS II.2.1 Khái niệm Proteomics khoa học nghiên cứu proteome Proteome toàn protein biểu genome Vì số gen mã hóa cho nhiều protein khác nhau, nên kích thước proteome thường lớn so với số lượng gen Thỉnh thoảng khái niệm sử dụng nhằm để mô tả toàn protein biểu tế bào, hay mô đặc biệt II.2.2 Các công cụ proteomics Công cụ proteomics liệu Các liệu protein, EST trình tự gen thu thập tạo mục lục protein biểu sinh vật Chẳng hạn, dựa vào phân tích tất trình tự mã hóa Drosophila, người ta thấy có đến 110 gen Drosophila mã hóa cho domain giống EGF, 87 gen mã hóa cho protein với domain xúc tác tyrosine kinase Theo đó, tiến hành proteomics loài này, cần có liệt kê protein biết, nghiên cứu gặp phải thông tin giới hạn, hay liệu từ phương pháp khối phổ không rõ ràng, người ta xác định thành phần protein từ trùng khớp với liệu có sẵn Công cụ thứ hai khối phổ (Mass spectrometry_MS) Các thiết bị MS có nhiều thay đổi thập niên qua, đặc biệt độ nhạy MS thực ba kiểu phân tích cần thiết cho proteomics Thứ là, MS cung cấp đo lường xác khối lượng phân tử protein nguyên vẹn 100 kDa hay Do đó, phân tích MS cách tốt để xác định khối lượng phân tử (hơn phương pháp điện di protein gel polyacrylamide) MS cung cấp đo khối lượng xác peptide từ trình protolytic Dữ liệu từ peptide tìm kiếm trực tiếp, nhằm xác định xác protein mục tiêu Cuối cùng, phân tích MS cung cấp trình tự peptide từ trình thủy giải Các liệu từ MS cung cấp chiến lược rõ ràng (và mạnh nhất) việc xác định protein Công cụ thứ ba phần thu gom, kết hợp liệu MS với trình tự protein đặc biệt có sẵn sở liệu Các phần mềm lấy liệu MS không giải thích rõ ràng kết hợp với trình tự sở liệu protein, hay EST trình tự gen với thuật toán đặc biệt Khía cạnh mạnh công cụ này, chúng cho phép tự động hóa lượng lớn liệu MS, cho kết hợp trình tự protein khác Công cụ cần thiết thứ tư kỹ thuật phân tách protein Sự phân tách protein có hai mục đích proteomics Thứ nhất, chúng làm đơn giản hỗn hợp protein thành protein đơn lẻ hay nhóm nhỏ Thứ hai, chúng cho phép phát khác biệt mức độ protein so sánh hai mẫu, nên kỹ thuật phân tách, nhằm phân tích protein cho phép người tiến hành xác định protein đặc biệt Thông thường, phương pháp điện di protein hai chiều (2D-SDSPAGE) sử dụng proteomics Một số kỹ thuật khác sử dụng 1D-SDSPAGE, hay sắc ký lỏng hiệu cao (high-performance liquid chromatograph_HPLC), kỹ thuật chạy điện di mao quản (Capillary electrophoresis_CE), sắc ký lực… II.2.3 Các ứng dụng proteomics Kỹ thuật proteomics thật có tác động lớn với bốn ứng dụng Khai thác (Mining): xác định protein có mẫu từ sở liệu gen Ghi nhận biểu đặc biệt (Protein-expression profiling): xác định protein mẫu đặc biệt, chức trạng thái đặc biệt tế bào hay thể (trạng thái biệt hóa, trạng thái phát triển, trạng thái bệnh…), hay chức tiếp xúc với thuốc, kích thích hóa lý Lập sơ đồ mạng lưới protein (Protein-network mapping): xác định phương thức protein tương tác với hệ thống sống Lập đồ biến đổi protein (Mapping of protein modification): xác định phương thức vị trí protein bị biến đổi II.3 CYTOMICS Cytomics nghiên cứu trình sinh hóa, nhằm kết hợp chế mức thấp vào trình mức tế bào cuối thể Cytomics giúp hiểu tái thiết lập trình chuyển hóa (genome, proteome, metabolome), mô tế bào thể nhỏ Phân tích trình chuyển hóa nội bào, metabolome, giúp hiểu mạng lưới protein, diện gen im lặng (silent gene) II.4 CÔNG NGHỆ NANO VÀ MICRO Công nghệ nano liên quan đến khả xếp phân tử nguyên tử thành cấu trúc phân tử Nó có tác động lên máy tính, vật liệu sản xuất công cụ, thiết bị, khả can thiệp vào cấp độ điều trị bệnh Các kỹ thuật thiết kế máy micro phát triển nhanh chóng có nhiều ứng dụng vi dòng (microfluidic), sensor, sợi quang học Các microrobot nanorobot hoạt động robot di động nhỏ dịch thể công cụ tuyệt vời cho thao tác tế bào Sự đời biochip tiến vượt bậc công nghệ sinh học nano, chúng chứa đựng phạm vi rộng vấn đề nghiên cứu genomics, proteomics, sinh học máy tính dược học, số hoạt động khác Những tiến lĩnh vực tạo phương pháp mới, gỡ rối cho trình sinh hóa xảy tế bào, với mục đích tìm hiểu chữa trị bệnh cho người Các biochip xem phòng thí nghiệm thu nhỏ, lẽ tiến hành hàng trăm đến hàng ngàn phản ứng sinh hóa Biochip giúp nhà nghiên cứu sàng lọc nhanh lượng lớn chất sinh học với nhiều mục đích khác nhau, từ chẩn đoán bệnh đến phát tác nhân nguy hại sinh học II.5 KỸ THUẬT TẾ BÀO ĐỘNG VẬT IN VITRO Việc tế bào động vật nuôi cấy, trì tăng sinh chai, lọ ngày dễ dàng phòng thí nghiệm, mở hướng quan trọng nghiên cứu CNSH N&ĐV- công nghệ tế bào động vật Các dòng tế bào thiết lập, mô hình in vitro lý tưởng cho nghiên cứu nói chung Nuôi cấy tế bào động vật lượng lớn tảng sản xuất vaccine virus nhiều sản phẩm công nghệ sinh học khác Các chất sinh học sản xuất kỹ thuật DNA tái tổ hợp nuôi cấy tế bào động vật enzyme, hormone, kháng thể đơn dòng, interleukin…hay nhân tố kháng ung thư Mặc dù nhiều protein đơn giản sản xuất vi khuẩn, nhiều dược chất cần glycosyl hóa, điều phải tiến hành tế bào động vật Thu nhận, nuôi cấy biệt hóa tế bào thành công lĩnh vực nuôi cấy tế bào động vật Tuy phát triển, tế bào gốc (stem cell) hứa hẹn nhiều ứng dụng to lớn y sinh học CHƯƠNG NUÔI CẤY MÔ – TẾ BÀO ĐỘNG VẬT I GIỚI THIỆU I.1 LƯỢC SỬ PHÁT TRIỂN Kỹ thuật nuôi cấy mô – tế bào động vật kỹ thuật nuôi cấy in vitro tế bào, mô quan động vật nhằm trì và/hay tăng sinh tế bào, mô, quan cách độc lập, tách khỏi biến đổi hệ thống in vivo điều kiện bình thường stress Kỹ thuật thực với mẫu mô, tốc độ tăng sinh chúng chậm Việc nuôi cấy mô tế bào động vật tiến hành 100 năm nay, thông qua nghiên cứu nhằm tìm hiểu số vấn đề lĩnh vực sinh học phát triển Chẳng hạn Ross Harrison (1907) thành công việc nuôi tế bào thần kinh dịch huyết ếch trưởng thành Alexis Carrel nuôi phôi gà môi trường bổ sung chất dinh dưỡng giữ tim phôi gà hoạt động đến tháng thứ ba (1912) Năm 1955, Harry Eagle’s khẳng định dịch chiết mô phức tạp, dịch huyết chất dùng nuôi tế bào thay “một hỗn hợp amino acid, vitamin, co-factor, carbohydrate muối, bổ sung với lượng nhỏ protein huyết thanh…”, điều mở thời kỳ nuôi cấy tế bào động vật in vitro Sau đó, hàng loạt kỹ thuật nhằm khai thác, biến đổi ứng dụng tế bào động vật nuôi cấy in vitro tiến hành tạo tế bào biến đổi di truyền, nghiên cứu chuyển hóa sinh lý tế bào, thu nhận tạo dòng in vitro dòng tế bào bình thường (tế bào sinh dưỡng, sinh dục), bất thường (tế bào ung thư) người, nhiều động vật khác Từ thực tế khối u người tạo nên dòng tế bào liên tục (như dòng tế bào Hela Gey cs thiết lập năm 1952), nuôi cấy mô người đầu tư nghiên cứu Sau đó, vào năm 1961 Hayflick Moorhead khảo cứu tế bào bình thường có đời sống xác định Các dòng tế bào thiết lập thành công, chúng trì phần đặc điểm, chức ban đầu tế bào tuyến thượng thận, tế bào tuyến yên, tế bào thần kinh, tế bào Sự phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô ngày tinh vi, đại nhu cầu thiết hai hướng nghiên cứu chính: tạo vaccine kháng virus nghiên cứu ung thư Hiện nay, nhà nghiên cứu tiến tới sử dụng dạng tế bào lai (hybridoma) tế bào động vật tế bào ung thư, hệ thống sản xuất protein tái tổ hợp, ví dụ kháng thể đơn dòng, vaccine, interferon… Gần đây, nuôi cấy tế bào gốc (stem cell) trở thành mũi nhọn công nghệ tế bào, với nhiều hy vọng ứng dụng y sinh I.2 SƠ LƯỢC VỀ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Các tế bào động vật có vú tế bào eukaryote, chúng liên kết với nguyên liệu gian bào để tạo thành mô Mô động vật thường phân chia theo bốn nhóm: biểu mô (epithelium), mô liên kết (connective tissue), mô (muscle) mô thần kinh (nerve) Trong nuôi cấy tế bào động vật, người ta phân biệt hai nhóm: tế bào dịch huyền phù tế bào dính bám - Các tế bào dịch huyền phù: tế bào không bám dính sinh trưởng môi trường nuôi cấy in vitro, ví dụ tế bào máu tế bào lympho; tế bào không đòi hỏi bề mặt để sinh trưởng - Các tế bào dính bám: Hầu hết tế bào động vật bình thường tế bào dính bám, chúng cần có bề mặt để gắn vào sinh trưởng (thủy tinh, plastic), sử dụng phổ biến ứng dụng tế bào biểu mô nguyên bào sợi (fibroblast) Người ta thường sử dụng đĩa petri chai trục lăn để nuôi cấy tế bào dính bám Các giá thể polymer bọt biển (spongy), thể gốm (ceramic), sợi rỗng, microcapsule thể mang có kích thước hiển vi (microcarrier) sử dụng rộng rãi để tăng tỷ lệ diện tích/thể tích nuôi cấy Có mối quan hệ quan trọng hình dạng tế bào tính chất bám dính chúng Nếu tế bào bám dính vào bề mặt nuôi cấy, chúng có hình dài, trải rộng mặt đáy hộp nuôi, ngược lại, không bám dính, tế bào có hình khối cầu * Đặc điểm tế bào động vật - Tế bào động vật vách, kích thước lớn (khoảng 10 µm), nên tính bền học yếu Do đó, tế bào động vật nuôi cấy in vitro dễ vỡ lực tác động khuấy trộn để tách tế bào, thao tác… Vì vậy, thao tác với tế bào động vật, cần cố gắng thao tác nhẹ nhàng thời gian ngắn - Tế bào động vật có tăng trưởng phân chia chậm, nên hiệu suất sản sinh chất có hoạt tính sinh học thấp, chậm Do đó, để sản xuất chất có hoạt tính từ tế bào động vật, cần phải có thời gian dài khối lượng tế bào lớn - Ở tế bào động vật, có chế kìm hãm ngược (negative feed-back), có nghĩa gia tăng nồng độ chất môi trường dẫn đến ức chế tế bào tổng hợp tiết chất môi trường Điều gây tổn thương tế bào, chí làm chết hàng loạt Vì vậy, nuôi cấy mô – tế bào động vật, sau khoảng thời gian nuôi cấy định, cần thiết phải thay môi trường nuôi - Trừ tế bào máu số giai đoạn tế bào sinh dục, hầu hết mô tế bào động vật cần bám vào giá đỡ để sống phân chia Thông thường tế bào tăng trưởng tốt gắn vào bề mặt rắn Tế bào ngừng phân chia hình thành lớp đơn liên tục bề mặt dụng cụ nuôi Tuy vậy, số dòng tế bào tế bào ung thư, dòng tế bào liên tục từ mô bình thường, sau hóa, sinh trưởng phân chia trạng thái lơ lửng mà không cần bám vào - Các tế bào động vật thay đổi kiểu gen kiểu hình, thông qua trình dung hợp hai tế bào có nhân khác tạo thành tế bào lai (hybridoma) trình biến nạp VD: chủng tế bào bình thường cảm ứng thành tế bào có tính chất tế bào ung thư, thông qua trình biến nạp thực virus cảm ứng ung thư hóa chất - Các dòng tế bào động vật bảo quản lạnh sâu nitơ lỏng (-197oC) suốt nhiều năm Khi giải đông hoạt hóa, tế bào phục hồi khả tăng trưởng phân chia ban đầu Ngoài đặc tính trên, tế bào động vật có đặc điểm khác thích nghi với môi trường, nhạy cảm với ion kim loại, đa số tế bào động vật cần huyết thanh, hormone… để tăng trưởng phân chia Tất đặc điểm cần lưu ý trình nuôi cấy in vitro I.3 ƯU ĐIỂM VÀ HẠN CHẾ CỦA NUÔI CẤY MÔ – TẾ BÀO ĐỘNG VẬT * Ưu điểm - Hệ thống tế bào động vật “nhà máy tế bào” thích hợp cho việc sản xuất phân tử phức tạp kháng thể dùng làm thuốc phòng bệnh, điều trị chẩn đoán: enzyme, hormone, vaccine, kháng thể đơn dòng, thuốc trừ sâu sinh học, interferon interleukin, tế bào nguyên vẹn để thử nghiệm chất độc hóa học… - Các tế bào động vật có trình biến đổi hậu dịch mã xác (post translational modifications) sản phẩm protein sinh-dược (biopharmaceutical protein) phân giải protein, liên kết tiểu đơn vị (subunit), nhiều phản ứng kết hợp khác glycosylation, methylation, carboxylation, amidation, hình thành cầu nối disulfide phoshorylation gốc amino acid Những sửa đổi quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học sản phẩm Ví dụ trình glycosylation giúp bảo vệ protein chống lại phân giải chúng, trì khả ổn định cấu trúc biến đổi kháng nguyên - Sản xuất viral vector dùng liệu pháp gen nhằm chữa trị nhiều bệnh ung thư, HIV, viêm khớp, bệnh tim mạch xơ hóa u nang - Sản xuất tế bào động vật để dùng chất in vitro nghiên cứu độc chất học dược học - Phát triển công nghệ mô phát sinh quan để sản xuất quan thay nhân tạosinh học hay dụng cụ trợ giúp, như: da nhân tạo để chữa bỏng, mô gan để chữa viêm gan, đảo Langerhans để chữa tiểu đường… * Hạn chế Mặc dù tiềm ứng dụng nuôi cấy tế bào động vật lớn, việc nuôi cấy số lượng lớn tế bào động vật thường gặp khó khăn sau: - Tế bào động vật có kích thước lớn cấu trúc phức tạp tế bào vi sinh vật - Tốc độ sinh trưởng tế bào động vật chậm so với tế bào vi sinh vật Vì thế, sản lượng chúng thấp việc trì điều kiện nuôi cấy vô trùng thời gian dài thường gặp nhiều khó khăn - Các tế bào động vật bao bọc màng huyết tương, mỏng nhiều so với thành tế bào dày thường thấy vi sinh vật tế bào thực vật, kết chúng dễ bị vỡ - Nhu cầu dinh dưỡng tế bào động vật chưa xác định cách đầy đủ, môi trường nuôi cấy thường đòi hỏi bổ sung huyết máu đắt tiền - Tế bào động vật phần mô tổ chức (phân hóa) thể đơn vào riêng biệt vi sinh vật - Hầu hết tế bào động vật sinh trưởng gắn bề mặt I.4 MỘT SỐ KHÁI NIỆM DÒNG TẾ BÀO - Dòng tế bào (cell line): thuật ngữ dùng để quần thể tế bào giống hệt bắt nguồn từ tế bào ban đầu - Dòng tế bào liên tục (continued cell line; established cell line): dòng tế bào nuôi cấy điều kiện in vitro qua nhiều hệ, trì khả phân bào thời gian dài, có vĩnh viễn mà không thay đổi đặc tính Ví dụ: CHO (chinese hamster ovary: tế bào buồng trứng chuột Trung quốc), Schneider-2 (tế bào phôi ruồi giấm), COS1 (tế bào thận khỉ xanh Châu Phi), Hela (tế bào ung thư cổ tử cung người), Vero (tế bào thận khỉ xanh Châu Phi) - Dòng tế bào tạm thời (temporary cell line): dòng tế bào sống điều kiện nuôi cấy thời gian giới hạn Đây thường dòng tế bào thường (không phải ung thư) - Tế bào sơ cấp (primary cell): tế bào nuôi cấy điều kiện in vitro lần (nuôi cấy sơ cấp) sau tách từ khối mô - Tế bào thứ cấp (secondary cell): tế bào qua vài lần cấy truyền (nuôi cấy thứ cấp) sau tách từ khối mô I.5 CÁC CẤP ĐỘ NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Nhìn chung, phòng thí nghiệm thường có ba cấp độ chính: nuôi cấy quan, nuôi cấy mô phát triển sơ cấp nuôi cấy tế bào I.5.1 Nuôi cấy tế bào Tế bào điều kiện in vitro có điểm khác biệt so với in vivo Thứ tế bào nuôi cấy in vitro đặc tính tương tác tế bào chuyên biệt (tương tác đa chiều) mô tế bào in vivo Thứ hai môi trường in vitro thiếu vài thành phần liên quan đến điều hòa in vivo, chuyển hóa tế bào in vitro ổn định dễ kiểm soát in vivo, không thực đại diện cho mô Tuy nhiên, dù nuôi cấy mô – tế bào động vật thể nhiều khả đặc biệt nghiên cứu ứng dụng, công cụ hữu ích Có nhiều hình thức nuôi cấy khác tùy đặc tính tế bào, hay tùy thuộc vào phương pháp: nuôi cấy sơ cấp (Primary culture), nuôi cấy thứ cấp (Secondary culture), nuôi cấy huyền phù (Suspension culture) nuôi cấy lớp đơn (Monolayer culture) Nuôi cấy sơ cấp: nuôi cấy tế bào sau tách từ cách mảnh mô trước lần cấy chuyền Nuôi cấy sơ cấp thường sử dụng để khai thác tế bào ban đầu mảnh mô, nhằm tạo dòng tế bào Trong nuôi cấy sơ cấp, tế bào ban đầu thường hỗn hợp dòng khác nhau, chứa kiểu tế bào trội nhất, có tế bào quan tâm tế bào khác (tế bào nhiễm) Có thể loại bỏ tế bào nhiễm học, hay enzyme tách mô, hay cách trì điều kiện chọn lọc dương tính cho sống sót kiểu tế bào quan tâm cần thu nhận Quy trình nuôi cấy sơ cấp: thu nhận mảnh sinh phẩm, mảnh mô sống xử lý sơ bộ, loại bỏ vi khuẩn, nấm thành phần không mong muốn khác tách tạo huyền phù tế bào đơn đưa vào môi trường nuôi cấy Nuôi cấy thứ cấp tiến hành sau tế bào tạo dòng từ nuôi sơ cấp Nhiều dòng tế bào thiết lập thương mại hóa Phần lớn dòng thu nhận từ khối u (ví dụ tế bào Hela, RD…) hay từ tế bào bị biến đổi in vitro Tuy nhiên, dòng tế bào nuôi cấy phòng thí nghiệm khác nên dẫn đến phát sinh đặc tính khác khác với tế bào sơ khai ban đầu Các tế bào nuôi cấy thứ cấp đối tượng cho nghiên cứu ứng dụng công nghệ tế bào động vật Quy trình nuôi cấy thứ cấp: giải đông (đối với tế bào bảo quản lạnh) môi trường thích nuôi cấy thích hợp đưa vào Nuôi cấy huyền phù thường tiến hành với tế bào thu nhận từ máu (bạch cầu…) Có thể coi phương pháp nuôi cấy không gian ba chiều với kỹ thuật nhân sinh khối fermenter, thông qua hệ thống bioreactor, nhằm thu nhận lượng lớn tế bào mong muốn Nuôi cấy lớp đơn ứng dụng với dòng tế bào khác thu nhận từ mô rắn (phổi, thận, cơ, xương, mỡ…) cần nuôi phát triển thành lớp đơn Các dòng tế bào bám dính phân loại tế bào nội mô: BAE-1; tế bào biểu mô: Hela; mô thần kinh: SH-SY5y hay fibroblast: MRC-5 Thông thường, hình dạng in vitro tế bào sống nói phản ánh nguồn gốc mô Ngoài ra, số dòng tế bào nuôi biểu trạng thái bán bám dính (semi-adheret) B95-8 Khi đó, dụng cụ nuôi xuất hỗn hợp hai quần thể tế bào: tế bào bám tế bào huyền phù * Những thuận lợi nuôi cấy tế bào - Có thể phát triển dòng tế bào qua nhiều hệ - Có thể nuôi cấy quy mô lớn * Những bất lợi nuôi cấy tế bào - Tế bào bị số đặc tính biệt hóa mô I.5.2 Nuôi cấy mô Nuôi cấy mô phát triển sơ cấp tiến hành cách đặt mảnh mô lên bề mặt rắn nhựa, hay thủy tinh bao phủ chất dinh dưỡng dạng lỏng Trong điều kiện thích hợp, mảnh mô bám vào bề mặt rắn, tế bào phần rìa mảnh mô tăng sinh làm nới rộng mảnh mô Kỹ thuật cung cấp mô hình thử nghiệm thuận lợi so với thử nghiệm in vivo, đặc biệt tiến hành nghiên cứu độc tố Nuôi cấy mô phát triển sơ cấp dùng để thu nhận quần thể tế bào * Những thuận lợi nuôi cấy mô - Các yếu tố lý hóa môi trường (pH, nhiệt độ, áp suất thẩm thấu, O2, CO2) kiểm soát tốt Các yếu tố bổ sung có thành phần không xác định dần hiểu rõ thay thành phần xác định - Mẫu mô không đồng sau vài hệ nuôi cấy in vitro, dòng tế bào trở nên đồng hay dạng - Những tế bào nuôi cấy tiếp xúc trực tiếp với chất nồng độ thấp xác định, chất xâm nhập trực tiếp vào tế bào - So với nuôi cấy quan nuôi cấy mô, số chức bình thường mô trì nuôi cấy quy mô lớn (nhưng khó tiến hành) * Những khó khăn nuôi cấy mô - Tổ chức ban đầu mô bị - Kỹ thuật nuôi cấy cần thực điều kiện vô trùng tuyệt đối Tế bào động vật đòi hỏi cung cấp môi trường phức hợp, giống huyết tương máu hay dịch lỏng kẽ tế bào Do đó, đòi hỏi người thực phải có kỹ thành thạo hiểu biết tốt lĩnh vực - Tiêu hao nhiều công sức tiền bạc thu lượng nhỏ Giá thành việc nuôi cấy cao, nên sử dụng cần thiết - Sau thời gian phân chia liên tục, tạo thành tế bào với NST đa bội không hoàn chỉnh Ngay với nuôi cấy thời gian ngắn, tế bào ổn định mặt di truyền, không đồng tốc độ tăng trưởng tế bào tạo thay đổi từ hệ sang hệ khác I.5.3 Nuôi cấy quan Kỹ thuật nuôi cấy quan phát triển từ phương pháp nuôi cấy mô nhằm phục vụ nghiên cứu, mô hình chức nhiều thử nghiệm Đó kỹ thuật nuôi cấy in vitro mảnh quan hay quan, trì cấu trúc mô hướng phát triển bình thường Môi trường nuôi cấy quan dạng môi trường rắn hay môi trường lỏng Việc nuôi cấy quan thu nhận từ phôi thai dễ dàng quan từ thể trưởng thành, nhu cầu O2 mô trưởng thành lớn nhiều Vì vậy, để nuôi quan từ thể trưởng thành phải sử dụng môi trường với thiết bị đặc biệt Những thuận lợi nuôi cấy quan: - Chức sinh lý bình thường quan trì - Tế bào giữ trạng thái biệt hóa hoàn toàn Những bất lợi nuôi cấy quan: - Không thể nuôi cấy quy mô lớn - Cơ quan nuôi cấy phát triển chậm - Thường xuyên phải cấy chuyền sang môi trường cho thí nghiệm II ĐIỀU KIỆN LÝ – HÓA TRONG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ – TẾ BÀO ĐỘNG VẬT II.1 Nhiệt độ Tế bào loài động vật khác có nhiệt độ nuôi cấy thích hợp khác VD: tế bào động vật có vú người phát triển tốt 37 ± 10C, nhiệt độ tế bào loài chim phát triển tốt 38,50C, tế bào loài côn trùng phát triển tốt nhiệt độ 25 ± 20C Một số dòng tế bào phát triển nhiệt độ thấp thân nhiệt bình thường thể, VD: tế bào biểu mô, tế bào tinh trùng Trong nuôi cấy in vitro, tế bào động vật không chịu nhiệt độ cao 20C so với nhiệt độ phát triển thích hợp chúng, tế bào lại có khả chịu đựng nhiệt độ thấp nhiệt độ phát triển tối ưu chúng mà ảnh hưởng đến phát triển chúng sau Để trì nhiệt độ nuôi cấy, thường phải sử dụng tủ ấm (incubator) Nhìn chung, tủ ấm trì nhiệt độ cách làm ấm tuần hoàn khí nóng để đáp ứng với thay đổi nhiệt trả lại nhiệt độ nhanh chóng sau mở hay đóng cửa tủ Đối với tủ ấm có bổ sung nước khay bên trì độ ẩm cao II.2 pH pH không quan trọng việc trì cân ion thích hợp mà trì chức tối ưu enzyme nội bào, gắn kết hormone nhân tố tăng trưởng lên receptor bề mặt Sự biến đổi pH làm thay đổi chuyển hóa tế bào, dẫn tới cảm ứng 10 MPF hoạt động giảm Trứng MII hay hợp tử loại bỏ nhân (chỉ nguyên sinh chất – cytoplasm) gọi cytoplast II.6 SỰ BIỆT HÓA TẾ BÀO GỐC PHÔI Các tế bào gốc phôi tìm hiểu vào năm gần đây, chúng tỏ có hấp dẫn đặc biệt nhà khoa học tính toàn linh động Karin Hubner cs (2003) nuôi cấy tế bào gốc phôi chuột thời gian dài tạo tế bào giống trứng (oocyte-like cell) từ tế bào gốc phôi (a) Cấu trúc giống nang trứng sơ cấp (b) Cấu trúc giốngnang trứng thứ cấp Hình 3.3 Hình thái cụm tế bào gốc phôi trứng (Hubner cs, 2003) Các tế bào giống trứng hình thành trình nuôi cấy tế bào gốc phôi, biểu marker giống với tế bào trứng bình thường tạo trình sinh trứng in vivo Do đặc tính toàn tế bào gốc phôi, việc sử dụng chúng công nghệ tạo dòng động vật quan tâm đặc biệt trị liệu Các chế hoạt động gen tế bào gốc phôi chưa tìm hiểu nhiều, song chiến lược đầy hứa hẹn công nghệ tạo dòng trị liệu III CÁC KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG TẠO DÒNG IN VITRO Với nhiều quy trình kỹ thuật, 75% thành công thí nghiệm tạo dòng dụng cụ thao tác tốt Có nhiều dụng cụ, thiết bị sử dụng chung công nghệ hỗ trợ thụ tinh ICSI Kỹ thuật vi thao tác (micromanipulation technique), coi chìa khóa tạo dòng vô tính in vitro động vật, cấp độ phôi tế bào Nhìn chung, công nghệ tạo dòng vô tính in vitro động vật hữu nhũ sử dụng noãn bào trưởng thành loại bỏ nhân 1n với thủ pháp điển hình sau: III.1 Tách phôi (embryo spitting) Một phôi tách (in vitro) vi thao tác thành hai hay nhiều phần tương đối nhau, chí tách thành tế bào riêng rẽ 47 Phôi giai đoạn cuối phôi dâu giai đoạn đầu phôi nang cho kết tách đôi cao giai đoạn sau Khi cắt phôi giai đoạn muộn hơn, tế bào phôi biệt hóa hình thành nên phôi nên xác xuất cho thể trọn vẹn khó đảm bảo, thông thường thai bị chết trước sinh Để tách rời tế bào phôi, cần thực giai đoạn sớm (thường – hay tế bào) tế bào phát triển thành thể hoàn chỉnh với điều kiện thích hợp với chúng Các tế bào phôi ban đầu Tế bào phôi tách rời Phát triển thành phôi Cấy phôi vào nhận khác Các cá thể đời giống Hình 3.4 Chiến lược tạo dòng tách phôi thành tế bào đơn * Ý nghĩa tách phôi: - Tăng nhanh số lượng phôi từ phôi ban đầu, điều giúp người chăn nuôi có nhiều giống hơn, đặc biệt giống mặt di truyền - Giúp xác định giới tính sớm vật nuôi - Giúp cho vấn đề nghiên cứu ứng dụng khác phát triển Tuy nhiên, số lượng phôi tăng lên từ kỹ thuật tách, cắt không nhiều III.2 Chuyển nhân (nuclear transfer) Chuyển nhân kỹ thuật then chốt công nghệ tạo dòng động vật, đó, nhân tế bào sinh dưỡng thể trưởng thành (hay tế bào phôi) thu nhận chuyển vào trứng trưởng thành loại bỏ nhân) Kỹ thuật giúp tạo dòng tế bào mới, tiếp tục phát triển, “phôi” hình thành cá thể thông qua cấy phôi Cá thể đời có “bản sao” DNA xác thể mẹ cung cấp nguồn tế bào sinh dưỡng ban đầu nói Hình 3.5 Tiến trình chuyển nhân tạo cừu Dolly * Quy trình chuyển nhân khái quát gồm năm bước sau: a) Bước 1: Chuẩn bị cytoplast: Các tế bào trứng chưa thụ tinh sử dụng tế bào nhận nhân mới, sau loại bỏ nhân chúng Các trứng thường thu nhận phương pháp chọc hút buồng trứng, sau đó, nuôi trưởng thành in vitro cuối loại bỏ nhân a b c Hình 3.6 Loại nhân tế bào trứng (a) Trứng (chưa thụ tinh) ủ với thuốc nhuộm DNA để định vị DNA (b) Pipette giữ trứng pipette xuyên màng ZP hút nhiễm sắc thể thể cực thứ (c) Trứng loại bỏ nhân, chứa chất nguyên sinh (cytoplast) b) Bước Chuẩn bị tế bào cho nhân: Các tế bào cho lấy từ nhiều nguồn khác với nhiều mức độ biệt hóa khác (tế bào tuyến vú, tế bào mô cơ, tế bào gốc biểu mô, tế bào đuôi, tế bào granulosa, tế bào gan, tế bào thần kinh vỏ não, tế bào tử cung, tế bào mô tinh hoàn, mô gờ sinh dục, tế bào gốc da, mô da, tế bào cumulus, tế bào mầm sinh dục, tế bào gốc, tế bào máu, tế bào mũi ) Hình 3.7 Phương pháp thu nhận nhân (2n) tế bào sinh dưỡng Các tế bào cho nhân nuôi cấy in vitro tạo phù hợp (về chu kỳ tế bào) với trạng thái nguyên sinh chất trứng Trong vài trường hợp, người ta bỏ đói tế bào cho nhân để đưa chúng chu kỳ mong muốn c) Bước Chuyển nhân: Thông thường dung hợp màng tế bào cho tế bào trứng Có ba kỹ thuật phổ biến: kích thích xung điện, xử lý hóa chất (polyethylene glycol – PEG), dùng virus Sendai 49 d) Bước Hoạt hóa phôi: Phôi tế bào hình thành hoạt hóa tín hiệu hóa học hay xung điện để khởi động trình phát triển Tín hiệu thường dùng ionomycin, ethanol, thimerosal, inositol 1,4,5-triphosphate, calcium ionophore 23178 Ngoài ra, dịch chiết tinh trùng sử dụng e) Bước Nuôi cấy phôi: Phôi sau hoạt hóa, nuôi cấy in vitro với môi trường thích hợp Sau thời gian này, phôi phát triển tới blastocyst (khoảng 120 tế bào), giai đoạn thích hợp cho cấy truyền III.3 Chuyển tế bào sinh dưỡng Thay chuyển nhân, tế bào 2n nguyên vẹn chuyển thẳng vào noãn bào trưởng thành (đã làm nhân) vi thao tác vi thao tác có hỗ trợ xung điện (Piezoelectric assisted nuclear transfer) a b c Hình 3.8 Chuyển tế bào vào trứng loại nhân (a) Tế bào fibroblast lựa chọn, hút vào pipette (b) Đâm pipette vào màng zona, tế bào đặt vào khoảng ZP cytoplasm (c) Rút nhẹ nhàng pipette III.4 Dung hợp (fusion) - Dung hợp (fusion) trứng với tế bào 2n: chất, trường hợp giống với chuyển tế bào, chúng khác cách chuyển Dung hợp tế bào với trứng (đã loại nhân) thực nhiều cách khác nhau, việc dùng xung điện tiến hành phổ biến III.5 Trinh sản - Tạo dòng vô tính động vật kỹ thuật trinh sản (Parthenogenesis technique) với tác nhân kích thích lý học, hóa học hay học phát triển sớm gặt hái nhiều thành tựu, đóng góp vào thành công chung lĩnh vực tạo dòng vô tính Có nhiều tác nhân xác định có khả kích thích trinh sản: tia điện, châm kim, lực học, áp suất thẩm thấu, nhiệt độ Đã có nhiều báo cáo kích thích trinh sản thành công nhiều động vật, kể động vật có vú thỏ, chuột nhắt, heo… 50 a b Hình 3.9 Các dạng phôi tạo phương pháp trinh sản (a) Phôi heo blastocyst thoát nang phát triển sau IVM 44 giờ, kích thích liên tục xung điện 80-µsec, 1,0 kV/cm DC Sau xử lý Cytochalasin B µg/ml để cảm ứng lưỡng bội hóa (Jie Zhu cs, 2001) (b) Phôi chuột cống hoạt hóa strotinum phát triển đến giai đoạn tế bào (Otaegui cs, 1999) IV MỘT SỐ KHIẾM KHUYẾT Ở ĐỘNG VẬT TẠO DÒNG VÔ TÍNH IV.1 CÁC BIỂU HIỆN ĐIỂN HÌNH Những động vật đời kỹ thuật tạo dòng thường không dòng thực sự, chúng có vài khác biệt so với hai cá thể sinh đôi trứng a b c Hình 3.10 Chuột tạo dòng có thai kích thước thể lớn bình thường (a) Cùng 13 ngày tuổi, thai chuột tạo dòng có thai lớn chuột đối chứng (b) (thụ tinh in vitro) (c): Chuột tạo dòng vô tính (trái) nặng 77,95 g, đối chứng (thụ tinh in vitro) (phải) nặng 42,90 g 12 tháng tuổi (Atsuo cs, Kellie cs, 2000) Hầu hết khiếm khuyết biểu gia tăng kích thước, bất thường thai Một số khác có vấn đề phổi, thận hệ tim mạch, rối loạn tổ chức gan, khớp não, suy thoái chức hệ miễn dịch, tăng trọng không bình thường sau sinh… Nhiều khiếm khuyết nói chẩn đoán ngăn chặn kỹ thuật tại, vậy, mô quan phát triển lệch lạc Tất giả thiết rằng, bất thường khiếm khuyết nói động vật tạo dòng biểu gen bất thường, sai lệch giai đoạn sớm phôi Không con, ”bà mẹ” tham gia vào công nghệ tạo dòng có ảnh hưởng định Tỷ lệ tử vong bệnh tật cá thể mẹ (bò cừu) tăng đáng kể nhiều nguyên nhân, chẳng hạn, thai chết sớm chửa, thai gia tăng kích thước, bất thường thai, ngộ độc thai… 51 Như vậy, việc tạo dòng sinh sản có rủi ro cao sức khỏe thai hay non mẹ (mang thai) IV.2 NGUYÊN NHÂN PHỔ BIẾN * Thất bại trình tái thiết lập chương trình Tái thiết lập chương trình trình mà DNA protein kết hợp nhân cấy từ tế bào sinh dưỡng điều chỉnh lại để sẵn sàng phối hợp với bào tương trứng Sự hoà hợp đồng yếu tố tiên quyết, cần cho trình phát triển sớm tạo sản phẩm cần thiết cho phát triển phôi sớm Tuy nhiên, sau chuyển, nhân không đủ thời gian để hoàn tất trình tái thiết lập chương trình trước phôi bắt đầu phát triển lên giai đoạn blastocyst, làm cho sản phẩm không thích hợp không phối hợp Những lỗi trình tái thiết lập chương trình liên quan đến gen * Thất bại trình in dấu gen Những thay đổi biểu gen in dấu xảy suốt trình nuôi cấy in vitro Những bất thường động vật tạo dòng (và thấy động vật tạo dòng) có có lẽ hậu trình cấy nhân Gần đây, nhiều ý kiến cho cho rằng, tác động sai sót trình in dấu không ảnh hưởng lên phát triển phôi chức thai, mà chúng gây nhiều hậu xấu lên phát triển não trí nhớ hình thành thể (Georgiades cs, 2001) * Dị ty thể (Mitochondrial heteroplasmy) đối nghịch Dị ty thể tượng trộn lẫn ty thể tế bào thao tác chuyển noãn tương Ở kỹ thuật SCNT, tượng dị ty thể xảy Tuy nhiên, lượng nhỏ ty thể tế bào đưa vào bị kìm hãm ty thể trứng trường hợp bị trứng loại bỏ Trong kỹ thuật chuyển nhân tế bào sinh dưỡng, DNA nhân cho xem ty thể trứng vật ngoại lai, xảy đối kháng nhân cho gen ty thể trứng Điều gây nên khiếm khuyết tăng trưởng điều hòa sai lệch số gen * Sự ngắn dần telomere Telomere phức hợp DNA-protein đầu mút NST tế bào nhân thật, cần thiết cho toàn vẹn NST phát triển tế bào bình thường Trong tế bào sinh dục, phần xây dựng lại enzyme telomerase Do đó, có khả động vật tạo dòng từ tế bào sinh dưỡng có telomere ngắn, điều làm cho tế bào già trước tuổi động vật tạo dòng chí, sản xuất sai protein từ gen vùng gần telomere Trong thực nghiệm, làm giảm tối thiểu ảnh hưởng cách lựa chọn kiểu tế bào cho nhân * Sự đột biến Nguồn nhân để sử dụng cho tạo dòng sinh sản lựa chọn cẩn thận Người ta thường hạn chế chọn tế bào có nhiều nguy tích lỹ đột biến tế bào thể già, tế bào phát triển đĩa nuôi cấy in vitro thời gian dài… * Sự bất hoạt NST X Thực nghiệm Eggan K cs (2000) cho thấy bất hoạt NST X tiến trình in vitro không nguyên nhân đáng ý gây khiếm khuyết nghiêm trọng động vật tạo dòng 52 V ỨNG DỤNG CỦA TẠO DÒNG VÔ TÍNH ĐỘNG VẬT * Ứng dụng nông nghiệp - Tạo động vật mang tính trạng mong muốn, giá trị cao - Giảm thiểu chất độc hại môi trường Dường sản phẩm thu nhận từ động vật tạo dòng không tiềm ẩn rủi ro sức khỏe người * Ứng dụng y học - Động vật tạo dòng (kết hợp với chuyển gen bệnh người) mô hình lý tưởng cho nghiên cứu bệnh - Động vật tạo dòng (kết hợp với chuyển gen sản xuất protein mong muốn người) “bioreactor” lý tưởng để sản xuất protein mong muốn Tuy nhiên, việc sử dụng sản phẩm dường tiềm ẩn số rủi ro nên sản phẩm cần kiểm tra mức độ an toàn điều kiện định trước đưa thị trường - Động vật chuyển gen tạo dòng (được sử dụng phổ biến heo) đối tượng cho mô ghép phục vụ cho dị ghép quan tâm Tuy nhiên, vấn đề vấp phải số quan điểm không đồng tình xã hội đạo đức như: khả truyền bệnh từ động vật cho sang người nhận, tương hợp sinh lí giải phẫu quan động vật cho người, thải loại quan cấy ghép - Thu nhận tế bào gốc phôi biệt hóa trực tiếp chúng thành dòng tế bào chuyên biệt, phù hợp với người bệnh để cấy ghép (liệu pháp tế bào) - Từ thử nghiệm tạo dòng vô tính mô hình động vật, thu nhận quy trình, kết quả, kỹ thuật thao tác, tìm hiểu nguyên nhân… nhằm điều trị bệnh có liên quan tới sinh sản * Ứng dụng nghiên cứu - Các động vật nhân dòng vô tính sử dụng mô hình cho nghiên cứu, đạc biệt nghiên cứu ảnh hưởng môi trường lên điều hòa biểu gen - Động vật tạo dòng công cụ để nghiên cứu biệt hóa tế bào, làm tiền đề cho phát triển liệu pháp trị bệnh - Ngoài ra, tạo dòng động vật sử dụng nhằm cứu vãn loài động vật có nguy tuyệt chủng VI VẤN ĐỀ TẠO DÒNG VÔ TÍNH Ở NGƯỜI Nhân dòng vô tính người cho mục đích sinh sản vấp phải nhiều khó khăn, đặc biệt phản đối xã hội pháp luật Tuy nhiên, gần có báo cáo thành công nhân phôi người cho mục đích – phôi nhân phát triển đến giai đoạn – tế bào sau ngày chuyển nhân trữ lạnh Hiện nay, tất nước giới cấm tạo dòng sinh sản người Quan điểm tạo dòng mục địch trị liệu chưa chấp nhận rộng rãi, rõ ràng có ý nghĩa đáng kể việc khắc phục miễn dịch thải loại cấy ghép tế bào, mô quan 53 CHƯƠNG MỘT SỐ THÀNH TỰU ĐIỂN HÌNH CỦA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT I HỖ TRỢ SINH SẢN Năm 1982, Brackett cs, nuôi sử dụng tế bào trứng chín in vivo, sau thử nghiệm kỹ thuật IVF (in vitro fertilization) đời bê từ ống nghiệm giới Từ đó, phôi nhiều loài động vật sản xuất theo cách bò (Gordon Lu, 1990), dê (Hanada 1985), heo (Cheng cs, 1986)… Thụ tinh ống nghiệm người manh nha từ năm 1961, đến năm 1978 có em bé đời (bé Louise Brown) Từ đó, công nghệ phát triển vượt bậc: tính đến năm 1990, giới, có tới gần 100.000 bé đời thụ tinh ống nghiệm, năm 2006, số lên đến hàng triệu Ở khu vực Đông Nam Á, với Thái lan, Singapore, Malaysia…Việt nam thực thành công kỹ thuật vào năm 1998 Công nghệ IVF thực mang lại niềm hy vọng cho nhiều cặp vợ chồng muộn Tới nay, tiến kỹ thuật IVF điều trị hầu hết chứng vô sinh Với đời nhiều kỹ thuật ET (embryo transfer – chuyển phôi vào tử cung), GIFT (gamete intrafallopian transfer – chuyển giao tử vào vòi trứng), ZIFT ( zygote intrafallopian transfer – cấy chuyển phôi vào vòi trứng động vật mang), ROSI (Round spermatid injection – tiêm tinh trùng hình tròn) giúp tăng đáng kể hiệu hỗ trợ sinh sản, đến nay, người ta điều trị hầu hết chứng vô sinh Kỹ thuật IVM (in vitro maturation–nuôi chín ống nghiệm) có ý nghĩa lớn bệnh nhi điều trị tác nhân có khả gây đột biến di truyền, giúp cho người có bình thường trưởng thành Kỹ thuật đông lạnh bảo quản phôi đạt thành công to lớn ứng dụng rộng rãi người động vật Các phương pháp đông lạnh tỏ hiệu quả, việc bảo tồn nguồn gen loài có nguy tuyệt chủng Bảo quản tế bào gốc phôi phương pháp hữu hiệu để bào tồn nguồn gen Thông qua việc chọn lọc giới tính tinh trùng xác định trực tiếp giới tính phôi, người ta điều khiển giới tính phôi, điều có ý nghĩa chăn nuôi Kỹ thuật tạo dòng (cloning) động vật phương pháp cắt phôi (EMS) hay chuyển nhân (BNT) thành tựu khoa học quan trọng Cừu Dolly động vật hữu nhũ nhân dòng từ tế bào 2n trưởng thành (1997), vấn đề gây nhiều tranh cãi đạo lý sinh học Sau đó, nhiều động vật khác nhân dòng theo phương pháp Kỹ thuật nhân dòng sử dụng để nhân nhanh giống vật nuôi (VD: nhân dòng bò Holstein kỹ thuật cắt phôi) bảo tồn loài động vật có nguy tuyệt chủng phục vụ nghiên cứu y sinh 54 Bảo tồn Bảo tồn Bảo tồn in vitro Bảo tồn in situ Tế bào sinh tinh, sinh trứng Bảo quản phôi, tinh Tế bào sinh dưỡng Thiết lập bầy đàn Giải đông Trứng Tinh Tinh Tạo dòng vô tính Phôi Hỗ trợ sinh sản Cấy truyền Cá thể Cá thể đực Cá thể Bầy đàn Hình 4.1 Các chiến lược bảo tồn tái thiết lập bầy đàn II ĐỘNG VẬT BIẾN ĐỔI GEN Một xu hướng chủ đạo việc ứng dụng công nghệ di truyền tạo động vật biến đổi gen dùng sinh vật sản xuất sản phẩm không truyền thống, phục vụ cho nhu cầu người: nguồn thuốc (động vật sản xuất hormone, protein máu… từ sữa, trứng, máu… cho người động vật; nguồn tế bào, mô quan sống phục vụ cho trị liệu dị ghép (xenotransplantation); tạo mô hình động vật thí nghiệm phục vụ cho nghiên cứu bệnh lí, dược lí độc học; tạo nguồn thực phẩm cho người động vật sản phẩm hữu dụng khác (vaccine, sợi ) Động vật biến đổi gen động vật làm thay đổi đặc tính di truyền không thông qua giao phối tự nhiên hay tái tổ hợp tự nhiên cá gen Quá trình tạo nên động vật biến đổi gen gọi trình biến đổi gen động vật Có nhiều cách khác để làm biến đổi gen động vật: chuyển gen (transgenesis), bất hoạt gen (knock out), thay gen (knock in), công nghệ NST (chromosome engineering), gây đột biến (bằng tia phóng xạ, hóa chất, virus chọn lọc dòng) hay kỹ thuật nhân bản… Sử dụng động vật biến đổi gen có hàng loạt ưu điểm như: chúng có khả sinh sản bình thường để phát triển hệ động vật chuyển gen tiếp theo, khả sản xuất chúng linh động, số lượng sản phẩm phụ thuộc vào số lượng cá thể hay bầy đàn Đặc biệt, động vật có khả tự trì nguồn lượng, nguồn nguyên vật liệu cho thân chúng 55 * Ứng dụng động vật biến đổi gen y học DNA Vật nuôi chuyển gen Cải thiện sức khỏe, sản phẩm động vật Sản xuất dược liệu, quan cấy ghép Các thông tin khác Hình 4.2 Các mục đích nghiên cứu chuyển gen vật nuôi - Mô hình gen gây bệnh: nhà khoa học tạo động vật biến đổi gen mô hình bệnh lý người giúp tìm hiểu đường gây bệnh, đánh giá liệu pháp trị liệu - Tạo động vật biến đổi gen để nghiên cứu chức gen: động vật biến đổi gen tạo mô hình để phân tích chức gen Những mô hình động vật đóng góp to lớn nghiên cứu nhiều trình tế bào - Kiểm tra chất độc: động vật chuyển gen sử dụng để thử nghiệm hợp chất trước đưa khỏi phòng thí nghiệm, đặc biệt trước đưa vào thực phẩm, mỹ phẩm, thuốc hay dung dịch công nghiệp khác Các cho kết nhanh, rẻ, sàng lọc lượng lớn thuốc hóa chất chứa yếu tố độc hay có khả ung thư Ngày nay, phòng thí nghiệm sử dụng nhiều phương pháp khác như: dựa vào máy tính; kỹ thuật lý-hóa; microarry; nuôi cấy quan, mô, tế bào; phôi sinh vật bậc thấp nhằm làm giảm số lượng động vật thử nghiệm giảm stress động vật nuôi - Tạo sản phẩm thể động vật: động vật biến đổi gen sử dụng nhà máy dược phẩm hiệu Đến nay, có khoảng 29 protein liệu pháp người sản xuất động vật chuyển gen, hầu hết chúng có sữa, số máu, nước tiểu hay dịch tinh trùng Một số loài sử dụng để thu nhận protein trị liệu: gà, thỏ, dê, cừu, bò… Tuy nhiên, phương pháp tồn hai rủi ro lớn cho người sử dụng: thứ truyền nhiễm bệnh từ động vật sang người (đặc biệt virus); thứ hai xuất protein lạ, bị biến đổi hệ cháu động vật biến đổi gen, thời gian điều hòa ban đầu gen hết - Cấy ghép: động vật chuyển gen nguồn cung cấp mô, quan cho dị ghép người Khó khăn sử dụng liệu pháp mối nguy truyền nhiễm virus từ động vật cho tương hợp sinh lí mảnh ghép thể nhận mảnh ghép Bên cạnh đó, chuyển gen động vật nhằm mục đích cấy ghép phải đương đầu với mối nguy lớn sức khỏe động vật, vấn đề trật tự gen loài hay lây nhiễm nguồn gen giới sống… 56 Bệnh nhân cần thay (tế bào, mô, quan) Thu nhận (tế bào, mô, quan) Chèn gen Immunoprotective người vào heo Chuyển vào người (tế bào, mô, quan) Hình 4.3 Điều trị liệu pháp cấy ghép - Ngoài ra, động vật biến đổi gen sử dụng cho mục đích khác sản xuất thịt, len, sữa, tơ nhện, kháng bệnh thú y, giảm ô nhiễm phosphor, tăng khả chống chịu động vật nuôi (cá, giáp xác…), tạo côn trùng kháng truyền bệnh… Bên cạnh nhiều lợi ích, động vật chuyển gen nói riêng, sinh vật chuyển gen nói chung, làm nảy sinh nhiều tranh cãi tính an toàn cho người tiêu dùng cho môi trường III CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GỐC Tế bào gốc tế bào chưa biệt hóa, có khả tự trẻ hóa lâu dài, biệt hóa thành loại tế bào chức khác… Tế bào gốc có nhiều ứng dụng: Gan Não Xương Tế bào gốc CNS Tủy xương Cơ xương Tế bào máu Mạch máu Tế bào tủy xương Tế bào biểu mô Tế bào mỡ Cơ tim Tế bào thần kinh Hình 4.4 Một số chứng tính mềm dẻo tế bào gốc trưởng thành - Cấy ghép tế bào, mô quan: mô, quan tạo từ tế bào gốc phôi người tiềm quan trọng Nhiều bệnh điều trị cấy ghép tế bào gốc phôi người ghi nhận gồm Parkinson, tiểu đường, chấn thương cột sống, suy thoái tế bào purkinje, loạn dưỡng Duchenne’s, tim, tạo xương… Các tế bào gốc phôi cấy ghép tồn tại, hợp có chức thể nhận Tuy nhiên, việc cấy ghép tế bào gốc phôi tiềm ẩn bất lợi xu hướng cảm ứng hình thành khối u (dù u lành tính người ta tránh hình thành khối u này) Tái thiết lập chương trình Tế bào thần kinh Chuyển nhân Cấy ghép °Ο °° ° Ο ° ° Ο ° Phát triển blastocyst in vitro Tế bào thần kinh Tế bào tim Tế bào máu Tế bào Ο ° Tế bào gốc thần kinh ° Tế bào gốc máu Thu nhận khuếch đại ES Hình 4.5 Chiến lược ghép tế bào gốc - Liệu pháp gen: sử dụng tế bào gốc biến đổi di truyền vector mang gen chuyển để đưa gen mong muốn vào thể Tổng hợp gen Tế bào mầm phôi Nhân Vector Tế bào sinh dưỡng Tb tụy Tb máu Tb da… Bệnh di truyền Bệnh ung thư Bệnh miễn dịch Tương hợp MHC Hình 4.6 Chiến lược dùng tế bào gốc liệu pháp gen - Kiểm nghiệm hóa chất: Các tế bào gốc tế bào bình thường di truyền, đồng quần thể nên nuôi cấy trì thời gian dài Vì vậy, việc ứng dụng tế bào gốc động vật có vú mở liệu pháp thử nghiệm dựa tế bào, thuận lợi sử dụng tế bào non, từ khối u lành tính hay tế bào biến đổi di truyền truyền thống 58 - Trong nghiên cứu: tế bào gốc phôi người cho phép nghiên cứu trình, thời điểm định hướng phương thức biệt hóa tế bào thành dòng thể Từ đó, giúp nhà nghiên cứu hiểu nguyên nhân nhiều bệnh tật để đưa đến hướng khắc phục đắn hợp lý Các tế bào gốc phôi cung cấp dạng tế bào mô cho nghiên cứu bệnh Hiện nay, người ta có xu hướng sử dụng tế bào gốc thu nhận từ tủy hay mô khác bệnh nhân để trị liệu, gọi myES (my stem cell) Các myES an toàn khó bị thải loại IV CHẨN ĐOÁN BỆNH Có ba phương pháp: - Chẩn đoán trực tiếp: quan sát phân biệt kính hiển vi, phương pháp ELISA, kỹ thuật phân tử dựa vào gen (PCR, LCR, NASBA, bDNA, Realtime PCR, lai phân tử, SSCP, RFLP ) để nhận diện tác nhân gây bệnh - Chẩn đoán gián tiếp: nuôi cấy tác nhân bệnh dựa chế miễn dịch (RIA, EIA, WB, RIBA, Line immuoassay…) để nhận diện tác nhân gây bệnh - Phương pháp huyết Những tiến y sinh học ngày giúp chẩn đoán phân tử có nhiều ưu điểm độ nhanh, nhạy xác V LIỆU PHÁP GEN Có nhiều phương pháp điều trị bệnh gây nên gen đột biến: - Ăn kiêng (đối với loại bệnh gây nên khiếm khuyết chế chuyển hóa) - Cấy ghép tủy xương hay quan để thay cho mô bị tổn thương - Thay gen hỏng gen lành (liệu pháp gen) Liệu pháp gen kỹ thuật sửa sai gen bị hỏng gây bệnh, bao gồm chiến lược sau: - Gen lành chèn vào vị trí thể để thay chức cho gen bệnh Hoặc gen lành thay gen bệnh thông qua tái tổ hợp IN VIVO Gen liệu pháp EX VIVO Tế bào bệnh nhân (thường tế bào gốc) Mô nhận Tiêm vào bệnh nhân Cấy tế bào vào bệnh nhân Đưa gen vào tế bào Tăng sinh tế bào biến đổi di truyền Hình 4.7 Sơ đồ chiến lược điều trị gen 59 - Gen bệnh sửa sai cách thông qua đột biến ngược chọn lọc (selected reverse mutation) thành gen lành - Điều hoà hoạt động gen đặc biệt - Liệu pháp antisen, liệu pháp RNAi, vaccine DNA VI VẬT LIỆU Y - SINH • Đóng vai trị thiết yếu việc thay cải thiện chức hệ thống thể • Năm 1952, hoạt chất sinh học nhân tạo dùng phẫu thuật tim mạch • Hơn 600000 đoạn mạch dẫn cấy ghép năm để thay mạch máu bị tổn thương • Phát triển màng sống có cố định thuốc tế bào ứng dụng trị liệu nuôi cấy tế bào Vật liệu sinh học ngày đóng vai trò thiết yếu việc thay cải thiện chức hệ thống thể (hệ xương, hệ tuần hoàn…) Một vài mảnh cấy ghép thông thường kể đến phận chỉnh hình (khớp gối, khớp háng, mảnh ghép tủy sống, vật cố định xương); mảnh ghép tim (van tim nút xoang nhĩ nhân tạo); mảnh ghép mềm (mảnh ghép ngực, collagene dùng bơm vào để tăng kích thước mô mềm); mảnh ghép nha khoa để thay răng, chân mô có xương khoang miệng… Những hoạt chất sinh học nhân tạo dùng phẫu thuật tim mạch vào năm 1952, mảnh ghép Hufnagel van tim nhân tạo thành công, Voorleses người giới thiệu mảnh ghép tim nhân tạo Hiện nay, năm có 600.000 đoạn mạch dẫn cấy ghép để thay mạch máu bị tổn thương bệnh nhân Ngoài vật liệu có chức vật lý, thời gian gần đây, CNSH phát triển hàng loạt vật liệu có tính chất sinh hóa, màng sống có cố định thuốc tế bào, nhằm ứng dụng trị liệu phát triển công nghệ tế bào động vật… 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO Hoàng Kim Giao, 2003 Công nghệ cấy truyền phôi gia súc, NXB Khoa học Kỹ thuật Nguyễn Đình Giậu, Nguyễn Chi Mai, Trần Thị Việt Hồng, 1999 Sinh lí học người động vật NXB Đại học Khoa học Tự nhiên Phan Kim Ngọc, Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2000 Sinh học sinh sản NXB Giáo dục Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, 2007 Công nghệ sinh học người động vật NXB Giáo dục 61 [...]... 2 CÔNG NGHỆ HỖ TRỢ SINH SẢN I GIỚI THIỆU Khái niệm: Hỗ trợ sinh sản là một quy trình nhằm tạo ra cá thể mới với nhiều kỹ thuật hỗ trợ phù hợp cho từng giai đoạn trong tiến trình sinh sản Công nghệ này không chỉ là một liệu pháp điều trị vô sinh/ hiếm muộn ở người mà còn là phương tiện hữu ích, nền tảng để tiến hành các nghiên cứu khác ở người và động vật như chuyển gen, chẩn đoán sớm, bảo tồn động vật, ... (-1800C) thường giảm sức sống VII ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT - Nuôi cấy tế bào động vật để làm mô hình thử nghiệm và chẩn đoán bệnh - Sản xuất các hợp chất sinh học như interferon, vaccine virus, các protein (các nhân tố đông máu và hoạt hóa plasminogene…), enzyme (Rtase…)… - Tạo nguồn mô – tế bào động vật làm vật liệu cấy ghép: ghép tế bào tụy tạng tạo ra insulin của heo vào người,... trừ chemostat VI MỘT SỐ KỸ THUẬT LIÊN QUAN VI.1 KỸ THUẬT VÔ TRÙNG Kỹ thuật vô trùng được thiết lập để diệt (lập hàng rào vô trùng) một phổ rộng các vi sinh vật (động vật nguyên sinh, nấm, vi khuẩn, mycoplasma, virus ) Tùy theo từng đối tượng vi sinh vật, đặc biệt là khả năng để kháng của chúng, để có phương pháp khử trùng đạt hiểu quả tối đa Các phương pháp khử trùng thường được dùng là: - Sử dụng... nồng độ CO2 tương ứng 11 III MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào động vật phức tạp hơn rất nhiều so với môi trường nuôi cấy vi sinh hay tế bào thực vật, thường chứa các thành phần không xác định Do thành phần phức tạp, khó ổn định nên người ta quan tâm dần đến nghiên cứu, tạo các môi trường tổng hợp để có thể chủ động bảo quản, sử dụng, điều chỉnh và ổn định thành... cho quá trình phát triển mạch này, các tế bào ở sâu bên trong có thể chết khi mạch phát triển tới nơi V.3 NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT TRONG BÌNH KHUẤY Hầu hết việc nuôi cấy mô tiến hành trên quy mô nhỏ, cung cấp một lượng ít tế bào để tiến hành các thí nghiệm Việc nuôi tế bào động vật với quy mô lớn được bắt đầu thử nghiệm từ đầu những năm 1950 bằng cách dùng Jar Fermentor Khi nuôi cấy tế bào động vật ở... mô lớn, cần chú ý một số đặc điểm không có lợi cho nuôi cấy quy mô lớn sau: - Tế bào động vật khá lớn, khoảng 10 µm Tính bền cơ học đối với sự khuấy yếu - Thời gian tăng sinh gấp đôi chậm, khoảng 1 ngày Nhạy cảm với ion kim loại - Kém khả năng thích ứng với môi trường Cần huyết thanh và hormone - Đa số tế bào động vật cần sống và phân chia trên một giá đỡ Khi tăng lượng tế bào nuôi cấy, cần phải điều... quan trọng và được lưu ý đặc biệt trong nuôi cấy tế bào động vật Virus và các vi sinh vật ngoại nhiễm là những nguy cơ lớn, có thể làm chết tế bào nuôi cấy Tùy theo tính chất hóa học của các thành phần môi trường để chọn cách khử trùng thích hợp, có thể là hấp ướt hoặc lọc vô trùng bằng milipore IV KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO IV.1 NUÔI CẤY SƠ CẤP Quy trình nuôi sơ cấp gồm: THU NHẬN MẪU MÔ Cắt nhỏ (Chọn lọc... dùng của các hormone nói trên tùy thuộc vào từng loài, tuổi và trọng lượng con vật; cũng như phụ thuộc vào loại thuốc, thời gian tiêm Ở một số loài như chuột, hiệu quả kích thích rụng trứng còn phụ thuộc vào chu kỳ sáng tối 27 Bảng 2.1 Quy trình gây siêu bài noãn ở một số vật nuôi (E Hafez, 1987) Động vật Ngày của chu kỳ động dục Hormone phát triển trứng PMSG (IU) FSH (mg) Hormone rụng trứng hCG (IU)... số hạn chế, đó là: - Không thể thiết lập một gradient 3D “đúng” trong nuôi cấy 2D – điều này có ảnh hưởng nhất định đến sự biệt hóa sinh học, quyết định số phận của tế bào, sự phát triển cơ quan, truyền tín hiệu, truyền thông tin thần kinh và vô số các quá trình sinh học khác - Tế bào được phân lập trực tiếp từ cơ thể thường xuyên thay đổi sự chuyển hóa và các kiểu biểu hiện gen hi được nuôi cấy 2D... một số những dịch chiết sinh học phức tạp (sữa, dịch chiết phôi, huyết tương ), các nhân tố tăng trưởng, hormone cũng thường được bổ sung vào môi trường 14 III.4 Kỹ thuật pha môi trường - Thành phần môi trường: khác nhau tùy vào loại sử dụng Khi pha môi trường cần phải đảm bảo cung cấp đầy đủ các thành phần theo đúng công thức - Điều kiện nuôi cấy: thông thường các tế bào động vật phát triển tốt nhất ... NGH H TR SINH SN I GII THIU Khỏi nim: H tr sinh sn l mt quy trỡnh nhm to cỏ th mi vi nhiu k thut h tr phự hp cho tng giai on tin trỡnh sinh sn Cụng ngh ny khụng ch l mt liu phỏp iu tr vụ sinh/ him... vo cỏ th nhn, phụi sng v phỏt trin bỡnh thng trờn c s trng thỏi sinh lý, sinh dc ca c th nhn phụi phự hp vi trng thỏi sinh lý, sinh dc ca c th cho phụi hoc/ v phự hp vi tui phụi (gi s phự hp... nh to cỏc t bo bin i di truyn, nghiờn cu s chuyn húa v sinh lý t bo, thu nhn v to dũng in vitro cỏc dũng t bo bỡnh thng (t bo sinh dng, sinh dc), v bt thng (t bo ung th) ca ngi, cng nh ca nhiu