CHƯƠNG 2 CÔNG NGHỆ HỖ TRỢ SINH SẢN
II. KỸ THUẬT CHUẨN BỊ GIAO TỬ
II.2. CHUẨN BỊ TINH TRÙNG
Ở động vật, tinh trùng sử dụng trong thụ tinh in vitro có thể được khai thác từ tinh hoàn, phó tinh hoàn thông qua con đường phóng tinh hay thu nhận từ phẫu thuật trực tiếp.
Một số phương pháp thường dùng để lấy tinh từ động vật:
- Sử dụng dòng điện nhẹ để kích thích.
- Dùng tay xoa tuyến sinh dục qua trực tràng.
- Dùng âm đạo giả.
- Dùng tay.
Trong đó phổ biến nhất là dùng âm đạo giả và dùng tay.
Ở người, trong trường hợp tinh trùng bình thường, việc thu nhận được tiến hành bằng cách dùng tay kích thích phóng tinh.
II.2.2. Đánh giá tinh dịch và tinh trùng
Đo thể tích tinh dịch thu được bằng syringe hay các pipette chia vạch, sau đó sử dụng phòng đếm hồng cầu (haemocytometer) để đánh giá mật độ tinh trùng, độ di động của tinh trùng cũng như các kiểu di động của tinh trùng. Qua đó, lựa chọn phương pháp thích hợp để chuẩn bị mẫu cho các kỹ thuật hỗ trợ.
Thao tác dưới kính hiển vi ở độ phóng đại x20. Khi đếm cần lưu ý: (1) sự hiện diện của các mảnh vỡ tế bào và những tế bào khác ngoài các tế bào tinh trùng (tế bào hồng cầu, bạch cầu), (2) sự ngưng kết của các tế bào tinh trùng và kiểu ngưng kết.
Hầu hết mẫu tinh bình thường đều có khả năng thụ tinh. Không sử dụng các mẫu chứa lượng tinh trùng bất thường (hình dạng) cao bởi tiềm năng thụ tinh của chúng kém.
Ngoài ra, những hư hỏng trên NST của tinh trùng cũng có thể được phát hiện bằng phương pháp nhuộm chromomycin (CMA3) và nhuộm aniline blue (AAB)
Hình 2.2. Một số dạng tinh trùng bất thường ở người
(1: Quá to, 2: Quá nhỏ, 3: Nhiều đầu, 4: Nhiều đuôi, 5: Dị dạng, 6: Đuôi gẫy, 7: Thân dài) II.2.3. Chuẩn bị tinh trùng cho kỹ thuật thụ tinh
Các phương pháp hỗ trợ thụ tinh, quy trình chuẩn bị tinh trùng cơ bản giống nhau, trừ trường hợp thụ tinh vi thao tác.
Tinh trùng được thu nhận bằng cách nào đi nữa cũng không có khả năng xâm nhập vào tế bào trứng nếu không được hoạt hóa. Trong sự giao phối tự nhiên, tinh trùng được hoạt hóa trong ống sinh dục của con cái.
Trong sự giao phối tự nhiên, tinh dịch có chức năng trung hòa và bảo vệ tinh trùng khỏi môi trường acid của âm đạo, đồng thời có một phần chức năng ổn định và nuôi dưỡng tinh trùng. Tuy nhiên, tinh dịch cũng có thể ảnh hưởng xấu đến tinh trùng sau khi phóng tinh vào âm như làm giảm sức sống, giảm độ di động và thậm chí làm giảm khả năng thụ tinh của tinh trùng. Do đó, việc tách tinh trùng khỏi tinh dịch để sử dụng vào mục đích điều trị là cần thiết.
Sự lựa chọn phương pháp chuẩn bị tinh trùng (trong thực tế có thể phải kết hợp giữa nhiều phương pháp với nhau) phụ thuộc vào sự đánh giá về số lượng tế bào tinh trùng di động, tỷ lệ giữa số lượng tinh trùng di động so với không di động, thể tích tinh dịch, sự hiện diện của các kháng thể, sự ngưng kết hay mảnh vỡ.
* Thu nhận tinh trùng
Hình 2.3. Kỹ thuật Swim up
Bình thường (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7)
Ủ ở 37–390C 30– 60 phút
Tinh trùng chết/ bất động
Tinh trùng di động tốt
32 Phương pháp swim up chuẩn: thường được dùng với các mẫu tinh trùng có số lượng cao (106 tinh trùng di động/ml) với khả năng di động tiến tốt. Nguyên tắc của phương pháp này là những tinh trùng di động tốt sẽ tự bơi lên trên, thoát khỏi lớp tinh dịch phía dưới.
Ly tâm với gradient nồng độ không liên tục: được sử dụng cho các mẫu có một số biểu hiện về độ di động thấp, khả năng di động tiến kém, lượng mảnh vỡ và (hay) số lượng tế bào khác còn nhiều, có chứa nồng độ cao các kháng thể kháng tinh trùng…
Hình 2.4. Kỹ thuật ly tâm với thang nồng độ Percoll
Phương pháp lắng hay đặt trên paraffin lỏng: thường được sử dụng với mẫu có số lượng tinh trùng thấp và độ di động kém. Phương pháp này giúp tách các mảnh vỡ tế bào hiệu quả nhưng lại tốn thời gian chuẩn bị (vài giờ).
Hình 2.5. Kỹ thuật tạo giọt lắng sau ly tâm
Ly tâm tốc độ cao và rửa: sử dụng cho những mẫu quá ít tinh trùng, mẫu có thể pha loãng hoặc không pha loãng.
Sự di chuyển – lắng (migration-sendimantation): đây là một sự cải biến kỹ thuật swim-up kết hợp với một bước lắng. Đây là một kỹ thuật nhẹ nhàng nhưng hiệu suất rất thấp đối với tinh trùng kém di động nên không được dùng rộng rãi trong IVF
Gần đây Zavos và cs. đã đề nghị sử dụng ống tube nhiều ngăn (multi-chamber tube) để thu nhận các tinh trùng nhằm sử dụng cho các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản bằng phương pháp swim-up và lắng. So sánh với ly tâm theo gradient nồng độ, kỹ thuật này cho thấy một kết quả tốt hơn đối với tính di động, hình thái tinh trùng bình thường, sự đóng xoắn NST và cuối cùng, tỷ lệ các tinh trùng chết trong quá trình xử lý cũng giảm.
Percoll 90%
Percoll 45%
Tinh dịch
Ly tâm
Tinh trùng di động Tinh trùng bất động Tinh dịch
Đĩa Petri Dầu paraffin
Huyền phù tinh trùng tạo giọt tròn
Các mảnh vỡ và tế bào khác lắng xuống Tinh trùng di động
33 Còn nhiều biện pháp thu nhận tinh trùng khác, chẳng hạn dùng các hạt thủy tinh (glass beads), lọc bằng khối sợi thủy tinh (Glass wool filtration), cột Sephadex, tạo sự di chuyển xuyên qua màng của dòng tinh trùng (Transmembrance migration). Tuy nhiên, các phương pháp này phức tạp nên ít được sử dụng.
* Kích hoạt tinh trùng
Các chất kích thích thường được sử dụng là pentoxifylline và 2-Deoxuadenosine, chúng làm gia tăng cơ chế hoạt hóa ATP nội bào, kích thích độ di động của các tinh trùng yếu trong mẫu, làm tăng tỉ lệ thụ tinh và mang thai đối với các mẫu tinh dịch không tốt
* Lợi ích của việc chuẩn bị tinh trùng:
Việc chọn được các tinh trùng bình thường, di động tốt, đồng thời cô đặc chúng trong một thể tích nhỏ sẽ tạo nhiều thuận lợi cho các phương pháp điều trị:
- Loại được các tế bào chết, hầu hết các vi sinh vật và phần lớn các chất độc.
- Loại được phần lớn prostaglandins có trong tinh dịch, tránh sự co thắt tử cung trong phương pháp IUI.
- Kích thích sự hoạt hóa đầu tinh trùng, tạo thuận lợi cho quá trình thụ tinh.
- Giảm phần lớn các nguy cơ nhiễm khuẩn từ tinh dịch, bởi các phương pháp chuẩn bị tinh trùng hiện nay có thể phát hiện và loại được hầu hết vi sinh vật có trong tinh dịch.
- Tránh nguy cơ sốc phản vệ (đôi khi xảy ra) khi cho tinh dịch vào buồng tử cung.
- Giảm được nguy cơ tạo kháng thể kháng tinh trùng ở người vợ khi cho quá nhiều tinh trùng chết vào buồng tử cung.
Chuẩn bị tinh trùng cho các kỹ thuật vi thụ tinh có một số khác biệt điển hình. Để chuẩn bị cho ICSI, phải kết hợp nhiều phương pháp, đặc biệt với các mẫu tinh dịch quá ít tinh trùng, không thể chuẩn bị bằng cách ly tâm hay các kỹ thuật swim-up thông thường.