Công nghệ sinh học động vật:

Công nghệ sinh học động vật: bước công nghệ chuyển gen động vật: Công nghệ tạo động vật chuyển gen trình phức tạp lồi khác khác nhiều nội dung gồm bước sau: - Tách chiết, phân lập gen mong muốn tạo tổ hợp gen biểu tế bào động vật; tạo sở vật liệu biến nạp gen; - Biến nạp gen vào phôi động vật; nuôi cấy phôi cấy truyền hợp tử (đối với động vật bậc cao); - Phân tích đánh giá tính ổn định biểu gen lạ tạo dòng động vật chuyển gen gốc cách liên tục, sản xuất động vật chuyển gen Ứng dụng động vật chuyển gen đời sống thực tiễn y học : - Tạo động vật có tốc độ lớn nhanh, hiệu sử dụng thức ăn cao Đưa tổ hợp bao gồm gen cấu trúc hormone sinh trưởng promoter methallothionein vào động vật Cho đến người ta đưa thành công gen vào thỏ, lợn cừu Lợn chuyển gen hormone sinh trưởng lượng mỡ giảm đáng kể (giảm từ 28,55mm xuống 0,7mm) hiệu sử dụng thức ăn cao Tuy nhiên động vật nuôi chuyển gen hormone sinh trưởng có biểu bệnh lý lớn cỡ chưa có ý nghĩa lớn thực tiễn - Tạo động vật chống chịu bệnh tật thay đổi điều kiện môi trường Biết số gen có khả kháng bệnh chống chịu thay đổi điều kiện môi trường vật nuôi Tiêm gen Mx vào lợn để tạo giống lợn miễn dịch với bệnh cúm Chuyển gen chống lạnh AFP (antifreeze protein) tạo giống cá có khả bảo vệ thể chống lại lạnh giá (cá hồi, cá vàng ) - Nâng cao suất, chất lượng động vật cách thay đổi đường chuyển hóa thể động vật nghiên cứu nâng cao chất lượng sữa bò, sữa cừu cách chuyển gen lactose vào đối tượng quan tâm Sự biểu gen điều khiển promoter tuyến sữa Trong sữa động vật chuyển gen này, đường lactose bị thủy phân thành đường galactose đường glucose - Tạo động vật chuyển gen làm mơ hình nghiên cứu bệnh người Nhiều dòng chuột chuyển gen tạo mơ hình nghiên cứu bệnh tâm thần, tim mạch, phổi, ung thư, viêm nhiễm miễn dịch để nghiên cứu chế rối loạn chuyển hoá, sinh sản phát triển sớm người - Thử nghiệm chất gây ung thư Ba dòng chuột chuyển gen khác tạo cho việc thử nghiệm chất gây ung thư: Chuột chuyển gen Eμ-pim-1 mang gen ung thư hoạt hố pim-1 (gen có tốc độ gây khối u tự phát thấp xuất nhạy với chất gây ung thư) Chuột chuyển gen mang gen ung thư hoạt hoá (v-H-ras, c-Hras) gen ức chế khối u bất hoạt (p53) Chuột chuyển gen với gen sửa đổi DNA bất hoạt (XPA) - Tạo động vật chuyển gen làm mơ hình nghiên cứu chất độc học - Thử nghiệm chất gây đột biến, chất gây ung thư - Tạo vật nuôi chuyển gen cung cấp nội quan cấy ghép cho người Các điều kiện lý hóa ảnh hưởng đến kỹ thuật ni cấy mơ – tế bào động vật : Nhiệt độ Tế bào lồi động vật khác có nhiệt độ ni cấy thích hợp khác VD: tế bào động vật có vú người phát triển tốt 37 ± 1°C, nhiệt độ tế bào lồi chim phát triển tốt 38,5°C, tế bào lồi trùng phát triển tốt nhiệt độ 25 ± 2°C Một số dòng tế bào phát triển nhiệt độ thấp thân nhiệt bình thường thể, VD: tế bào biểu mô, tế bào tinh trùng Trong nuôi cấy in vitro, tế bào động vật không chịu nhiệt độ cao 2°C so với nhiệt độ phát triển thích hợp chúng, tế bào lại có khả chịu đựng nhiệt độ thấp hơnnhiệt độ phát triển tối ưu chúng mà ảnh hưởng đến phát triển chúng sau 2 pH pH không quan trọng việc trì cân ion thích hợp mà trì chức tối ưu enzyme nội bào, gắn kết hormone nhân tố tăng trưởnglên receptor bề mặt Sự biến đổi pH làm thay đổi chuyển hóa tế bào, dẫn tới cảm ứng sản xuất protein shock nhiệt, trình dẫn đến chết tế bào (apoptosis) Do vậy, kiểm soát pH cần thiết để tối ưu hóa điều kiện ni cấy pH tối ưu cho phát triển tế bào ni cấy khác tùy theo lồi tùy theo dòng tế bào Hầu hết tế bào sống mơi trường có ngưỡng pH 6,5 – 7,8 nên mơi trường nuôi cấy thường điều chỉnh pH 7,0 – 7,4 (trung bình 7,2) Một số dòng tế bào thích hợp với pH caohơn (VD: tế bào fibroblast người thích hợp với pH 7,4 – 7,7) hay thấp (VD: tế bào côn trùng phát triển tốt pH 6,2±0,1) Mơi trường có pH ổn định thay đổi giúp tế bào sống tốt Hầu hết môi trường thương mại chứa phenol red chất thị pH Môi trường chuyển màu vàng cho biết pH giảm (acid) màu hồng pH tăng (kiềm) Áp suất thẩm thấu Áp suất thẩm thấu mơi trường xác định công thức môi trường Muối glucose hai tác nhân hình thành nên áp suất thẩm thấu, amino acid quan trọng Thay đổi áp suất thẩm thấu tế bào tác động lên tăng trưởng chức tế bào Nếu tế bào nằm mơi trường có áp suất khơng thích hợp, chúng biến dạng: tế bào co lại mơi trường có áp suất thẩm thấu q cao, mơi trường có áp suất q thấp,chúng căng phồng lên Để kiểm tra áp suất thẩm thấu môi trường, thường sử dụng Osmom kế (Osmometer) Các môi trường thương mại thiết kế để áp suất thẩm thấu 300 mOsm (tế bào phát triểntrong khoảng 290 - 310 mOsm) Có thể điều chỉnh áp suất thẩm thấu cách thêm NaCl, 0,0292 g/lít NaCl làm tăng1 mOsm (sử dụng 5M NaCl với 1ml/lít làm tăng áp suất thẩm thấu lên 10 mM) Chú ý mơi trường có thành phần đường, ion, amino acid…chúng đóng góp vào tạo áp suất thẩm thấu Các loại khí Ba loại khí cần quan tâm: CO2, O2 N2 Tỷ lệ chúng phối trộn thích hợp theo chương trình thiết kế sẵn tủ ni, nhờ phân áp khí tạo thích ứng với đặc điểm sinh lý tế bào mơ sống O2 có vai trò quan trọng sinh trưởng, tăng sinh biệt hóa tế bào Nồng độ O2 phổ biến dùng tủ nuôi tế bào thường từ 16 – 20% Tác động CO2 lên nuôi cấy tế bào khó xác định cách xác, liên quan đến hàm lượng CO2 hòa tan, pH, nồng độ HCO3 Thành phần môi trường nuôi cấy mô – tế bào động vật: Thành phần môi trường a Muối vô Các muối vơ mơi trường giữ vai trò quan trọng phát triển tế bào in vitro, như: cân áp suất thẩm thấu, trì chế vận chuyển chất qua màng, giúp điều hòa điện màng, bám gắn tế bào, hoạt động cofactor b Hệ đệm Hệ đệm có vai trò điều hòa pH mơi trường ni cấy Hầu hết môi trường sử dụng hệ đệm bicarbonate với CO2 thành phần Ngồi ra, có hệ thống đệm phosphat đệm hữu phức tạp khác Cũng sử dụng hệ đệm hữu hay huyết môi trường Sử dụng hệ đệm bicarbonate/CO2 cần trì khơng khí với 5–10% CO2 tủ Bicarbonate, CO2 rẻ, không độc tế bào nên dùng phổ biến Hệ đệm hữu sử dụng nhiều HEPES (N-2hydroxyethylpiperazine-N-2ethane sulfonic acid) Các hệ đệm hữu không nhạy cảm với CO2, chúng cung cấp hệ thống tốt để tế bào chuyển hóa mạnh (sản xuất nhiều CO2) ổn định pH Một số dung dịch đệm Tris [Tris (hydroxymethyl) aminomethane] thường sử dụng sinh hóa gây độc tế bào in vitro c Carbohydrate Đường môi trường nguồn cung cấp C lượng cho phát triển tế bào invitro Các đường sử dụng glucose galactose, số mơi trường sử dụng maltose hay fructose Nồng độ đường khác môi trường từ 1g/l– 4,5g/l Môi trường chứa nồng độ đường cao giúp phát triển nhiều kiểu tế bào d Vitamine Vitamine chất cho nhiều cofactor, chúng có nhiều thành phần huyết Tuynhiên, nhiều loại môi trường cần bổ sung vitamine thích hợp vitamine nhóm B cần thiết cho phát triển tế bào Thông thường vitamine sử dụng môi trường riboflavin, thiamine biotin e Các protein peptide Các thành phần giữ vai trò quan trọng ni cấy hầu hết tế bào, đặc biệt nuôi cấy với môi trường không huyết Một số protein, peptide cần thiết albumin, transferring, fibronectin fetuin thường có sẵn huyết f Acid béo lipid Giống với protein peptide, chất cần thiết môi trường nuôi không huyết cho số tế bào đặc biệt Chúng diện huyết với dạng cholesterol steroid g Yếu tố vi lượng Bao gồm kẽm, đồng, selenium… tricarboxylic acid trung gian, selenium chất giúp tách gốc oxy tự h Huyết Trong hầu hết loại môi trường nuôi cấy tế bào động vật có mặt huyết có vai trò quan trọng sau: - Cung cấp chất dinh dưỡng quan trọng cho tế bào amino acid thiết yếu, tiền chấtcủa nucleic acid, nguyên tố vi lượng… - Cung cấp nhân tố tăng trưởng, kích thích cho tế bào tăng trưởng phân chia - Kích thích phục hồi tổn thương tế bào cấy chuyền, protein huyết làm bất hoạt trypsin, tránh enzym gây tổn thương tế bào - Cải thiện tính tan chất dinh dưỡng - Chống oxy hóa: huyết kháng oxy hóa mạnh, ức chế độc tính oxy - Cải thiện tính dính tế bào lên bề mặt bình ni nhờ yếu tố làm tăng độ dính tếbào lên giá đỡ Huyết cần cho việc nuôi cấy tế bào động vật Tuy nhiên, bên cạnh tác động tốt nêu trên, huyết có tác động khơng tốt: - Nuôi cấy tế bào với môi trường bổ sung huyết chi phí cao - Huyết dễ bị nhiễm virus, mycoplasm khó ổn định chất lượng lơ mơi trường khác nhau.- Huyết chứa thành phần gây ức chế phân bào cảm ứng phân hóa - Nhiều chất huyết (vitamin C, lipoprotein ) thường không ổn định đông lạnh hay bảo quản lâu - Huyết khơng pha lỗng độc với nhiều loại tế bào - Khi nồng độ hormone thích hợp, huyết chứa chất ức chế phát triển, biệt hóa hay chức Ưu điểm hạn chế kỹ thuật nuôi cấy mô – tế bào động vật: Ưu điểm - Hệ thống tế bào động vật “nhà máy tế bào” thích hợp cho việc sản xuất phân tử phức tạp kháng thể dùng làm thuốc phòng bệnh, điều trị chẩn đoán: enzyme, hormone, vaccine, kháng thể đơn dòng, thuốc trừ sâu sinh học, interferon interleukin, tế bào nguyên vẹn để thử nghiệm chất độc hóa học… - Các tế bào động vật có trình biến đổi hậu dịch mã xác (post translational modifications) sản phẩm protein sinh-dược (biopharmaceutical protein) phân giải protein, liên kết tiểu đơn vị (subunit), nhiều phản ứng kết hợp khác glycosylation, methylation, carboxylation, amidation, hình thành cầu nối disulfide phoshorylation gốc amino acid - Sản xuất viral vector dùng liệu pháp gen nhằm chữa trị nhiều bệnh ung thư,HIV, viêm khớp, bệnh tim mạch xơ hóa u nang - Sản xuất tế bào động vật để dùng chất in vitro nghiên cứu chất độc học dược học - Phát triển công nghệ mô phát sinh quan để sản xuất quan thay nhân tạo sinh học hay dụng cụ trợ giúp, như: da nhân tạo để chữa bỏng, mô gan để chữa viêm gan, … Hạn chế - Tế bào động vật có kích thước lớn cấu trúc phức tạp tế bào vi sinh vật - Tốc độ sinh trưởng tế bào động vật chậm so với tế bào vi sinh vật - Các tế bào động vật bao bọc màng huyết tương, mỏng nhiều so với thành tế bào dày thường thấy vi sinh vật tế bào thực vật, kết chúng dễ bị vỡ - Nhu cầu dinh dưỡng tế bào động vật chưa xác định cách đầy đủ, môi trường nuôi cấy thường đòi hỏi bổ sung huyết máu đắt tiền - Tế bào động vật phần mơ tổ chức (phân hóa) thể đơn vào riêng biệt vi sinh vật - Hầu hết tế bào động vật sinh trưởng gắn bề mặt Tế bào gốc gì? Nguồn gốc, phân loại tế bào gốc Tế bào gốc tế bào có khả biệt hoá thành nhiều loại tế bào khác để thay cho tế bào bị già chết tự nhiên hay chấn thương nhiều nguyên nhân khác Nguồn gốc: – Tế bào gốc phôi lấy trực tiếp từ phôi thai giai đoạn phôi bào tức hợp tử sau 6-7 ngày thụ tinh – Tế bào gốc thai lấy từ tế bào gốc đa mô bào thai bị hủy phá thai – Tế bào gốc dây rốn lấy từ màng dây rốn máu dây rốn thai nhi sau sinh – Tế bào gốc từ người trưởng thành lấy từ mô người trưởng thành (tủy xương, máu ngoại vi…) Phân loại tế bào gốc Theo đặc tính hay mức độ biệt hóa - Tồn (hay thuỷ tổ) Tế bào gốc toàn hay tế bào gốc thủy tổ (totipotent stem cells) Là tế bào có khả biệt hóa thành tất loại tế bào thể từ tế bào ban đầu Trứng thụ tinh tế bào sinh từ lần phân chia tế bào trứng thụ tinh (giai đoạn - tế bào – blastosomer) - Vạn Tế bào gốc vạn (pluripotent stem cells) Là tế bào có khả biệt hóa thành tất tế bào thể có nguồn gốc từ ba mầm phôi – trong, ngồi Các tế bào gốc vạn khơng thể phát triển thành thai, không tạo nên thể sinh vật hồn chỉnh mà tạo nên tế bào, mô định - Đa Tế bào gốc đa (multipotent stem cells) Là tế bào có khả biệt hóa thành nhiều loại tế bào thể từ tế bào ban đầu Các tế bào gốc trưởng thành tế bào gốc tạo máu, tế bào gốc thần kinh có tính đa năng; điều kiện định, chúng chuyển biệt hóa trở nên có tính vạn - Đơn Tế bào gốc đơn (mono/unipotential progenitor cells) Tế bào gốc đơn tế bào gốc có khả biệt hóa theo dòng Khả biệt hóa theo dòng cho phép trì trạng thái sẵn sàng tự tái tạo mô, thay tế bào mô chết già cỗi tế bào mơ Vẽ sơ đồ tạo động vật chuyển gen giải thích Cơng nghệ tạo động vật chuyển gen q trình phức tạp lồi khác khác nhiều nội dung gồm bước sau: - Tách chiết, phân lập gen mong muốn tạo tổ hợp gen biểu tế bào động vật; tạo sở vật liệu biến nạp gen + Tách chiết, phân lập gen mong muốn Các cơng cụ sử dụng để tạo dòng bao gồm:  Các enzyme đặc biệt có hoạt tính cắt nối DNA (enzyme hạn chế ligase),  Các mẫu dò (probe), vector  Tế bào vật chủ Tế bào vật chủ thường sử dụng tế bào vi khuẩn E.coli vector thường sử dụng plasmid  Gen chuyển có nguồn gốc từ genome  Từ mRNA  Từ sản phẩm protein thiết kế cặp mồi (primer) để dò tìm đoạn gen mong muốn + Tạo tổ hợp gen chuyển biểu tế bào động vật Ðể tạo tổ hợp gen chuyển biểu tế bào động vật, vùng chức khác gen có nguồn gốc từ lồi khác kết hợp lại với ống nghiệm cách sử dụng enzyme hạn chế ligase Tất thành phần gen tách chiết tái tổ hợp để tạo thành cấu trúc gen chuyển biểu Promoter: yếu tố điều hoà gần đầu 5’ gen, có vai trò định việc điều hoà biểu gen Promoter tế bào động vật có nguồn gốc từ động vật methallothionein (MT), thymidine kinase, ßactin, amylase, insulin, ßlactoglobulin, adiposite P2 từ virus động vật Simian virus (SV40), Rous sarcoma virus (RSV) Một yếu tố điều hoà khác yếu tố tăng cường (enhancer), có chức tăng cường biểu gen, không phụ thuộc vào vị trí định hướng gen Ðầu 3’ gen phải mang trình tự poly-A để đảm bảo thích hợp cho q trình phiên mã dịch mã + Tạo sở vật liệu biến nạp gen Giai đoạn biến nạp gen thích hợp trứng giai đoạn tiền nhân (pronucleus), giai đoạn mà nhân tinh trùng trứng chưa dung hợp (fusion) với Ở giai đoạn tổ hợp gen lạ có hội xâm nhập vào genome động vật nhờ tái tổ hợp DNA tinh trùng trứng Tế bào phôi chưa phân chia phân hoá nên tổ hợp gen lạ biến nạp vào giai đoạn có mặt tất tế bào kể tế bào sinh sản động vật Trứng chín thu nhận phương pháp sử dụng kích dục tố theo chương trình Sau thụ tinh nhân tạo để tạo trứng tiền nhân - Biến nạp gen vào phôi động vật; nuôi cấy phôi cấy truyền hợp tử (đối với động vật bậc cao) - Phân tích đánh giá tính ổn định biểu gen lạ tạo dòng động vật chuyển gen gốc cách liên tục, sản xuất động vật chuyển gen Kiểm tra kết chuyển gen  Để kiểm tra xem gen lạ có xâm nhập vào máy di truyền động vật trưởng thành hay không → Sử dụng phương pháp lai phân tử pha rắn (Southern blot, Northern blot ) PCR  Để kiểm tra xem sản phẩm gen lạ có tổng hợp hay không → đánh giá hai mức độ: phiên mã dịch mã  Sản phẩm phiên mã đánh giá phương pháp RT-PCR  Sản phẩm dịch mã đánh giá phương pháp Western blot, ELISA kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA) để phát protein lạ động vật  Theo dõi hệ sau động vật chuyển gen (F1, F2, F3 ) để xác định gen lạ có di truyền hay khơng Tạo dòng động vật chuyển gen Sau kiểm tra thấy gen ngoại lai di truyền ổn định, tiến hành lai tạo chọn lọc để tạo dòng động vật chuyển gen quy trình đơng lạnh tế bào (môi trường, chất bảo quản, bước bảo quản lạnh, phương pháp đông lạnh Kỹ thuật bảo quản phôi hay giao tử bảo quản lạnh phôi hay giao tử thời gian dài thấp nhiệt độ -196°C với nitơ lỏng, ngăn chặn trình trao đổi chất tế bào Mơi trường đơng lạnh • Hepes • Huyết • Kháng sinh • Muối • Đường • Chất bảo quản lạnh Chất bảo quản đơng lạnh Chất bảo quản ngoại bào: BSA, FBS, saccharide, disaccharide (trehalose, lac, suc), trisaccharide (raffinose), polymer (PVP, polyethylenglycol) Chất bảo quản nội bào: methanol, ethanol, ethylen glycol, 1,2isopropandiol, glycerol, dimethyl sulfoxide (DMSO) Nguyên tắc chung: nhiệt độ cục thấp (-196°C) nitơ lỏng làm ngưng hoàn toàn phản ứng enzyme nội bào, hô hấp tế bào, chuyển hóa, phát triển … giúp lưu giữ chúng thời gian dài Các phân tử nước tồn dạng kết hợp, tinh thể dạng kính Các bước đơng lạnh tế bào: • Tế bào mơ tiếp xúc với chất bảo quản (bước cân bằng) • Làm lạnh mẫu xuống nhiệt độ âm • Trữ nhiệt độ -196°C • Làm ấm giải đơng • Pha loãng loại bỏ chất bảo quản lạnh trước tái ni cấy Phương pháp đơng lạnh • Đơng lạnh chậm • Đơng lạnh nhanh • Phối hợp đơng lạnh nhanh chậm • Đơng lạnh cực nhanh (thủy tinh hóa) Giải đơng lạnh-quy trình đánh giá tế bào sau giải đơng) • Rã đơng nhanh - 37°C bể ổn nhiệt - Giảm thiểu hình thành tinh thể • Pha lỗng từ từ để ngăn sốc áp suất thẩm thấu • Q trình bù nước tế bào • Loại chất bảo quản lạnh: - Thay, ủ môi trường - Ly tâm nhẹ Quy trình giải đơng • Lấy ống đơng lạnh tế bào khỏi bình nitơ lỏng • Kiểm tra cẩn thận nhãn nắp • Giữ ống đơng lạnh ngồi khơng khí khoảng 30 giây • Đặt tồn ống đơng lạnh nhúng vào bình ổn nhiệt 37°C lắc nhẹ tan hết • Rửa tế bào ly tâm dịch tế bào giải đơng mơi trường ni • Tái huyền phù tế bào mơi trường • Trải tế bào vào đĩa nuôi cấy với môi trường bình thường Nồng độ tế bào ban đầu phải cao từ 2-3x104 tế bào/cm2 Đánh giá chất lượng Nhuộm xác định số lượng tế bào sống, chết • Ni cấy sau giải đơng • Sức sống tế bào sau giải đông: tăng sinh 10 yếu tố ảnh hưởng đến q trình đơng lạnh tế bào, giải thích Các vấn đề đông lạnh tế bào động vật thường gặp Trong trình thu nhận thao tác tế bào + Sự tiếp xúc tế bào chất bảo quản lạnh + Sự trì lượng lớn tế bào nhiệt độ phòng pH Trong trình làm lạnh + Làm lạnh nhanh, chậm hay bị gián đoạn + Sử dụng chất bảo quản lạnh không phù hợp hay sử dụng nồng độ không thích hợp Trong q trình trữ lạnh + Q trình chuyển tế bào vào bình trữ lạnh + Nhiệt độ đơng lạnh khơng trì ổn định Trong q trình giải đơng + Giải đơng chậm + Phương pháp loại chất bảo quản lạnh không phù hợp ... u nang - Sản xuất tế bào động vật để dùng chất in vitro nghiên cứu chất độc học dược học - Phát triển công nghệ mô phát sinh quan để sản xuất quan thay nhân tạo sinh học hay dụng cụ trợ giúp,... gan, … Hạn chế - Tế bào động vật có kích thước lớn cấu trúc phức tạp tế bào vi sinh vật - Tốc độ sinh trưởng tế bào động vật chậm so với tế bào vi sinh vật - Các tế bào động vật bao bọc màng huyết... thích ứng với đặc điểm sinh lý tế bào mơ sống O2 có vai trò quan trọng sinh trưởng, tăng sinh biệt hóa tế bào Nồng độ O2 phổ biến dùng tủ nuôi tế bào thường từ 16 – 20% Tác động CO2 lên nuôi cấy