Hiện nay, các nhà nghiên cứu đang tiến tới sử dụng dạng tế bào lai (hybridoma) giữa tế bào động vật và tế bào ung thư, như là một hệ thống sản xuất các protein tái tổ hợp, ví dụ kháng t[r]
(1)1 MỞ ĐẦU
I KHÁI NIỆM
Cơng nghệ Sinh học (CNSH) (Biotechnology) địi hỏi tập hợp trí tuệ, kỹ thuật dựa tảng khoa học sống Đó kết việc ứng dụng nguyên lý khoa học công nghệ để chế tạo, sản xuất nguyên vật liệu tác nhân sinh học, nhằm tạo hàng hóa dịch vụ phục vụ người
Công nghệ Sinh học người động vật (CNSH N&ĐV) kỹ thuật CNSH tiến hành ứng dụng đối tượng người động vật Ở nước ta, CNSH người chưa thực
phát triển thành lĩnh vực độc lập, nên thường gọi chung Công nghệ Sinh học Động vật (CNSH ĐV)
CNSH ĐV có lịch sử tiềm tàng lâu dài, kiến thức ứng dụng sơ khai diễn cách 8.000 năm khu vực Tây Bắc Á, người lần biết săn bắt loài động vật hoang dại nuôi để lấy thịt, lông, sữa…và sau hóa chúng làm phương tiện vận chuyển
Cách nhiều thập niên, người có nhiều cải tiến mạnh mẽ chăn ni động vật, biết chọn lọc cá thể khỏe mạnh, tiêm chủng để phòng ngừa bệnh, thực nhiều kỹ thuật khác để tăng cường khả sinh sản chúng Tuy nhiên, CNSH ĐV đại (dựa thành tựu tế bào học di truyền học) thật bắt đầu vào năm 60 kỉ XX bùng nổ hai thập kỷ gần
II NỀN TẢNG KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT
II.1 GENOMICS VÀ BỘ GEN NGƯỜI II.1.1 Genomics
Genomics lĩnh vực nghiên cứu thành phần, tổ chức, chức tiến hóa thơng tin di truyền chứa gen.
Ba lĩnh vực genomics: hệ gen cấu trúc (structure genomics), hệ gen chức (functional genomics), hệ gen so sánh (comparative genomics) Genomics xem tâm điểm của sinh học, kết từ nghiên cứu genomics đã, đóng góp tích cực vào lĩnh
vực ứng dụng chăm sóc sức khỏe người, nông nghiệp, lâm nghiệp nhiều lĩnh vực khác Sự phát triển nhanh chóng genomics có trợ giúp ngành khoa học kỹ thuật khác, chẳng hạn thiết bị giải trình tự… Ngồi ra, “đua nhau” giải mã gen sinh vật từ năm 1990 với nhiều quy mô, nhiều mức độ khiến công việc trở nên sôi động Đến nay, có 100 lồi giải mã gen
II.1.2 Bộ gen người
Ý tưởng giải trình tự gen người đưa từ họp tổ chức vào năm 1984-1986 Cơ quan Năng lượng Mỹ (U.S Department of Energy)
(2)2 Tháng 6-1988, họp quan trọng việc giải trình tự lập đồ gen (Genome Mapping Sequencing Meeting) tổ chức Cold Spring Harbor chứng kiến nỗ lực kế hoạch giải trình tự gen người Celera Genomics (nhóm thứ hai giải trình tự gen người Craig Venter chủ trì) Cuộc họp xem điểm nhấn ban đầu cho HGP Nhờ phát triển, hợp tác quốc tế, nhờ tiến genomics, kỹ thuật máy tính, phác thảo hành động (working draft) gen người hoàn thành vào 26/6/2000
Tháng 2/2001, phân tích bản phác thảo hành động công bố
Dự án gen người hoàn thành tuyên bố kết thúc vào ngày 14/4/2003, sớm năm Hội nghị khoa học NIH kỉ niệm 50 năm chuỗi xoắn kép DNA Tháng 5-2006, trình tự NST
người cuối cơng bố tạp chí Nature
Mặc dù hầu hết báo cho gen người hoàn thành, thật đến năm 2006, cịn chưa hồn tất nhiều năm hồn thành trọn vẹn, vùng trung tâm NST (như centromere) ln bao gồm trình tự DNA lặp lại cao, khó giải trình tự chúng với kỹ thuật
* Ứng dụng triển vọng của việc nghiên cứu bộ gen người
Các kỹ thuật công nghệ mới, tiền đề tạo từ HGP, nghiên cứu genomics khác, có nhiều tác động mạnh lên khắp ngành khoa học sống
Một số ứng dụng tiềm việc nghiên cứu gen: - Thuốc phân tử (Molecular medicine)
- Các nguồn lượng ứng dụng môi trường - Đánh giá rủi ro
- Sinh khảo cổ, nhân loại học, tiến hóa di cư người - DNA pháp y (DNA forensic)
- Nông nghiệp, sinh sản vật nuôi chế biến sinh học
II.2 PROTEOMICS
II.2.1 Khái niệm
Proteomics khoa học nghiên cứu proteome Proteome toàn protein biểu genome Vì số gen mã hóa cho nhiều protein khác nhau, nên kích thước proteome thường lớn so với số lượng gen Thỉnh thoảng khái niệm sử dụng nhằm để mơ tả tồn protein biểu tế bào, hay mô đặc biệt
II.2.2 Các cơng cụ của proteomics
Công cụ đầu tiên của proteomics dữ liệu Các liệu protein, EST trình tự gen
(3)3 Công cụ thứ hai khối phổ (Mass spectrometry_MS) Các thiết bị MS có nhiều thay đổi
trong thập niên qua, đặc biệt độ nhạy MS thực ba kiểu phân tích cần thiết cho proteomics Thứ là, MS cung cấp đo lường xác khối lượng phân tử protein nguyên vẹn 100 kDa hay Do đó, phân tích MS cách tốt để xác định khối lượng phân tử (hơn phương pháp điện di protein gel polyacrylamide) MS cung cấp đo khối lượng xác peptide từ trình protolytic Dữ liệu từ peptide tìm kiếm trực tiếp, nhằm xác định xác protein mục tiêu Cuối cùng, phân tích MS cung cấp trình tự peptide từ trình thủy giải Các liệu từ MS cung cấp chiến lược rõ ràng (và mạnh nhất) việc xác định protein
Công cụ thứ ba phần thu gom, kết hợp liệu MS với trình tự protein đặc
biệt có sẵn sở liệu Các phần mềm lấy liệu MS khơng giải thích rõ ràng kết hợp với trình tự sở liệu protein, hay EST trình tự gen với thuật tốn đặc biệt Khía cạnh mạnh công cụ này, chúng cho phép tự động hóa lượng lớn liệu MS, cho kết hợp trình tự protein khác
Công cụ cần thiết thứ tư kỹ thuật phân tách protein Sự phân tách protein có hai mục
đích proteomics Thứ nhất, chúng làm đơn giản hỗn hợp protein thành protein đơn lẻ hay nhóm nhỏ Thứ hai, chúng cho phép phát khác biệt mức độ protein so sánh hai mẫu, nên kỹ thuật phân tách, nhằm phân tích protein cho phép người tiến hành xác định protein đặc biệt Thông thường, phương pháp điện di protein hai chiều (2D-SDS-PAGE) sử dụng proteomics Một số kỹ thuật khác sử dụng 1D-SDS-PAGE, hay sắc ký lỏng hiệu cao (high-performance liquid chromatograph_HPLC), kỹ thuật chạy điện di mao quản (Capillary electrophoresis_CE), sắc ký lực…
II.2.3 Các ứng dụng của proteomics
Kỹ thuật proteomics thật có tác động lớn với bốn ứng dụng
Khai thác (Mining): xác định protein có mẫu từ sở liệu gen
Ghi nhận sự biểu hiện đặc biệt (Protein-expression profiling): xác định protein
một mẫu đặc biệt, chức trạng thái đặc biệt tế bào hay thể (trạng thái biệt hóa, trạng thái phát triển, trạng thái bệnh…), hay chức tiếp xúc với thuốc, kích thích hóa lý
Lập sơ đồ mạng lưới protein (Protein-network mapping): xác định phương thức
protein tương tác với hệ thống sống
Lập bản đồ biến đổi protein (Mapping of protein modification): xác định phương thức
và vị trí protein bị biến đổi
II.3 CYTOMICS
Cytomics nghiên cứu trình sinh hóa, nhằm kết hợp chế mức thấp vào trình mức tế bào cuối thể
Cytomics giúp hiểu tái thiết lập q trình chuyển hóa (genome, proteome, metabolome), mô tế bào thể nhỏ
(4)4
II.4 CÔNG NGHỆ NANO VÀ MICRO
Công nghệ nano liên quan đến khả xếp phân tử nguyên tử thành cấu trúc phân tử Nó có tác động lên máy tính, vật liệu sản xuất công cụ, thiết bị, khả can thiệp vào cấp độ điều trị bệnh
Các kỹ thuật thiết kế máy micro phát triển nhanh chóng có nhiều ứng dụng vi dòng (microfluidic), sensor, sợi quang học
Các microrobot nanorobot hoạt động robot di động nhỏ dịch thể công cụ tuyệt vời cho thao tác tế bào
Sự đời biochip tiến vượt bậc công nghệ sinh học nano, chúng chứa đựng phạm vi rộng vấn đề nghiên cứu genomics, proteomics, sinh học máy tính dược học, số hoạt động khác Những tiến lĩnh vực tạo phương pháp mới, gỡ rối cho q trình sinh hóa xảy tế bào, với mục đích tìm hiểu chữa trị bệnh cho người Các biochip xem phịng thí nghiệm thu nhỏ, lẽ tiến hành hàng trăm đến hàng ngàn phản ứng sinh hóa Biochip giúp nhà nghiên cứu sàng lọc nhanh lượng lớn chất sinh học với nhiều mục đích khác nhau, từ chẩn đốn bệnh đến phát tác nhân nguy hại sinh học
II.5 KỸ THUẬT TẾ BÀO ĐỘNG VẬT IN VITRO
Việc tế bào động vật ni cấy, trì tăng sinh chai, lọ ngày dễ dàng phịng thí nghiệm, mở hướng quan trọng nghiên cứu CNSH N&ĐV- cơng nghệ tế bào động vật Các dịng tế bào thiết lập, mơ hình in vitro lý tưởng cho nghiên cứu nói chung
Ni cấy tế bào động vật lượng lớn tảng sản xuất vaccine virus nhiều sản phẩm công nghệ sinh học khác Các chất sinh học sản xuất kỹ thuật DNA tái tổ hợp nuôi cấy tế bào động vật enzyme, hormone, kháng thể đơn dòng, interleukin…hay nhân tố kháng ung thư Mặc dù nhiều protein đơn giản sản xuất vi khuẩn, nhiều dược chất cần glycosyl hóa, điều phải tiến hành tế bào động vật
(5)5 CHƯƠNG
NUÔI CẤY MÔ – TẾ BÀO ĐỘNG VẬT I GIỚI THIỆU
I.1 LƯỢC SỬ PHÁT TRIỂN
Kỹ thuật nuôi cấy mô – tế bào động vật kỹ thuật nuôi cấy in vitro tế bào, mô quan động vật nhằm trì và/hay tăng sinh tế bào, mơ, quan cách độc lập, tách khỏi biến đổi hệ thống in vivo điều kiện bình thường stress Kỹ thuật thực với mẫu mô, tốc độ tăng sinh chúng chậm
Việc nuôi cấy mô tế bào động vật tiến hành 100 năm nay, thông qua nghiên cứu nhằm tìm hiểu số vấn đề lĩnh vực sinh học phát triển Chẳng hạn Ross Harrison (1907) thành công việc nuôi tế bào thần kinh dịch huyết ếch trưởng thành Alexis Carrel nuôi phôi gà môi trường bổ sung chất dinh dưỡng giữ tim phôi gà hoạt động đến tháng thứ ba (1912)
Năm 1955, Harry Eagle’s khẳng định dịch chiết mô phức tạp, dịch huyết chất dùng ni tế bào thay “một hỗn hợp amino acid, vitamin, co-factor, carbohydrate muối, bổ sung với một lượng nhỏ protein huyết thanh…”, điều mở
thời kỳ nuôi cấy tế bào động vật in vitro
Sau đó, hàng loạt kỹ thuật nhằm khai thác, biến đổi ứng dụng tế bào động vật nuôi cấy in vitro tiến hành tạo tế bào biến đổi di truyền, nghiên cứu chuyển hóa sinh lý tế bào, thu nhận tạo dòng in vitro dòng tế bào bình thường (tế bào sinh dưỡng, sinh dục), bất thường (tế bào ung thư) người, nhiều động vật khác
Từ thực tế khối u người tạo nên dòng tế bào liên tục (như dòng tế bào Hela Gey cs thiết lập năm 1952), nuôi cấy mô người đầu tư nghiên cứu Sau đó, vào năm 1961 Hayflick Moorhead khảo cứu tế bào bình thường có đời sống xác định Các dòng tế bào thiết lập thành cơng, chúng trì phần đặc điểm, chức ban đầu tế bào tuyến thượng thận, tế bào tuyến yên, tế bào thần kinh, tế bào
Sự phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô ngày tinh vi, đại nhu cầu thiết hai hướng nghiên cứu chính: tạo vaccine kháng virus nghiên cứu ung thư
Hiện nay, nhà nghiên cứu tiến tới sử dụng dạng tế bào lai (hybridoma) tế bào động vật tế bào ung thư, hệ thống sản xuất protein tái tổ hợp, ví dụ kháng thể đơn dịng, vaccine, interferon… Gần đây, nuôi cấy tế bào gốc (stem cell) trở thành mũi nhọn công nghệ tế bào, với nhiều hy vọng ứng dụng y sinh
I.2 SƠ LƯỢC VỀ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
(6)6 - Các tế bào dịch huyền phù: là tế bào khơng bám dính sinh trưởng mơi trường ni cấy in vitro, ví dụ tế bào máu tế bào lympho; tế bào không đòi hỏi bề mặt để sinh trưởng
- Các tế bào dính bám: Hầu hết tế bào động vật bình thường tế bào dính bám, chúng cần có bề mặt để gắn vào sinh trưởng (thủy tinh, plastic), sử dụng phổ biến ứng dụng tế bào biểu mô nguyên bào sợi (fibroblast) Người ta thường sử dụng đĩa petri chai trục lăn để ni cấy tế bào dính bám Các giá thể polymer bọt biển (spongy), thể gốm (ceramic), sợi rỗng, microcapsule thể mang có kích thước hiển vi (microcarrier) sử dụng rộng rãi để tăng tỷ lệ diện tích/thể tích ni cấy
Có mối quan hệ quan trọng hình dạng tế bào tính chất bám dính chúng Nếu tế bào bám dính vào bề mặt ni cấy, chúng có hình dài, trải rộng mặt đáy hộp ni, ngược lại, khơng bám dính, tế bào có hình khối cầu
* Đặc điểm của tế bào động vật
- Tế bào động vật khơng có vách, kích thước lớn (khoảng 10 µm), nên tính bền cơ học yếu Do đó, tế bào động vật ni cấy in vitro dễ vỡ lực tác động khuấy trộn để tách tế bào, thao tác… Vì vậy, thao tác với tế bào động vật, cần cố gắng thao tác nhẹ nhàng thời gian ngắn
- Tế bào động vật có tăng trưởng phân chia chậm, nên hiệu suất sản sinh chất có hoạt tính sinh học thấp, chậm Do đó, để sản xuất chất có hoạt tính từ tế bào động vật, cần phải có thời gian dài khối lượng tế bào lớn
- Ở tế bào động vật, có chế kìm hãm ngược (negative feed-back), có nghĩa gia tăng nồng độ chất mơi trường dẫn đến ức chế tế bào tổng hợp tiết chất mơi trường Điều gây tổn thương tế bào, chí cịn làm chết hàng loạt Vì vậy, ni cấy mơ – tế bào động vật, sau khoảng thời gian nuôi cấy định, cần thiết phải thay môi trường nuôi
- Trừ tế bào máu số giai đoạn tế bào sinh dục, hầu hết mô tế bào động vật cầnbám vào giá đỡ để sống phân chia Thông thường tế bào tăng trưởng tốt gắn vào bề mặt rắn Tế bào ngừng phân chia hình thành lớp đơn liên tục bề mặt dụng cụ nuôi Tuy vậy, số dòng tế bào tế bào ung thư, dịng tế bào liên tục từ mơ bình thường, sau hóa, sinh trưởng phân chia trạng thái lơ lửng mà không cần bám vào
- Các tế bào động vật thay đổi kiểu gen kiểu hình, thơng qua q trình dung hợp hai tế bào có nhân khác tạo thành tế bào lai (hybridoma) trình biến nạp VD: chủng tế bào bình thường cảm ứng thành tế bào có tính chất tế bào ung thư, thơng qua q trình biến nạp thực virus cảm ứng ung thư hóa chất
- Các dịng tế bào động vật có thể được bảo quản lạnh sâu nitơ lỏng (-197oC) suốt nhiều năm Khi giải đơng hoạt hóa, tế bào phục hồi khả tăng trưởng phân chia ban đầu
(7)7
I.3 ƯU ĐIỂM VÀ HẠN CHẾ CỦA NUÔI CẤY MÔ – TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
* Ưu điểm
- Hệ thống tế bào động vật “nhà máy tế bào” thích hợp cho việc sản xuất phân tử phức tạp kháng thể dùng làm thuốc phòng bệnh, điều trị chẩn đoán: enzyme, hormone, vaccine, kháng thể đơn dòng, thuốc trừ sâu sinh học, interferon interleukin, tế bào nguyên vẹn để thử nghiệm chất độc hóa học…
- Các tế bào động vật có q trình biến đổi hậu dịch mã xác (post translational modifications) sản phẩm protein sinh-dược (biopharmaceutical protein) phân giải protein, liên kết tiểu đơn vị (subunit), nhiều phản ứng kết hợp khác glycosylation, methylation, carboxylation, amidation, hình thành cầu nối disulfide phoshorylation gốc amino acid Những sửa đổi quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học sản phẩm Ví dụ q trình glycosylation giúp bảo vệ protein chống lại phân giải chúng, trì khả ổn định cấu trúc biến đổi kháng nguyên
- Sản xuất viral vector dùng liệu pháp gen nhằm chữa trị nhiều bệnh ung thư, HIV, viêm khớp, bệnh tim mạch xơ hóa u nang
- Sản xuất tế bào động vật để dùng chất in vitro nghiên cứu độc chất học dược học
- Phát triển công nghệ mô phát sinh quan để sản xuất quan thay nhân tạo-sinh học hay dụng cụ trợ giúp, như: da nhân tạo để chữa bỏng, mô gan để chữa viêm gan, đảo Langerhans để chữa tiểu đường…
* Hạn chế
Mặc dù tiềm ứng dụng nuôi cấy tế bào động vật lớn, việc nuôi cấy số lượng lớn tế bào động vật thường gặp khó khăn sau:
- Tế bào động vật có kích thước lớn cấu trúc phức tạp tế bào vi sinh vật
- Tốc độ sinh trưởng tế bào động vật chậm so với tế bào vi sinh vật Vì thế, sản lượng chúng thấp việc trì điều kiện ni cấy vơ trùng thời gian dài thường gặp nhiều khó khăn
- Các tế bào động vật bao bọc màng huyết tương, mỏng nhiều so với thành tế bào dày thường thấy vi sinh vật tế bào thực vật, kết chúng dễ bị vỡ
- Nhu cầu dinh dưỡng tế bào động vật chưa xác định cách đầy đủ, mơi trường ni cấy thường địi hỏi bổ sung huyết máu đắt tiền
- Tế bào động vật phần mô tổ chức (phân hóa) thể đơn vào riêng biệt vi sinh vật
- Hầu hết tế bào động vật sinh trưởng gắn bề mặt
I.4 MỘT SỐ KHÁI NIỆM DỊNG TẾ BÀO
- Dịng tế bào (cell line): thuật ngữ dùng để quần thể tế bào giống hệt bắt nguồn từ tế bào ban đầu
(8)8 buồng trứng chuột Trung quốc), Schneider-2 (tế bào phôi ruồi giấm), COS1 (tế bào thận khỉ xanh Châu Phi), Hela (tế bào ung thư cổ tử cung người), Vero (tế bào thận khỉ xanh Châu Phi)
- Dòng tế bào tạm thời (temporary cell line): dòng tế bào sống điều kiện nuôi cấy thời gian giới hạn Đây thường dòng tế bào thường (không phải ung thư)
- Tế bào sơ cấp (primary cell): tế bào nuôi cấy điều kiện in vitro lần (nuôi cấy sơ cấp) sau tách từ khối mô
- Tế bào thứ cấp (secondary cell): tế bào qua vài lần cấy truyền (nuôi cấy thứ cấp) sau tách từ khối mơ
I.5 CÁC CẤP ĐỘ NI CẤY MƠ VÀ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
Nhìn chung, phịng thí nghiệm thường có ba cấp độ chính: ni cấy quan, nuôi cấy mô phát triển sơ cấp nuôi cấy tế bào
I.5.1 Nuôi cấy tế bào
Tế bào điều kiện in vitro có điểm khác biệt so với in vivo Thứ tế bào ni cấy in vitro khơng có đặc tính tương tác tế bào chuyên biệt (tương tác đa chiều) mô tế bào in vivo Thứ hai môi trường in vitro thiếu vài thành phần liên quan đến điều hịa in vivo, chuyển hóa tế bào in vitro ổn định dễ kiểm sốt in vivo, không thực đại diện cho mô
Tuy nhiên, dù ni cấy mơ – tế bào động vật thể nhiều khả đặc biệt nghiên cứu ứng dụng, cơng cụ hữu ích
Có nhiều hình thức ni cấy khác tùy đặc tính tế bào, hay tùy thuộc vào phương pháp: ni cấy sơ cấp (Primary culture), nuôi cấy thứ cấp (Secondary culture), nuôi cấy huyền phù (Suspension culture) nuôi cấy lớp đơn (Monolayer culture)
Nuôi cấy sơ cấp: là nuôi cấy tế bào sau tách từ cách mảnh mô trước lần cấy chuyền Nuôi cấy sơ cấp thường sử dụng để khai thác tế bào ban đầu mảnh mơ, nhằm tạo dịng tế bào
Trong nuôi cấy sơ cấp, tế bào ban đầu thường hỗn hợp dòng khác nhau, chứa kiểu tế bào trội nhất, có tế bào quan tâm tế bào khác (tế bào nhiễm) Có thể loại bỏ tế bào nhiễm học, hay enzyme tách mô, hay cách trì điều kiện chọn lọc dương tính cho sống sót kiểu tế bào quan tâm cần thu nhận
Quy trình ni cấy sơ cấp: thu nhận mảnh sinh phẩm, mảnh mô sống xử lý sơ bộ, loại bỏ vi khuẩn, nấm thành phần không mong muốn khác tách tạo huyền phù tế bào đơn đưa vào môi trường nuôi cấy
Nuôi cấy thứ cấpđược tiến hành sau tế bào tạo dịng từ ni sơ cấp
Nhiều dòng tế bào thiết lập thương mại hóa Phần lớn dịng thu nhận từ khối u (ví dụ tế bào Hela, RD…) hay từ tế bào bị biến đổi in vitro Tuy nhiên, dịng tế bào ni cấy phịng thí nghiệm khác nên dẫn đến phát sinh đặc tính khác khác với tế bào sơ khai ban đầu Các tế bào nuôi cấy thứ cấp đối tượng cho nghiên cứu ứng dụng công nghệ tế bào động vật
(9)9 Nuôi cấy huyền phù thường tiến hành với tế bào thu nhận từ máu (bạch cầu…) Có thể coi phương pháp nuôi cấy không gian ba chiều với kỹ thuật nhân sinh khối fermenter, thông qua hệ thống bioreactor, nhằm thu nhận lượng lớn tế bào mong muốn
Nuôi cấy lớp đơn ứng dụng với dòng tế bào khác thu nhận từ mô rắn (phổi, thận, cơ, xương, mỡ…) cần ni phát triển thành lớp đơn Các dịng tế bào bám dính phân loại tế bào nội mô: BAE-1; tế bào biểu mô: Hela; mơ thần kinh: SH-SY5y hay fibroblast: MRC-5 Thơng thường, hình dạng in vitro tế bào sống nói ln phản ánh nguồn gốc mơ
Ngồi ra, số dịng tế bào ni biểu trạng thái bán bám dính (semi-adheret) B95-8 Khi đó, dụng cụ ni xuất hỗn hợp hai quần thể tế bào: tế bào bám tế bào huyền phù
* Những thuận lợi của ni cấy tế bào
- Có thể phát triển dòng tế bào qua nhiều hệ - Có thể ni cấy quy mơ lớn
* Những bất lợi của nuôi cấy tế bào
- Tế bào bị số đặc tính biệt hóa mơ I.5.2 Ni cấy mơ
Nuôi cấy mô phát triển sơ cấp tiến hành cách đặt mảnh mô lên bề mặt rắn nhựa, hay thủy tinh bao phủ chất dinh dưỡng dạng lỏng Trong điều kiện thích hợp, mảnh mơ bám vào bề mặt rắn, tế bào phần rìa mảnh mơ tăng sinh làm nới rộng mảnh mô Kỹ thuật cung cấp mơ hình thử nghiệm thuận lợi so với thử nghiệm in vivo, đặc biệt tiến hành nghiên cứu độc tố Nuôi cấy mơ phát triển sơ cấp cịn dùng để thu nhận quần thể tế bào
* Những thuận lợi của nuôi cấy mô
- Các yếu tố lý hóa mơi trường (pH, nhiệt độ, áp suất thẩm thấu, O2, CO2) kiểm soát tốt Các yếu tố bổ sung có thành phần khơng xác định dần hiểu rõ thay thành phần xác định
- Mẫu mô không đồng sau vài hệ nuôi cấy in vitro, dòng tế bào trở nên đồng hay dạng
- Những tế bào ni cấy tiếp xúc trực tiếp với chất nồng độ thấp xác định, chất xâm nhập trực tiếp vào tế bào
- So với nuôi cấy quan ni cấy mơ, số chức bình thường mơ trì ni cấy quy mơ lớn (nhưng khó tiến hành)
* Những khó khăn của ni cấy mơ
- Tổ chức ban đầu mô bị
- Kỹ thuật nuôi cấy cần thực điều kiện vô trùng tuyệt đối Tế bào động vật địi hỏi cung cấp mơi trường phức hợp, giống huyết tương máu hay dịch lỏng kẽ tế bào Do đó, địi hỏi người thực phải có kỹ thành thạo hiểu biết tốt lĩnh vực
(10)10 - Sau thời gian phân chia liên tục, tạo thành tế bào với NST đa bội khơng hồn chỉnh Ngay với ni cấy thời gian ngắn, tế bào ổn định mặt di truyền, không đồng tốc độ tăng trưởng tế bào tạo thay đổi từ hệ sang hệ khác
I.5.3 Nuôi cấy cơ quan
Kỹ thuật nuôi cấy quan phát triển từ phương pháp nuôi cấy mô nhằm phục vụ nghiên cứu, mơ hình chức nhiều thử nghiệm Đó kỹ thuật nuôi cấy in vitro mảnh quan hay quan, trì cấu trúc mơ hướng phát triển bình thường Mơi trường ni cấy quan dạng mơi trường rắn hay môi trường lỏng
Việc nuôi cấy quan thu nhận từ phôi thai dễ dàng quan từ thể trưởng thành, nhu cầu O2 mơ trưởng thành lớn nhiều Vì vậy, để nuôi quan từ thể trưởng thành phải sử dụng môi trường với thiết bị đặc biệt
Những thuận lợi của nuôi cấy cơ quan:
- Chức sinh lý bình thường quan trì - Tế bào giữ trạng thái biệt hóa hồn tồn
Những bất lợi của nuôi cấy cơ quan: - Không thể nuôi cấy quy mô lớn - Cơ quan nuôi cấy phát triển chậm
- Thường xuyên phải cấy chuyền sang mơi trường cho thí nghiệm
II ĐIỀU KIỆN LÝ – HĨA TRONG KỸ THUẬT NI CẤY MÔ – TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
II.1 Nhiệt độ
Tế bào loài động vật khác có nhiệt độ ni cấy thích hợp khác VD: tế bào động vật có vú người phát triển tốt 37 ± 10C, nhiệt độ tế bào loài chim
phát triển tốt 38,50C, cịn tế bào lồi trùng phát triển tốt nhiệt độ 25 ± 20C Một số dòng tế bào phát triển nhiệt độ thấp thân nhiệt bình thường thể, VD: tế bào biểu mô, tế bào tinh trùng
Trong nuôi cấy in vitro, tế bào động vật không chịu nhiệt độ cao 20C so với nhiệt độ phát triển thích hợp chúng, tế bào lại có khả chịu đựng nhiệt độ thấp nhiệt độ phát triển tối ưu chúng mà ảnh hưởng đến phát triển chúng sau
Để trì nhiệt độ ni cấy, thường phải sử dụng tủ ấm (incubator) Nhìn chung, tủ ấm trì nhiệt độ cách làm ấm tuần hồn khí nóng để đáp ứng với thay đổi nhiệt trả lại nhiệt độ nhanh chóng sau mở hay đóng cửa tủ Đối với tủ ấm có bổ sung nước khay bên trì độ ẩm cao
II.2 pH
(11)11 sản xuất protein shock nhiệt, trình dẫn đến chết tế bào (apoptosis) Do vậy, kiểm soát pH cần thiết để tối ưu hóa điều kiện ni cấy
pH tối ưu cho phát triển tế bào ni cấy khác tùy theo lồi tùy theo dòng tế bào Hầu hết tế bào sống mơi trường có ngưỡng pH 6,5 – 7,8 nên mơi trường nuôi cấy thường điều chỉnh pH 7,0 – 7,4 (trung bình 7,2) Một số dịng tế bào thích hợp với pH cao (VD: tế bào fibroblast người thích hợp với pH 7,4 – 7,7) hay thấp (VD: tế bào côn trùng phát triển tốt pH 6,2±0,1)
Mơi trường có pH ổn định thay đổi giúp tế bào sống tốt
Hầu hết môi trường thương mại chứa phenol red chất thị pH Môi trường chuyển màu vàng cho biết pH giảm (acid) màu hồng pH tăng (kiềm)
II.3 Áp suất thẩm thấu
Áp suất thẩm thấu môi trường xác định cơng thức mơi trường Muối glucose hai tác nhân hình thành nên áp suất thẩm thấu, amino acid quan trọng Thay đổi áp suất thẩm thấu tế bào tác động lên tăng trưởng chức tế bào Nếu tế bào nằm mơi trường có áp suất khơng thích hợp, chúng biến dạng: tế bào co lại môi trường có áp suất thẩm thấu q cao, cịn mơi trường có áp suất thấp, chúng căng phồng lên
Để kiểm tra áp suất thẩm thấu môi trường, thường sử dụng Osmom kế (Osmometer) Các môi trường thương mại thiết kế để áp suất thẩm thấu 300 mOsm (tế bào phát triển khoảng 290 - 310 mOsm)
Có thể điều chỉnh áp suất thẩm thấu cách thêm NaCl, 0,0292 g/lít NaCl làm tăng mOsm (sử dụng 5M NaCl với 1ml/lít làm tăng áp suất thẩm thấu lên 10 mM) Chú ý mơi trường cịn có thành phần đường, ion, amino acid…chúng đóng góp vào tạo áp suất thẩm thấu
II.4 Các loại khí
Ba loại khí cần quan tâm: CO2, O2 N2 Tỷ lệ chúng phối trộn thích hợp theo chương trình thiết kế sẵn tủ ni, nhờ phân áp khí tạo thích ứng với đặc điểm sinh lý tế bào mơ sống
O2 có vai trò quan trọng sinh trưởng, tăng sinh biệt hóa tế bào Tuy nhiên, nhu cầu O2 tế bào nuôi cấy thấp nhu cầu O2 mô sống Áp suất O2 tủ nuôi cấy tế bào thường thấp áp suất O2 không khí Trong q trình ni cấy tĩnh, phân tử oxy khơng khí ln có xu hướng khuếch tán vào môi trường nuôi, qua lớp môi trường dày chừng vài milimet Do vậy, sử dụng nhiều môi trường thể tích hẹp kìm hãm khuếch tán oxy Nồng độ O2 phổ biến dùng tủ nuôi tế bào thường từ 16 – 20%
(12)12 III MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào động vật phức tạp nhiều so với môi trường nuôi cấy vi sinh hay tế bào thực vật, thường chứa thành phần không xác định Do thành phần phức tạp, khó ổn định nên người ta quan tâm dần đến nghiên cứu, tạo mơi trường tổng hợp để chủ động bảo quản, sử dụng, điều chỉnh ổn định thành phần lần nuôi cấy khác
Môi trường nuôi cấy chứa phần lớn nước Nếu nguồn nước khơng ổn định tạo nên khác biệt quan trọng chất lượng sử dụng Điều đặc biệt quan trọng mơi trường khơng có huyết thanh, hợp chất hữu kim loại diện nước cất vô trùng khử ion gây độc nghiêm trọng số kiểu tế bào
III.1 Vai trị của mơi trường
Môi trường nuôi cấy cung cấp chất dinh dưỡng cần thiết cho phát triển tế bào in vitro Các chất dinh dưỡng thiết yếu giúp tế bào phân chia amiono acid, acid béo, đường, ion, vitamine, cofactor phân tử cần thiết để trì mơi trường hóa học cho tế bào Một số thành phần giữ nhiều vai trị hơn, VD: sodium bicarbonat trì pH thích hợp tạo áp suất thẩm thấu cho môi trường
III.2 Thành phần của môi trường
a Muối vô cơ
Các muối vô môi trường giữ vai trò quan trọng phát triển tế bào in vitro, như: cân áp suất thẩm thấu, trì chế vận chuyển chất qua màng, giúp điều hòa điện màng, bám gắn tế bào, hoạt động cofactor
b Hệđệm
Hệ đệm có vai trị điều hịa pH môi trường nuôi cấy Hầu hết môi trường sử dụng hệ đệm bicarbonate với CO2 thành phần Ngồi ra, cịn có hệ thống đệm phosphat đệm hữu phức tạp khác Cũng sử dụng hệ đệm hữu hay huyết môi trường
Khi sử dụng bicarbonate làm hệ thống đệm mơi trường tương tác CO2 thu nhận từ tế bào (hay từ khơng khí) với nước, dẫn đến điều chỉnh pH mơi trường theo cân phương trình:
H2O + CO2 = H2CO3 = H+ + HCO-3
Sử dụng hệ đệm bicarbonate/CO2 cần trì khơng khí với 5–10% CO2 tủ Bicarbonate, CO2 rẻ, không độc tế bào nên dùng phổ biến
Hệ đệm hữu sử dụng nhiều HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid) Các hệ đệm hữu không nhạy cảm với CO2, chúng cung cấp hệ thống tốt để tế bào chuyển hóa mạnh (sản xuất nhiều CO2) ổn định pH
Một số dung dịch đệm Tris [Tris (hydroxymethyl) aminomethane] thường sử dụng sinh hóa gây độc tế bào in vitro
c Carbohydrate
(13)13 maltose hay fructose Nồng độ đường khác môi trường từ 1g/l– 4,5g/l Môi trường chứa nồng độ đường cao giúp phát triển nhiều kiểu tế bào
d Vitamine
Vitamine chất cho nhiều cofactor, chúng có nhiều thành phần huyết Tuy nhiên, nhiều loại môi trường cần bổ sung vitamine thích hợp chúng quan trọng ni cấy tế bào Đặc biệt vitamine nhóm B cần thiết cho phát triển tế bào, số tế bào, vitamine B12 thiết yếu Một số mơi trường có nhiều vitamine A E Thơng thường vitamine sử dụng môi trường riboflavin, thiamine biotin
e Các protein peptide
Các thành phần giữ vai trò quan trọng nuôi cấy hầu hết tế bào, đặc biệt nuôi cấy với môi trường không huyết Một số protein, peptide cần thiết albumin, transferring, fibronectin fetuin thường có sẵn huyết
f Acid béo lipid
Giống với protein peptide, chất cần thiết môi trường nuôi không huyết cho số tế bào đặc biệt Chúng diện huyết với dạng cholesterol steroid
g Yếu tố vi lượng
Bao gồm kẽm, đồng, selenium… tricarboxylic acid trung gian, selenium chất giúp tách gốc oxy tự Ngoài ra, tùy vào mục đích nghiên cứu để đưa vào môi trường số vi lượng cần thiết khác
h Huyết
Trong hầu hết loại mơi trường ni cấy tế bào động vật có mặt huyết có vai trị quan trọng sau:
- Cung cấp chất dinh dưỡng quan trọng cho tế bào amino acid thiết yếu, tiền chất nucleic acid, nguyên tố vi lượng…
- Cung cấp nhân tố tăng trưởng, kích thích cho tế bào tăng trưởng phân chia
- Kích thích phục hồi tổn thương tế bào cấy chuyền, protein huyết làm bất hoạt trypsin, tránh enzym gây tổn thương tế bào
- Cải thiện tính tan chất dinh dưỡng
- Chống oxy hóa: huyết kháng oxy hóa mạnh, ức chế độc tính oxy
- Cải thiện tính dính tế bào lên bề mặt bình ni nhờ yếu tố làm tăng độ dính tế bào lên giá đỡ
Huyết cần cho việc nuôi cấy tế bào động vật Tuy nhiên, bên cạnh tác động tốt nêu trên, huyết có tác động không tốt:
- Nuôi cấy tế bào với mơi trường bổ sung huyết chi phí cao, huyết bò (FBS) làm tăng giá thành lên đáng kể (huyết chiếm 90% giá thành môi trường nuôi cấy)
(14)14 - Huyết chứa thành phần gây ức chế phân bào cảm ứng phân hóa (VD: TGF - có tác dụng ức chế phân chia tế bào thượng bì khí quản, làm tế bào biến thành hình có góc cạnh; TGF- cịn có tác dụng kìm hãm phân chia dịng tế bào biểu bì người chuột), (do ni cấy, cần chọn loại huyết phù hợp không chứa yếu tố ức chế dịng tế bào ni cấy)
- Một số tế bào nuôi cấy không (hoặc kém) phát triển huyết thanh, chúng thích ứng với mơi trường cục chun biệt, có tính chất khác biệt rõ rệt với huyết
- Nhiều chất huyết (vitamin C, lipoprotein ) thường không ổn định đông lạnh hay bảo quản lâu Môi trường bổ sung huyết có nồng độ hormone hay nhân tố tăng trưởng khơng thích hợp với phát triển số tế bào
- Huyết khơng pha lỗng độc với nhiều loại tế bào (cũng có số loại tế bào có khả chịu đựng nồng độ huyết cao tế bào khác, VD: tế bào nội mơ thành mạch chúng phát triển mơi trường tương tự huyết khơng hồn tồn giống huyết thanh)
- Khi nồng độ hormone thích hợp, huyết chứa chất ức chế phát triển, biệt hóa hay chức Huyết kích thích biệt hóa tế bào vào trạng thái không nguyên phân, làm chúng trì dịng tế bào
Vì vậy, nhiều nhà nghiên cứu hướng đến xây dựng môi trường tổng hợp không dùng huyết (như M-199) hay dùng với lượng thấp (CMRL 1066, NTCT 109) Để phát triển tế bào môi trường không huyết thanh, c1o nhiều cách tiếp cận, tất chiến lược nhằm kết hợp thay đổi liên tục với việc làm giàu thành phần dinh dưỡng mơi trường ni:
- Tạo thích nghi tế bào với môi trường không huyết không bổ sung hormone
- Sử dụng huyết làm giảm (hay loại bỏ hoàn toàn) lớp hormone không cần thiết
- Bổ sung thường xuyên vào môi trường không huyết nhân tố tăng trưởng, bám dính nhân tố phù hợp khác
III.3 Chọn lọc mơi trường thích hợp
Nếu dòng tế bào mang vào phịng thí nghiệm, cần xác định mơi trường thích hợp để phát triển Các thơng tin đưa nhà cung cấp Cũng tự tìm thơng tin thơng qua việc sàng lọc, thử nghiệm với nhiều lồi mơi trường khác điều kiện ni để xác định mơi trường thích hợp cho nuôi cấy tế bào phát triển sơ cấp đầu tiên, dịng tế bào cịn thiếu thơng tin muốn tìm mơi trường thay cho dịng tế bào
(15)15
III.4 Kỹ thuật pha môi trường
- Thành phần môi trường: khác tùy vào loại sử dụng Khi pha môi trường cần phải đảm bảo cung cấp đầy đủ thành phần theo công thức
- Điều kiện nuôi cấy: thông thường tế bào động vật phát triển tốt nhiệt độ ấm khoảng 36-39oC Đặc biệt nuôi cấy tế bào động vật, điều kiện độ ẩm nồng độ CO2 khơng khí quan trọng Trong tủ nuôi cấy tế bào động vật thường đặt khay nước để tạo độ ẩm cao không khí, tránh bốc nước từ mơi trường ni, dẫn đến thay đổi áp suất thẩm thấu môi trường Nồng độ CO2 tủ nuôi thường 5%, đặc biệt có đến 95%
- Sự vơ trùng: yếu tố quan trọng lưu ý đặc biệt nuôi cấy tế bào động vật Virus vi sinh vật ngoại nhiễm nguy lớn, làm chết tế bào ni cấy Tùy theo tính chất hóa học thành phần mơi trường để chọn cách khử trùng thích hợp, hấp ướt lọc vơ trùng milipore
IV KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO
IV.1 NI CẤY SƠ CẤP Quy trình ni sơ cấp gồm:
Hình 1.1 Sơđồ ni cấy sơ cấp THU NHẬN MẪU MÔ
Cắt nhỏ
(Chọn lọc mẫu mô quan tâm, cắt bỏ phần mô chết)
Cắt nhỏ (Mảnh nhỏ để nuôi)
Tách tế bào học (nghiền, ép)
Tách tế bào enzyme (Ủ…)
Nuôi mẫu mô sơ cấp
Trypsin lạnh Trypsin ấm Collagenase
NUÔI SƠ CẤP
Ly tâm Tái huyền phù
Cấy chuyền DÒNG TẾ BÀO Thu nhận tế bào
(16)16 + Bước 1: thu nhận mô (tươi hay đơng lạnh) có chứa tế bào sống
+ Bước 2: phẫu tích và/ hay tách rời tế bào, xác định nồng độ + Bước 3: nuôi cấy
IV.1.1 Thu nhận mẫu xử lý sơ bộ
Mẫu thu nhận bao gồm mô thể Tại nơi thu nhận, mẫu cần làm (rửa sát trùng cồn) đưa vào bảo quản dung dịch DPBS chuyển nhanh phịng thí nghiệm Tùy loại mẫu mơ thời gian cần thiết đưa phịng thí nghiệm, để có kế hoạch vận chuyển chúng điều kiện nhiệt độ ấm (370C), nhiệt độ lạnh hay đông lạnh tạm thời
Xử lý sơ mẫu mơ: rửa nhiều lần dung dịch DPBS có bổ sung kháng sinh, kháng nấm cắt bỏ phần mô chết, phần thừa cắt mảnh nhỏ thành mảnh 2-3 mm2 nuôi mẫu mô sơ cấp tách rời tế bào
VI.1.2 Tách rời tế bào
Mô tập hợp tế bào tổ chức tinh vi đặc trưng, chúng liên kết thành khối thống nhất, thông qua cầu nối gian bào Tách tế bào khỏi mô cần phá bỏ cầu nối liên bào này, không gây tổn thương đáng kể cho tế bào Có hai biện pháp để tách rời tế bào:
a Tách bằng cơ học
- Cắt nhuyễn mô: Dùng kéo cắt nhuyễn mảnh mô, huyền phù dung dịch PBS (-), để lắng thu dịch (huyền phù thu nhận tế bào đơn) Phương pháp cho khả sống tế bào cao số lượng tế bào đơn thu nhận nên thường áp dụng cho mẫu mơ có kích thước lớn không khan
Trên thực tế, việc cắt nhuyễn mô thường dùng để làm tăng khả tiếp xúc mô với enzyme kỹ thuật tách enzyme tiến hành sau
- Ép nhuyễn mô sử dụng hai phiến lame: thường sử dụng để tách tế bào mơ có liên kết yếu (như mơ lách) Ngồi cịn sử dụng pittong syringe để ép mô đĩa petri nhằm tách rời tế bào
- Ép bằng màng lọc tế bào (Cell strainer): đặt mẫu mơ lên màng lọc (có đường kính lỗ 70 – 100µm), sử dụng pittong syringe để chà sát mạnh mảnh mơ, đó, tế bào va
chạm vào lưới lọc tách rời Những tế bào đơn (có đường kính nhỏ lỗ lọc) lọt qua lỗ lọc b Tách bằng enzyme
Cầu nối gian bào có chất protein (các tế bào liên kết với với ECM), protease sử dụng để tách tế bào enzyme thuỷ phân protein như: trypsin, collagenase, elastase, pronase, dispase hay tổ hợp khác Việc sử dụng enzyme riêng lẻ, hay kết hợp tùy thuộc vào mục đích
Trypsin cắt liên kết nhóm carboxyl COOH) lysin arginin gốc amin (-NH2) axid amin đứng liền kề với polypeptid, ngoại trừ liên kết lysin arginin Xử lý trypsin dẫn đến cuộn tròn tế bào Khi tế bào co lại, liên kết trở nên lỏng lẻo tế bào dễ dàng tách tác động học
(17)17 Canxi xem chất bảo vệ cho trypsin, hoạt tính xúc tác trypsin bị giảm 50% vắng mặt Ca2+ trypsin trở nên trơ Một số kim loại coban, mangan… có khả hoạt hóa trypsin Hoạt tính trypsin bị kìm hãm huyết bị có thai DFP (di-isopropyl fluoro phosphate)
Nồng độ trypsin thường dùng để tách tế bào 0,01–0,5% (thường 0,25%), đơi 1% Có thể sử dụng quy trình trypsin ấm (370C) hay trypsin lạnh (40C)
Trypsin không tác động đặc hiệu cho loại protein, phân cắt protein màng gây vỡ tế bào dùng nồng độ cao, cho tác động thời gian dài Cần trung hòa trypsin huyết sau thu đuợc tế bào đơn
Collagenaselà enzyme thủy phân liên kết peptid dạng poly-L prolin đặc trưng cho vùng xoắn collagen Collagenase thu nhận từ động vật hữu nhũ cắt chuỗi collagen điểm riêng biệt, cịn thu nhận từ vi khuẩn cắt nhiều vị trí dọc chuỗi collagen
Đa số collagenase hoạt động pH trung tính kiềm (pH 7- 8), nhiệt độ thích hợp 400C, giảm hoạt tính nhiệt độ 450C Có loại collagenase:
- Collagenase loại I: chứa lượng trung bình hoạt chất (collagenase, caseinase, clostripain, trypsin hoạt động) Chúng thường dùng cho việc tách tế bào da, gan, phổi, mỡ tế bào mô thượng thận
- Collagenase loại II: chứa hợp chất clostripain nhiều hơn, sử dụng để tách tế bào từ tim, xương, sụn
- Collagenase loại III: có hoạt tính phân giải protein thấp
- Collagenase loại IV: có hoạt tính trypsin thấp, thường dùng phân tách tế bào tụy
Collagenase dispase phân cắt khơng hồn tồn cầu nối nên làm hư hại tế bào Người ta sử dụng hyaluronidase kết hợp với collagenase để phân hủy chất dịch nội bào, DNase sử dụng để phân hủy DNA thoát từ tế bào bị ly giải
Chymotrypsin có tính đặc hiệu trypsin, phân giải liên kết peptide tạo thành nhóm carboxyl acid amin thơm (như tyrosin, phenylalanin, tryptophan, methionin leucin) với nhóm amin acid amin khác Chymotrypsin có pH thích hợp từ – 9, bị ức chế DFB (di-isopropyl fluoro phosphate)
Papain thủy phân protein thành polypeptid acid amin Papain chịu nhiệt độ tương đối cao (dạng khơ khơng bị biến tính 1000C giờ), hoạt động pH từ 4,5 – 8,5 (tùy vào chất để lựa chọn độ pH thích hợp cho phản ứng) Papain bị kìm hãm chất oxy hóa oxy, ozone, hydroperoxyte, iod acetamid, thủy ngân chlobenzoate, cystin hợp chất disulfur khác
Elastase thủy phân số lượng lớn protein Elastase enzyme có khả thủy phân elastin, chất không bị tác động trypsin, chymotrypsin hay pepsin
Elastase thường sử dụng có kết hợp với enzyme khác collagenase, trypsin chymotrypsin Elastase enzyme chọn để tách tế bào từ phôi
c Tách tế bào bằng phương pháp khác
+ Phương pháp ly tâm theo gradient tỷ trọng: sử dụng để phân tách tinh trùng hay
(18)18 VD: Quy trình Ficolldùng để phân tách tế bào máu đơn nhân:
- Pha loãng máu (có chất chống đơng) lần với dung dịch đệm PBS
- Đặt 35 ml máu pha loãng lên 15ml Ficoll, ly tâm tốc độ 400g 20 phút 240C - Thu dịch nổi, huyền phù lượng dung dịch đệm
- Ly tâm lần tốc độ 500g 20 phút 240C - Thu cặn, huyền phù lượng dung dịch đệm - Bảo quản dịch huyền phù tế bào – 80C
+ Phương pháp tách tế bào dựa vào marker bề mặt (là receptor bề mặt tế bào):
được sử dụng để đánh dấu phân lập tế bào gốc Những tế bào gốc hoi chọn từ hàng triệu tế bào khác Dịch tế bào đính phân tử huỳnh quang vào receptor, tác dụng lực đẩy, dịch (có tế bào) qua đầu kim nhỏ, cho lần có tế bào Ở đầu kim nguồn ánh sáng, thường tia laser sau điện trường Những tế bào phát huỳnh quang mang điện tích âm, cịn tế bào khơng phát huỳnh quang mang điện tích dương Sự tích điện khác cho phép thu nhận tế bào cần
Mặc dù loại mơ có u cầu điều kiện tách khác nhau, cho dù mô nào, tách tế bào để nuôi cấy cần lưu ý số điểm sau:
- Các mô mỡ, mô chết, mô tạp phải loại bỏ q trình tách - Mơ nên cắt nhuyễn dụng cụ nhọn, bén để tránh hư hại tế bào
- Enzyme sử dụng trình tách tế bào, trước phải tách khỏi dung dịch (bằng ly tâm), hay phải bị bất hoạt (bằng huyết thanh)
- Nồng độ tế bào thu nhận cho nuôi cấy sơ cấp phải đảm bảo, đồng thời cao nồng độ tế bào nuôi cấy sau
- Hồi phục tế bào cách nuôi môi trường dinh dưỡng cao hay bổ sung huyết với nồng độ cao
- Phân tách tế bào từ mô non hay phôi nhanh hơn, hiệu cao hơn, tế bào thu nhiều hơn, sống tăng sinh mạnh so với mô trưởng thành
IV.1.3 Nuôi cấy thu nhận tế bào a Nuôi tế bào sơ cấp
Ly tâm dịch tách tế bào loại bỏ dịch nổi, thu cặn huyền phù tế bào đưa dịch huyền phù tế bào vào bình ni cấy (bình Roux), bổ sung môi trường ủ 37,50C tủ nuôi, sau 24 thay môi trường tiếp tục ủ
Sau lần nuôi cấy sơ cấp thu tế bào sơ cấp Thành phần tế bào sơ cấp phức tạp, bao gồm nhiều loại tế bào khác diện bình ni Để có dịng tế bào nhất, cần thực bước tiếp chọn dịng
b Ni cấy phát triển mảnh mơ sơ cấp
(19)19 Các mảnh mô thường nổi, hay lơ lửng môi trường nuôi cấy, thường bị chết nhanh không bám vào bề mặt ni Có thể bổ sung mơi trường để tăng bám dính mảnh mơ vào bề mặt dụng cụ nuôi cố định mẫu mô huyết tương/ huyết
Khi tế bào phát triển lan rộng từ rìa mảnh mô, tiến hành tách bỏ mẫu mô thu tế bào
c Cấy chuyền
Cấy chuyền cần để cung cấp chất dinh dưỡng khơng gian cho dịng tế bào phát triển liên tục Tần số tỷ lệ pha loãng, hay nồng độ tế bào cấy chuyền phụ thuộc vào đặc tính dịng Nếu dịng cấy chuyền thường xuyên hay nồng độ tế bào thấp, chúng bị
Cấy chuyền bao gồm thao tác sau: - Tách bỏ môi trường nuôi cấy cũ
- Rửa bề mặt giá thể ni (có tế bào bám) - Tách tế bào bám khỏi bề mặt dụng cụ nuôi - Pha lỗng tế bào mơi trường Cấy chuyền tế bào bám dính:
- Tách bỏ môi trường khỏi hộp nuôi Nếu tế bào bám chặt, đổ bỏ mơi trường Nếu nhiều tế bào hay bám yếu, nên lắc nhẹ rửa, sau làm lỏng bám dính tế bào dung dịch trypsin
- Rửa dụng cụ nuôi với PBS - Bổ sung dung dịch trypsin
- Ủ tủ ấm 370C chừng – phút (tùy kiểu tế bào kiểu ni) xem kính hiển vi: tế bào có hình trịn có nghĩa chúng tách khỏi bề mặt giá thể ni
- Huyền phù với mơi trường có bổ sung huyết thanh, rửa tế bào cách ly tâm 800 vòng/phút – 10 phút tái huyền phù mơi trường ni (bước bỏ tỷ lệ pha lỗng cao mơi trường có chứa huyết thanh)
Cấy chuyền tế bào huyền phù:
Nuôi cấy tế bào flask hay spinner trì việc pha lỗng lượng tương đương huyền phù tế bào môi trường tươi:
- Giữ flask đứng thẳng, dùng pipette huyền phù vài lần tách rời cụm tế bào
- Tách lấy lượng huyền phù để đếm pha loãng vào bình ni ly tâm thu cặn, loại bỏ dịch tái huyền phù cặn vón vào mơi trường tươi lấy thể tích tương đương lượng tế bào mong muốn vào bình ni tiến hành ni
IV.2 TẠO DÒNG TẾ BÀO
(20)20 Tái tạo dịng (recloning) cơng việc thiết lập lại đặc tính vốn có dịng, chúng bị biến đổi (bởi dòng tế bào thiết lập tạo biến đổi với đặc tính phù hợp hơn, mơi trường ni đó)
Nếu muốn thay đổi đặc tính tế bào thơng qua đột biến hay chuyển nhiễm, việc tạo dịng khơng cần thiết Do đó, tạo biến đổi quan trọng kiểu hình đặc biệt, sau vài hệ cấy chuyền
Trong môi trường nuôi cấy, tế bào riêng rẽ nguyên phân tạo nhiều tế bào Các tế bào quần tụ vị trí tế bào mẹ ban đầu, hình thành nên tập đoàn (colony) Như vậy, tế bào tập đồn có đặc tính kiểu gen kiểu hình, hay nói cách khác, chúng dòng
IV.2.1 Kỹ thuật chọn dòng tế bào Phương pháp tiến hành:
- Dùng dung dịch trypsin tách rời tế bào từ đĩa nuôi cấy, tạo huyền phù tế bào
- Cấy tế bào vào đĩa ni có mơi trường với mật độ thấp (để tế bào cách xa đĩa nuôi) Nuôi ủ tế bào chúng phát triển colony riêng rẽ
- Chọn colony tế bào cần tạo dịng, lập một ống kim loại nặng có kích thước phù hợp Hút bỏ môi trường ống tách tế bào từ colony trypsin, cấy sang đĩa môi trường
Nếu cần thiết thực bước chọn dòng vài lần đảm bảo thu dòng tế bào từ tế bào
Cấy chuyền tế bào - Đổ bỏ môi trường cũ
- Cho PBS vào bình Roux (-), lắc nhẹ để rửa tế bào chết huyết thanh, đổ bỏ PBS (-), lập lại lần
- Cho trypsin-EDTA cho vào bình Roux - Lắc nhẹ bình Roux
- Đổ bỏ trypsin, vỗ nhẹ bình Roux để tế bào tách khỏi vách bình Roux - Cho 2ml E’MEM vào bình Roux, tráng lên bề mặt bình Roux có tế bào - Hút vào bình Roux 5ml mơi trường E’MEM
- Dùng pipette hút sục môi trường phun vào bề mặt bình Roux có tế bào để tạo huyền phù
- Hút dịch huyền phù cho vào bình Roux mới, lắc nhẹ, ủ 37,50C tủ nuôi
- Sau 24 giờ, đổ bỏ môi trường cũ, cho môi trường vào để loại bỏ trypsin tế bào chết