Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen tạo rễ tơ ở sâm ngọc linh ( Panax vietnamensis) thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2KHOA SINH – KTNN ---∗∗∗--- VŨ THỊ HẠT NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU QUẢ CHUYỂN GEN TẠO RỄ TƠ Ở SÂM NGỌC LINH Panax vietnamensis THÔNG QUA VI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH – KTNN -∗∗∗ -

VŨ THỊ HẠT

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU QUẢ CHUYỂN GEN TẠO RỄ TƠ Ở SÂM NGỌC LINH

(Panax vietnamensis) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium rhizogenes

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI

HỌC Chuyên ngành: Sinh lí học thực vật

Người hướng dẫn khoa học: TS.PHẠM BÍCH NGỌC

Th.S LA VIỆT HỒNG

HÀ NỘI, 2012

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và

sâu sắc nhất đến TS Phạm Bích Ngọc - Viện Công nghệ sinh học và

ThS La Việt Hồng - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tận tình hướng

dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiệnkhóa luận tốt nghiệp

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Chu Hoàng HàTrưởng phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, TS LêVăn Sơn, đã tạo điều kiện cho em hoàn thành khóa luận này

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới CN Nguyễn Đình Trọngcùng toàn thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinhhọc đã tạo điều kiện làm việc, giúp đỡ và truyền đạt nhiều kinh nghiệm làmviệc quý báu trong suốt quá trình em hoàn thành khóa luận này

Và hơn hết, em xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, nhữngngười đã động viên và luôn bên em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Hà nội, ngày 10 tháng 5 năm 2012

Sinh viên

Vũ Thị Hạt

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan khóa luận: “Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến

hiệu quả chuyển gen tạo rễ tơ ở sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes” là kết quả nghiên cứu của riêng tôi

dưới sự hướng dẫn của TS Phạm Bích Ngọc- Viện Công nghệ sinh học vàThS La Việt Hồng – Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Hà nội, ngày 10 tháng 5 năm 2012

Sinh viên

Vũ Thị Hạt

2 Mục tiêu nghiên cứu 3

3 Yêu cầu của đề tài 3

4 Ý nghĩa của đề tài 3

NỘI DUNG

4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

41.1 Đặc điểm hình thái cây sâm Ngọc Linh 4

1.2 Tình hình nghiên cứu sinh khối tế bào thực vật

51.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

51.2.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

51.3 Cơ sở khoa học của phương pháp chuyển gen vào tế bào thực vật8

1.3.1 Các phương pháp chuyển gen trực tiếp

81.3.2 Các phương pháp chuyển gen gián tiếp

11

1.3.2.1 Giới thiệu vi khuẩn Agrobacterium

rhizogenes

12

1.3.2.2 Các yếu tố ảnh

hưởng đến hiệu quả

biến nạp gen thông

k2.1.2 Hóa 16

chất 16

2.1.3 Máy móc và thi ế t b ị 16

2.2 Phương pháp nghiên cứu 16

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 17

2.2.2 Phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacteriumrhizogenes 18

2.2.3 Phương pháp nhuộm X – gluc 19

C HƯƠN G 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Ảnh hưởng của kháng sinh diệt khuẩn lên sự sinh trưởng và phát 19 triển của mô sâm Ngọc Linh tự nhiên

3.2 Ảnh hưởng của điều kiện biến nạp lên sự sinh trưởng và phát triển 21 của mô sâm Ngọc Linh 22

3.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ khuẩn đến hiệu quả biến nạp 23

3.2.2 Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả biến nạp

3.3 Kiểm tra hiệu quả chuyển gen thông qua Agrobacteriumrhizogenes 25 vào mô sâm Ngọc Linh bàng phương pháp nhuộm X – gluc 27

K Ế T LU Ậ N VÀ KI Ế N NGH Ị 27

1 Kết luận 27

2 Ki ế n ngh ị 28

TÀI LI Ệ U THAM KH Ả O 28

Ti ế ng Vi ệ t 28

Ti ế ng Anh 29

Trang web tham kh ả o 30

PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG - BIỂU ĐỒ

Danh mục bảng Bảng 1.1 Các nghiên cứu tạo hoạt chất từ sinh khối rễ tơ

Bảng 2.1 Thành phần dung dịch nhuộm X-gluc

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của cacbe và cefo tới sinh trưởng của mô sâm Ngọc

Linh

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ khuẩn đến sự sống sót của mô sâm Ngọc

Linh

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng sống sót của

mô sâm Ngọc Linh

Danh mục biểu đồ Biểu đồ 3.1 Số mô Sâm Ngọc Linh sống sót sau 3 tuần trên môi trường chứa

cefotaxim với nồng độ khác nhau

Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ khuẩn đến số mô sâm Ngọc Linh sống

sót sau 4 ngày

Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng sống sót

của mô sâm Ngọc Linh

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh cây sâm Ngọc Linh

Hình 1.2 Sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro

Hình 1.3 Nuôi cấy rễ tơ G glabra

1 Đặt vấn đề

MỞ ĐẦU

Sâm Ngọc Linh (Panax

vietnamensis) là loại dược liệu hết sức

quý hiếm, chỉ phân bố ở vùng núi caotrong sơn hệ Ngọc Linh thuộc một số íthuyện của Kon Tum và Quảng Nam Vàonăm 1973, cây Sâm Ngọc Linh đầu tiênđược DS Đào Kim Long và các nhà khoahọc phát hiện ở độ cao 1800 m ở vùng núiNgọc Linh thuộc Kon Tum Tới năm 1988,

TS Hà Thị Dụng và GS Grushvisky đãxác định đây là một loài sâm mới trên thế

giới và đặt tên khoa học là Panax

vietnamensis Ha et Grushv, mà mọi người

thường gọi là sâm Việt Nam [10], [12]

Theo các nghiên cứu khoa học, sâmNgọc Linh có tác dụng chống trầm cảm,kích thích hệ miễm dịch, chống lão hóa,phòng chống ung thư, bảo vệ tế bào gan,tăng thị lực, sức đề kháng, nâng caohuyết áp ở người huyết áp thấp Hợpchất hóa học saponin chứa trong sâm NgọcLinh là thần dược với sức khỏe con ngườikhiến sâm Ngọc Linh hiện nay được bántrên thị trường với giá cao, vào năm 2005

và năm 2008 1kg tươi sâm Ngọc Linh –Quảng Nam có giá 12-15 triệu đồng, nhưnglúc khan hiếm có thể lên tới 25-30 triệuđồng; trong khi đó 1kg tươi sâm Triều

10

i) nghiên cứu nhân giống cây sâmNgọc Linh, nghiên cứu về điều kiệntrồng trọt Tuy nhiên việc nhân giốngsâm Ngọc linh ngoài tự nhiên rất khókhăn do hạt không đảm bảo tỉ lệ sốngsót và đặc tính di truyền.

11

ii)nghiên cứu nhân giống vô tính cây sâm Ngọc Linh thông qua kĩthuật phát sinh phôi vô tính Đây được xem là giải pháp tối ưu tạonguồn cung cấp cây giống sâm quanh năm, không những bảo tồn sâmNgọc Linh mà còn tiến tới sản xuất sâm Ngọc Linh thương phẩm vớiquy mô lớn Tuy nhiên thời gian nuôi trồng kéo dài cũng xảy ra tìnhtrạng sâm bị khai thác trộm trước thời gian được phép thu hoạch.

Do vậy các chế phẩm từ sâm Ngọc Linh cũng được sản xuất rất ít, thậmchí ngưng sản xuất vì thiếu nguồn nguyên liệu.Trước thực trạng trên một giảipháp tối ưu được đưa ra là tạo nguồn dược phẩm ổn định bằng công nghệ sinhkhối tế bào sâm Ngọc Linh [5]

Công nghệ sinh khối tế bào thực vật đơn giản là nuôi vô tính các dòng

tế bào để tạo khối lượng lớn sản phẩm có thể sử dụng cho việc tách chiết cáchoạt chất Quá trình này cũng bắt đầu từ việc tạo ra mô sẹo từ những tế bào,

mô đã bị biệt hóa ở thực vật, sau đó chúng được làm giảm hoặc mất tính biệthóa và được thuần hóa trên môi trường nuôi cấy và cuối cùng là tăng khốilượng trên hệ thống các bình nuôi cấy lớn (Bioreactor)

Trong quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật nhằm giảm hoặcmất tính biệt hóa ở các mô tế bào nuôi cấy cần thiết phải bổ sung các chấtđiều tiết sinh trưởng vào trong môi trường nuôi cấy Vấn đề này là một trongcác trở ngại lớn làm nản lòng các nhà nghiên cứu do tồn dư của các chất điềutiết sinh trưởng trong sinh khối tế bào nuôi cấy ảnh hưởng trực tiếp đến sảnphẩm và sức khỏe người sử dụng Tuy nhiên việc này hoàn toàn có thể khắcphục trong nuôi cấy sinh khối từ rễ tơ

Rễ tơ là một bệnh ở thực vật được gây ra bởi quá trình tương tác giữa

vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes và tế bào vật chủ Điều đặc biệt là rễ tơ

có thể sinh trưởng, phát triển tốt trên môi trường không cần bổ sung các chấtđiều hòa sinh trưởng vì thế loại bỏ được dư lượng của các chất này trong sản

phẩm tạo ra Hơn nữa các rễ tơ có khả năng sinh trưởng nhanh, phân nhánhcao, kĩ thuật nuôi cấy và chuyển gen dễ dàng và có thể được nuôi cấy tạo sinhkhối liên tục, điều này có ý nghĩa trong dây chuyền sản xuất các chất thứ cấphay các dược phẩm sinh học tái tổ hợp [11] Xuất phát từ những lý do trên tôi

đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả

chuyển gen tạo rễ tơ ở sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình chuyển gen tạo rễ

tơ ở sâm Ngọc Linh thông qua chủng vi khuẩn A rhizogenes ATCC15834.

3 Yêu cầu của đề tài

- Sử dụng chủng vi khuẩn A rhizogenes ATCC15834 biến nạp vào cây sâm

Ngọc Linh

- Xác định ảnh hưởng của một số chất kháng sinh và một số điều kiện biếnnạp tới hiệu quả chuyển gen tạo rễ tơ ở sâm Ngọc Linh

4 Ý nghĩa của đề tài

- Ý nghĩa khoa học: Cung cấp một phương pháp mới trong nghiên cứu sản

xuất sinh khối sâm Ngọc Linh quy mô phòng thí nghiệm

- Ý nghĩa thực tiễn: Cung cấp tài liệu nghiên cứu về ảnh hưởng của một số

yếu tố (chất kháng sinh, nồng độ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes, thời

gian đồng nuôi cấy ) tới khả năng tạo rễ tơ ở sâm Ngọc Linh thông qua vi

khuẩn A rhizogenes.

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm hình thái cây sâm Ngọc Linh

Sâm Ngọc Linh cùng họ Araliaceae, cùng chi Panax với sâm TriềuTiên, thuộc loại cây thân thảo, cao 80 - 100 cm Thân rễ nằm ngang trên hoặcdưới mặt đất độ 1 - 3 cm, mang rễ con và củ Thân rễ có sẹo, nhiều đốt Cácthân mang lá

Tương ứng với một thân mang lá là một đốt dài khoảng 0,5 - 0,7 cm.Trên đỉnh của thân mang lá là các lá mọc vòng, có 5 - 7 lá chét với phiến láhình trứng ngược Hoa mọc giữa các lá thẳng với thân Quả dài độ0,8 - 1,0 cm, rộng khoảng 0,5 - 0,6 cm, màu đỏ khi chín Cây mọc dưới tánrừng Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là thân rễ củ, cũng có thể dùng lá và rễcon [12]

Hình 1.1 Hình ảnh cây sâm

Ngọc Linh (Panax vietnamensis)

theo www.vncreatures.net

Hình 1.2 Sâm Ngọc Linh

trong nuôi cấy in vitro

Rễ củ sâm Ngọc Linh chứa tới 50 loại saponin (sâm triều Tiên cókhoảng 25 loại saponin) và cập nhật những kết quả nghiên cứu mới nhất chothấy danh sách saponin của sâm Ngọc Linh lên tới 52 loại Như vậy, sâm ViệtNam là một trong những loại sâm có hàm lượng saponin nhiều nhất, tương tự

một số cây sâm quý đã từng được nghiên cứu sử dụng từ lâu trên thế giới.Riêng trong lá sâm Ngọc Linh cũng đã phân lập được 13 chất saponin [9].

Thời gian sinh trưởng loại cây này chậm, cần tới 5 năm mới có thể bắtđầu thu hoạch được củ sâm và cần tới 7 - 10 năm mới thu được sâm chấtlượng tốt

1.2 Tình hình nghiên cứu sinh khối tế bào thực vật

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Những năm gần đây cùng với xu hướng chung trên thế giới, ở nước tahướng nghiên cứu công nghệ sinh khối tế bào thực vật để sản sản xuất các sảnphẩm thứ cấp đã bắt đầu được quan tâm đầu tư phát triển

Trong nỗ lực tạo nguồn dược phẩm ổn định từ sâm Ngọc Linh phải kểđến thành công của nhóm nghiên cứu của Học Viện Quân Y trong nghiên cứutạo sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh Nhóm nghiên cứu đã hoàn thiện quytrình tạo khối tế bào sâm Ngọc Linh từ giai đoạn nuôi cấy tạo mô sẹo đếnnuôi cấy trong Bioreator 15 lít

Tại Việt Nam, cũng đã có một số tác giả nghiên cứu thành công tạo rễbất định từ mô sẹo và nhân sinh khối rễ đó để thu hoạch Nghiên cứu chỉ rathời gian thu hoạch được rễ sâm Ngọc Linh như trên chỉ mất khoảng bốntháng mà vẫn đảm bảo được hàm lượng saponin thiết yếu của sâm

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Trên thế giới công nghệ sinh khối tế bào thực vật dựa trên cơ sở tínhtoàn năng và tính biệt hóa của tế bào thực vật đã được ứng dụng rộng rãitrong nhiều lĩnh vực: dược phẩm, sản phẩm chức năng, chất phụ gia thựcphẩm, nông nghiệp, lâm nghiệp, vừa tạo ra ngyên liệu, vừa giúp bảo tồnnguồn gen quý hiếm

Cho đến nay, rất nhiều hoạt chất nguồn gốc thực vật có giá trị kinh tếcao là sản phẩm của sinh khối tế bào thực vật:

(i) các hoạt chất dùng trong dược phẩm như caffein thu được từ nuôi

cấy tế bào Coffea arabica, betalain từ mô sẹo củ cải đường, berberin từ cây Coptis japonica (loài cây này phải trồng từ 4-6 năm mới thu được

hàm lượng Berberin đáng kể trong rễ, trong khi hàm lượng này có thểthu được sau 4 tuần nuôi cấy)

(ii)các chất khác dùng trong thực phẩm bao gồm các chất tạo màu(Anthocyanin,crocin), các chất tạo mùi (vani, mùi hành, và mùi tỏi).(iii) các chất khác như shikonin – chất có khả năng diệt khuẩn vàPaclitaxel Một ví dụ điển hình về ứng dụng hệ thống bioreactor

10 000 lít trong sản xuất reserpine trong thời gian 30 ngày, tươngđương với lượng hàng năm cả thế giới thu được từ cây rễ đó

Với nhân sâm đã có rất nhiều các nghiên cứu về tạo sinh khối sâm từhuyền phù, mô sẹo, từ nuôi cấy rễ hay rễ tơ để thu hoạch các hoạt chất quý.Hiện nay, một số nước tiêu thụ và xuất khẩu sâm lớn như Nhật Bản, HànQuốc, Trung Quốc đã ứng dụng nuôi cấy sinh khối tế bào từ nhân sâm trongsản xuất các sản phẩm chức năng hay làm thuốc bổ, thuốc phòng chống bệnhtim mạch, chống gốc tự do, tăng cường chức năng hệ thần kinh trung ương,các loại mỹ phẩm

Tại Hàn Quốc, một số công ty đang sản xuất rễ tơ Nhân sâm vớibioreactor có dung tích 10.000 đến 20.000 lít Sản phẩm này được làmnguyên liệu cho các dạng thực phẩm chức năng và thực phẩm khác nhau trênthị trường Đã có rất nhiều nghiên cứu thành công trong tạo các hoạt chất từnuôi cấy sinh khối rễ tơ [4]

Bảng 1.1 Các nghiên cứu tạo hoạt chất từ sinh khối rễ tơ

Apocynaceae Rauwolfia

micrantha

Ajmalicin, Ajmalin Hạ huyết áp

Fabaceae Pueraria

phaseoloides Puerarin

Hạ nhiệt, co thắt, hạ áp,chống loạn nhịp

Ginkgoaceae Gingko biloba Ginkgolid Phòng chống bệnh tim

mạch và tuổi già

Nyssaceae Camptotheca

acuminate Camptothecin

Kháng ung thư, khángvirus

Hình 1.3 Nuôi cấy rễ tơ G.glabra

a: Nuôi cấy rễ tơ bằng hệ thống

bioreactor

b,c: thu hoạch sinh khối rễ sau 30

ngày nuôi cấy

(theo http://www.ejbiotechnology.info/content/vol11/issue2/full/6)

1.3 Cơ sở khoa học của phương pháp chuyển gen vào tế bào thực vật

Kĩ thuật chuyển gen ở thực vật là kĩ thuật đưa một hoặc nhiều gen lạvào hệ gen của tế bào chủ Trong tế bào chủ, gen lạ hoạt động tổng hợpnên các protein đặc trưng, từ đó xuất hiện đặc tính mới của cơ thể đã mang

gen chuyển.Nhiều phương pháp khác nhau đã được áp dụng để đưa gen vào tế bàođộng vật và thực vật Kĩ thuật đơn giản nhất là chuyển DNA trần bằng vi tiêm(micro injection), xung điện (electroporation), súng bắn gen các phương phápphức tạp và hiệu quả hơn bao gồm sử dụng các phức hợp lipid - DNA(liposome), vector vius, tế bào gốc phôi, chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩnAgrobacterium…Tùy thuộc vào đối tượng chuyển gen mà người ta lựa chọnphương pháp chuyển gen phù hợp [6]

1.3.1 Các phương pháp chuyển gen trực tiếp

Chuyển gen nhờ kĩ thuật siêu âm ( mild sonication)

Kỹ thuật siêu âm dùng để chuyển gen trực tiếp vào các tế bào trần.Huyền phù tế bào trần được trộn với các plasmid tái tổ hợp mang gen mongmuốn và gen chọn lọc Sau đó, cắm đầu siêu âm của máy phát siêu âm ngậptrong huyền phù tế bào trần 3 mm Cho máy phát siêu âm với tần số 20 kHztheo từng nhịp ngắn 110 mili giây Tổng thời gian tác động khoảng 500- 900mili giây Tế bào trần sau khi xử lý siêu âm được nuôi trong các môi trườngchọn lọc để tách các tế bào đã nhận được DNA và tái sinh thành cây [2]

Chuyển gen nhờ kĩ thuật xung điện (electroporation)

Trong công nghệ di truyền thực vật, người ta sử dụng phương phápxung điện để chuyển gen vào protoplast thực vật Ở điện thế cao, trong thờigian ngắn có thể tạo ra các lỗ trên màng tế bào trần (protoplast) làm cho DNAbên ngoài có thể xâm nhập vào bên trong tế bào Người ta chuẩn bị môt huyềnphù protoplast với các plasmid tái tổ hợp đã mang gen mong muốn cầnchuyển vào thực vật

Dùng thiết bị điện xung tạo điện thế cao (200- 400 V/cm) trong khoảngthời gian 4-5 phần nghìn giây Kết quả làm màng tế bào trần xuất hiện các lỗthủng tạm thời giúp cho plasmid tái tổ hợp có thể xâm nhập gắn vào hệ gencủa thực vật Quá trình được thực hiện trong cuvet chuyên dụng Sau quátrình xung điện, đem protoplast nuôi trong môi trường chọn lọc để tách các

protoplast đã được biến nạp Tiếp theo là nuôi cấy in vitro, tái sinh cây và

chọn lọc cây chuyển gen [6]

Chuyển gen bằng súng bắn gen (gene gun)

Bắn gen là phương pháp linh hoạt để chuyển gen vào nhân, ty thể vàlục lạp, mở ra rất nhiều triển vọng đối với việc chuyển gen vào các cây một lámầm và các cây hạt trần, các đối tượng thực vật mà việc tạo ra cây chuyển

gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium không hiệu quả Phương pháp này cho

phép chuyển gen vào hầu hết các mô, cơ quan thực vật, không chỉ ở cây môhình mà ở ngay cả những cây giá trị

Nguyên tắc chung của phương pháp này là ngâm các viên đạn nhỏ (viđạn) bằng vàng hoặc tungsten có kích thước cực nhỏ, đường kính khoảng 0,5– 1,5 µm với dung dịch có chứa đoạn DNA ngoại lai cần chuyển vào tế bàothực vật Các vi đạn này được làm khô trên một đĩa kim loại mỏng có kíchthước 0,5- 0,9 cm Đĩa kim loại này được gắn vào một đầu viên đạn lớn(macroprojectile) bằng nhựa, hoặc vật liệu nhẹ Viên đạn lớn có kích thướcvừa khít đầu nòng súng bắn gen Khi bắn, áp suất hơi sẽ đẩy viên đạn lớn đivới vận tốc cao Tới đầu nòng súng, viên đạn lớn sẽ bị cản lại bởi một lướithép mịn, còn các viên đạn nhỏ (vi đạn) vẫn tiếp tục di chuyển với vận tốc lớntới 130m/s đến đối tượng bắn rồi xuyên vào tế bào Sau khi bắn, tách các mô,

tế bào và nuôi cấy in vitro để tái sinh cây Gen cần chuyển có thể tham gia

vào bộ gen của tế bào Mục tiêu của công tác chọn tạo giống bằng chuyển gen

là phải chọn lọc được các thể có mặt các gen chuyển vào nằm trong bộ gen

của tế bào Có như vậy thì đặc tính này mới có thể di truyền lại cho các thế hệsau Việc chọn lọc này rất công phu và khó khăn Gần đây, người ta đã cải tiếnsúng bắn gen theo hướng không sử dụng viên đạn lớn mà sử dụng bộ phận nénkhí mạnh tạo áp lực đẩy vi đạn Thường sử dụng luồng khí Heli áp lực cao.Việc chuyển gen bằng súng bắn gen có thuận lợi do dễ tiến hành và đặc biệtđối tượng nhận gen có thể đa dạng (ở mô, phôi, tế bào và tế bào trần) [6].

Chuyển gen bằng phương pháp hóa học

Chuyển gen bằng phương pháp hóa học là phương pháp chuyển genvào tế bào protoplast nhờ các chất hóa học như polyethylen glycol (PEG) Ởnồng độ cao, PEG làm DNA cần biến nạp không còn ở trạng thái hòa tan nữa

mà kết dính lại trên màng sinh chất Sau đó, bằng cách loại bỏ PEG và xử lýnồng độ cao của Ca2+ hoặc ở nồng độ pH cao, DNA biến nạp sẽ được chuyểnnạp vào trong tế bào trần [6]

Chuyển gen trực tiếp qua ống phấn (pollen tube)

Phương pháp chuyển gen qua ống phấn là phương pháp chuyển genkhông qua nuôi cấy in vitro Phương pháp chuyển gen qua ống phấn đượcRay Wu và các cộng sự ở trường Đại học Cornell (Mỹ ) đề xuất năm 1998trên đối tượng cây lúa Nguyên tắc của phương pháp là DNA ngoại lai chuyểnvào cây theo đường ống phấn, chui vào bầu nhụy cái Thời gian chuyển gen làvào lúc hạt phấn mọc qua vòi nhụy và bắt đầu đưa tinh trùng vào thụ tinh

Theo các tác giả cho biết tốt nhất là sự chuyển gen xảy ra đúng khi quátrình thụ tinh ở noãn và cho tế bào hợp tử chưa phân chia Như vậy sự chuyểngen chỉ xảy ra ở một tế bào sinh dục cái duy nhất và khi tái sinh cây sẽ khônghình thành thể khảm [2]

Chuyển gen bằng vi tiêm (micro injection)

Phương pháp chuyển gen nhờ vi tiêm là phương pháp sử dụng các thiết

bị hiển vi và máy vi nhu động để chuyển gen trực tiếp vào tế bào Kĩ thuật

này có ưu điểm là: lượng DNA được biến nạp là tùy ý và xác định, DNAđược đưa vào đúng vị trí mong muốn, thậm chí là nhân tế bào Có thể áp dụngđối với các tế bào có kích thước nhỏ bé như hạt phấn, phôi non mà các kĩthuật khác không thể thực hiện được và có thể biến nạp vào các loài câytrồng, có thể thực hiện nuôi cấy riêng rẽ các tế bào vi tiêm Tuy nhiên phươngpháp này tốn nhiều thời gian và công sức do mỗi lần biến nạp chỉ đưa đượcDNA vào một tế bào duy nhất và chỉ có thể thực hiện bởi các kĩ thuật viên có

kĩ năng cao với những thiết bị tương đối đắt tiền [6]

1.3.2 Các phương pháp chuyển gen gián tiếp

Chuyển gen nhờ virus

Virus được sử dụng làm vector chuyển gen cho cây trồng do rất dễ xâmnhập và lây lan trong cơ thể thực vật Tuy nhiên để trở thành vector chuyểngen thì virus cần có những tiêu chuẩn sau:

 Genome virus là DNA chứ không phải RNA

 Có khả năng di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác qua các lỗ thành tế bào

 Có khả năng tải được các đoạn DNA gắn vào

 Có phổ kí chủ rộng

 Không gây hại hoặc gây hại không đáng kể

Tuy nhiên hiện nay, việc chuyển gen nhờ virus rất ít được sử dụng, dovirus về nguyên tắc không truyền qua hạt do vậy việc nhân giống các câychuyển gen nhờ virus phải tiến hành bằng phương pháp vô tính Điều nàykhông phải thực hiện được với tất cả các loài cây Đây chính là một nhượcđiểm lớn của phương pháp chuyển gen bằng virus [6]

Phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium

Trong phương pháp này, DNA ngoại lai được chuyển vào tế bào thựcvật nhờ cơ chế đặc trưng thông qua loài vi khuẩn đất gram (-) làAgrobacterium làm trung gian [6]