Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen tạo rễ tơ ở sâm ngọc linh ( panax vietnamensis) thông qua vi khuẩn agrobacterium rhizogenes

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH – KTNN ------ VŨ THỊ HẠT NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU QUẢ CHUYỂN GEN TẠO RỄ TƠ Ở SÂM NGỌC LINH Panax vietnamensis THÔNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH – KTNN - -

VŨ THỊ HẠT

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU QUẢ CHUYỂN GEN

TẠO RỄ TƠ Ở SÂM NGỌC LINH

(Panax vietnamensis) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium rhizogenes

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lí học thực vật

TS.PHẠM BÍCH NGỌC Th.S LA VIỆT HỒNG

HÀ NỘI, 2012

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và

sâu sắc nhất đến TS Phạm Bích Ngọc - Viện Công nghệ sinh học và

ThS La Việt Hồng - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tận tình hướng

dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Chu Hoàng Hà Trưởng phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, TS Lê Văn Sơn, đã tạo điều kiện cho em hoàn thành khóa luận này

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới CN Nguyễn Đình Trọng cùng toàn thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện làm việc, giúp đỡ và truyền đạt nhiều kinh nghiệm làm việc quý báu trong suốt quá trình em hoàn thành khóa luận này

Và hơn hết, em xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, những người đã động viên và luôn bên em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Hà nội, ngày 10 tháng 5 năm 2012

Sinh viên

Vũ Thị Hạt

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan khóa luận: “Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến

hiệu quả chuyển gen tạo rễ tơ ở sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes” là kết quả nghiên cứu của riêng tôi

dưới sự hướng dẫn của TS Phạm Bích Ngọc- Viện Công nghệ sinh học và ThS La Việt Hồng – Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Hà nội, ngày 10 tháng 5 năm 2012

Sinh viên

Vũ Thị Hạt

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG - BIỂU ĐỒ

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

2 Mục tiêu nghiên cứu

3 Yêu cầu của đề tài

4 Ý nghĩa của đề tài

NỘI DUNG

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đặc điểm hình thái cây sâm Ngọc Linh

1.2 Tình hình nghiên cứu sinh khối tế bào thực vật

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

1.3 Cơ sở khoa học của phương pháp chuyển gen vào tế bào thực vật 1.3.1 Các phương pháp chuyển gen trực tiếp

1.3.2 Các phương pháp chuyển gen gián tiếp

1.3.2.1 Giới thiệu vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

1.3.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp gen thông qua Agrobacterium rhizogenes

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị

2.1.1 vật liệu

1

1

3

3

3

4

4

4

5

5

5

8

8

11

12

14

16

16

16

k2.1.2 Hóa

chất

2.1.3 Máy móc và thiết bị

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.2.2 Phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacteriumrhizogenes

2.2.3 Phương pháp nhuộm X – gluc

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Ảnh hưởng của kháng sinh diệt khuẩn lên sự sinh trưởng và phát triển của mô sâm Ngọc Linh tự nhiên

3.2 Ảnh hưởng của điều kiện biến nạp lên sự sinh trưởng và phát triển của mô sâm Ngọc Linh

3.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ khuẩn đến hiệu quả biến nạp

3.2.2 Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả biến nạp

3.3 Kiểm tra hiệu quả chuyển gen thông qua Agrobacteriumrhizogenes vào mô sâm Ngọc Linh bàng phương pháp nhuộm X – gluc

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1 Kết luận

2 Kiến nghị

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

Tiếng Anh

Trang web tham khảo

PHỤ LỤC

16

16

16

16

17

18

19

19

21

22

23

25

27

27

27

28

28

28

29

30

DANH MỤC BẢNG - BIỂU ĐỒ

Danh mục bảng Bảng 1.1 Các nghiên cứu tạo hoạt chất từ sinh khối rễ tơ

Bảng 2.1 Thành phần dung dịch nhuộm X-gluc

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của cacbe và cefo tới sinh trưởng của mô sâm Ngọc

Linh

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ khuẩn đến sự sống sót của mô sâm Ngọc

Linh

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng sống sót của

mô sâm Ngọc Linh

Danh mục biểu đồ Biểu đồ 3.1 Số mô Sâm Ngọc Linh sống sót sau 3 tuần trên môi trường chứa

cefotaxim với nồng độ khác nhau

Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ khuẩn đến số mô sâm Ngọc Linh sống

sót sau 4 ngày

Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng sống sót

của mô sâm Ngọc Linh

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh cây sâm Ngọc Linh

Hình 1.2 Sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro

Hình 1.3 Nuôi cấy rễ tơ G glabra

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) là loại dược liệu hết sức quý

hiếm, chỉ phân bố ở vùng núi cao trong sơn hệ Ngọc Linh thuộc một số ít huyện của Kon Tum và Quảng Nam Vào năm 1973, cây Sâm Ngọc Linh đầu tiên được DS Đào Kim Long và các nhà khoa học phát hiện ở độ cao 1800 m

ở vùng núi Ngọc Linh thuộc Kon Tum Tới năm 1988, TS Hà Thị Dụng và

GS Grushvisky đã xác định đây là một loài sâm mới trên thế giới và đặt tên

khoa học là Panax vietnamensis Ha et Grushv, mà mọi người thường gọi là

sâm Việt Nam [10], [12]

Theo các nghiên cứu khoa học, sâm Ngọc Linh có tác dụng chống trầm cảm, kích thích hệ miễm dịch, chống lão hóa, phòng chống ung thư, bảo vệ tế bào gan, tăng thị lực, sức đề kháng, nâng cao huyết áp ở người huyết áp thấp Hợp chất hóa học saponin chứa trong sâm Ngọc Linh là thần dược với sức khỏe con người khiến sâm Ngọc Linh hiện nay được bán trên thị trường với giá cao, vào năm 2005 và năm 2008 1kg tươi sâm Ngọc Linh – Quảng Nam có giá 12-15 triệu đồng, nhưng lúc khan hiếm có thể lên tới 25-30 triệu đồng; trong khi đó 1kg tươi sâm Triều Tiên chỉ có giá khoảng 4 triệu đồng [15] Hiện nay 1kg sâm Ngọc Linh có giá lên tới 60 triệu đồng Do lợi ích quá lớn sâm Ngọc Linh trở thành đối tượng săn tìm của con người và hậu quả dẫn tới năm 1993 sâm Ngọc Linh được xếp đầu bảng trong sách đỏ thực vật Việt Nam có nguy cơ tuyệt chủng Chính vì vậy mà có nhiều đề tài khoa học được thực hiện với mục đích bảo tồn và phát triển sâm Ngọc Linh như:

i) nghiên cứu nhân giống cây sâm Ngọc Linh, nghiên cứu về điều kiện trồng trọt Tuy nhiên việc nhân giống sâm Ngọc linh ngoài tự nhiên rất khó khăn do hạt không đảm bảo tỉ lệ sống sót và đặc tính di truyền

ii) nghiên cứu nhân giống vô tính cây sâm Ngọc Linh thông qua kĩ thuật phát sinh phôi vô tính Đây được xem là giải pháp tối ưu tạo nguồn cung cấp cây giống sâm quanh năm, không những bảo tồn sâm Ngọc Linh mà còn tiến tới sản xuất sâm Ngọc Linh thương phẩm với quy mô lớn Tuy nhiên thời gian nuôi trồng kéo dài cũng xảy ra tình trạng sâm bị khai thác trộm trước thời gian được phép thu hoạch

Do vậy các chế phẩm từ sâm Ngọc Linh cũng được sản xuất rất ít, thậm chí ngưng sản xuất vì thiếu nguồn nguyên liệu.Trước thực trạng trên một giải pháp tối ưu được đưa ra là tạo nguồn dược phẩm ổn định bằng công nghệ sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh [5]

Công nghệ sinh khối tế bào thực vật đơn giản là nuôi vô tính các dòng

tế bào để tạo khối lượng lớn sản phẩm có thể sử dụng cho việc tách chiết các hoạt chất Quá trình này cũng bắt đầu từ việc tạo ra mô sẹo từ những tế bào,

mô đã bị biệt hóa ở thực vật, sau đó chúng được làm giảm hoặc mất tính biệt hóa và được thuần hóa trên môi trường nuôi cấy và cuối cùng là tăng khối lượng trên hệ thống các bình nuôi cấy lớn (Bioreactor)

Trong quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật nhằm giảm hoặc mất tính biệt hóa ở các mô tế bào nuôi cấy cần thiết phải bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng vào trong môi trường nuôi cấy Vấn đề này là một trong các trở ngại lớn làm nản lòng các nhà nghiên cứu do tồn dư của các chất điều tiết sinh trưởng trong sinh khối tế bào nuôi cấy ảnh hưởng trực tiếp đến sản phẩm và sức khỏe người sử dụng Tuy nhiên việc này hoàn toàn có thể khắc phục trong nuôi cấy sinh khối từ rễ tơ

Rễ tơ là một bệnh ở thực vật được gây ra bởi quá trình tương tác giữa

vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes và tế bào vật chủ Điều đặc biệt là rễ tơ

có thể sinh trưởng, phát triển tốt trên môi trường không cần bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng vì thế loại bỏ được dư lượng của các chất này trong sản

phẩm tạo ra Hơn nữa các rễ tơ có khả năng sinh trưởng nhanh, phân nhánh cao, kĩ thuật nuôi cấy và chuyển gen dễ dàng và có thể được nuôi cấy tạo sinh khối liên tục, điều này có ý nghĩa trong dây chuyền sản xuất các chất thứ cấp hay các dược phẩm sinh học tái tổ hợp [11] Xuất phát từ những lý do trên tôi

đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả

chuyển gen tạo rễ tơ ở sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình chuyển gen tạo rễ

tơ ở sâm Ngọc Linh thông qua chủng vi khuẩn A rhizogenes ATCC15834

3 Yêu cầu của đề tài

- Sử dụng chủng vi khuẩn A rhizogenes ATCC15834 biến nạp vào cây

sâm Ngọc Linh

- Xác định ảnh hưởng của một số chất kháng sinh và một số điều kiện biến nạp tới hiệu quả chuyển gen tạo rễ tơ ở sâm Ngọc Linh

4 Ý nghĩa của đề tài

- Ý nghĩa khoa học: Cung cấp một phương pháp mới trong nghiên cứu sản xuất sinh khối sâm Ngọc Linh quy mô phòng thí nghiệm

- Ý nghĩa thực tiễn: Cung cấp tài liệu nghiên cứu về ảnh hưởng của

một số yếu tố (chất kháng sinh, nồng độ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes,

thời gian đồng nuôi cấy ) tới khả năng tạo rễ tơ ở sâm Ngọc Linh thông qua

vi khuẩn A rhizogenes

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm hình thái cây sâm Ngọc Linh

Sâm Ngọc Linh cùng họ Araliaceae, cùng chi Panax với sâm Triều

Tiên, thuộc loại cây thân thảo, cao 80 - 100 cm Thân rễ nằm ngang trên hoặc

dưới mặt đất độ 1 - 3 cm, mang rễ con và củ Thân rễ có sẹo, nhiều đốt Các

thân mang lá

Tương ứng với một thân mang lá là một đốt dài khoảng 0,5 - 0,7 cm

Trên đỉnh của thân mang lá là các lá mọc vòng, có 5 - 7 lá chét với phiến lá

hình trứng ngược Hoa mọc giữa các lá thẳng với thân Quả dài độ 0,8 - 1,0 cm, rộng khoảng 0,5 - 0,6 cm, màu đỏ khi chín Cây mọc dưới tán

rừng Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là thân rễ củ, cũng có thể dùng lá và rễ

trong nuôi cấy in vitro

Rễ củ sâm Ngọc Linh chứa tới 50 loại saponin (sâm triều Tiên có

khoảng 25 loại saponin) và cập nhật những kết quả nghiên cứu mới nhất cho

thấy danh sách saponin của sâm Ngọc Linh lên tới 52 loại Như vậy, sâm Việt

Nam là một trong những loại sâm có hàm lượng saponin nhiều nhất, tương tự

một số cây sâm quý đã từng được nghiên cứu sử dụng từ lâu trên thế giới Riêng trong lá sâm Ngọc Linh cũng đã phân lập được 13 chất saponin [9]

Thời gian sinh trưởng loại cây này chậm, cần tới 5 năm mới có thể bắt đầu thu hoạch được củ sâm và cần tới 7 - 10 năm mới thu được sâm chất lượng tốt

1.2 Tình hình nghiên cứu sinh khối tế bào thực vật

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Những năm gần đây cùng với xu hướng chung trên thế giới, ở nước ta hướng nghiên cứu công nghệ sinh khối tế bào thực vật để sản sản xuất các sản phẩm thứ cấp đã bắt đầu được quan tâm đầu tư phát triển

Trong nỗ lực tạo nguồn dược phẩm ổn định từ sâm Ngọc Linh phải kể đến thành công của nhóm nghiên cứu của Học Viện Quân Y trong nghiên cứu tạo sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh Nhóm nghiên cứu đã hoàn thiện quy trình tạo khối tế bào sâm Ngọc Linh từ giai đoạn nuôi cấy tạo mô sẹo đến nuôi cấy trong Bioreator 15 lít

Tại Việt Nam, cũng đã có một số tác giả nghiên cứu thành công tạo rễ bất định từ mô sẹo và nhân sinh khối rễ đó để thu hoạch Nghiên cứu chỉ ra thời gian thu hoạch được rễ sâm Ngọc Linh như trên chỉ mất khoảng bốn tháng mà vẫn đảm bảo được hàm lượng saponin thiết yếu của sâm

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Trên thế giới công nghệ sinh khối tế bào thực vật dựa trên cơ sở tính toàn năng và tính biệt hóa của tế bào thực vật đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: dược phẩm, sản phẩm chức năng, chất phụ gia thực phẩm, nông nghiệp, lâm nghiệp, vừa tạo ra ngyên liệu, vừa giúp bảo tồn nguồn gen quý hiếm

Cho đến nay, rất nhiều hoạt chất nguồn gốc thực vật có giá trị kinh tế cao là sản phẩm của sinh khối tế bào thực vật:

(i) các hoạt chất dùng trong dược phẩm như caffein thu được từ nuôi

cấy tế bào Coffea arabica, betalain từ mô sẹo củ cải đường, berberin từ cây Coptis japonica (loài cây này phải trồng từ 4-6 năm mới thu được

hàm lượng Berberin đáng kể trong rễ, trong khi hàm lượng này có thể thu được sau 4 tuần nuôi cấy)

(ii) các chất khác dùng trong thực phẩm bao gồm các chất tạo màu (Anthocyanin,crocin), các chất tạo mùi (vani, mùi hành, và mùi tỏi) (iii) các chất khác như shikonin – chất có khả năng diệt khuẩn và Paclitaxel Một ví dụ điển hình về ứng dụng hệ thống bioreactor

10 000 lít trong sản xuất reserpine trong thời gian 30 ngày, tương đương với lượng hàng năm cả thế giới thu được từ cây rễ đó

Với nhân sâm đã có rất nhiều các nghiên cứu về tạo sinh khối sâm từ huyền phù, mô sẹo, từ nuôi cấy rễ hay rễ tơ để thu hoạch các hoạt chất quý Hiện nay, một số nước tiêu thụ và xuất khẩu sâm lớn như Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc đã ứng dụng nuôi cấy sinh khối tế bào từ nhân sâm trong sản xuất các sản phẩm chức năng hay làm thuốc bổ, thuốc phòng chống bệnh tim mạch, chống gốc tự do, tăng cường chức năng hệ thần kinh trung ương, các loại mỹ phẩm

Tại Hàn Quốc, một số công ty đang sản xuất rễ tơ Nhân sâm với bioreactor có dung tích 10.000 đến 20.000 lít Sản phẩm này được làm nguyên liệu cho các dạng thực phẩm chức năng và thực phẩm khác nhau trên thị trường Đã có rất nhiều nghiên cứu thành công trong tạo các hoạt chất từ nuôi cấy sinh khối rễ tơ [4]

Bảng 1.1 Các nghiên cứu tạo hoạt chất từ sinh khối rễ tơ

Apocynaceae Rauwolfia

micrantha

Ajmalicin, Ajmalin Hạ huyết áp

phaseoloides Puerarin

Hạ nhiệt, co thắt, hạ áp, chống loạn nhịp

Ginkgoaceae Gingko biloba Ginkgolid Phòng chống bệnh tim

mạch và tuổi già

Nyssaceae Camptotheca

acuminate Camptothecin

Kháng ung thư, kháng virus

Hình 1.3 Nuôi cấy rễ tơ G.glabra

a: Nuôi cấy rễ tơ bằng hệ thống

bioreactor

b,c: thu hoạch sinh khối rễ sau 30

ngày nuôi cấy

(theo http://www.ejbiotechnology.info/content/vol11/issue2/full/6)

1.3 Cơ sở khoa học của phương pháp chuyển gen vào tế bào thực vật

Kĩ thuật chuyển gen ở thực vật là kĩ thuật đưa một hoặc nhiều gen lạ vào

hệ gen của tế bào chủ Trong tế bào chủ, gen lạ hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng, từ đó xuất hiện đặc tính mới của cơ thể đã mang gen chuyển

Nhiều phương pháp khác nhau đã được áp dụng để đưa gen vào tế bào động vật và thực vật Kĩ thuật đơn giản nhất là chuyển DNA trần bằng vi tiêm (micro injection), xung điện (electroporation), súng bắn gen các phương pháp phức tạp và hiệu quả hơn bao gồm sử dụng các phức hợp lipid - DNA (liposome), vector vius, tế bào gốc phôi, chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium…Tùy thuộc vào đối tượng chuyển gen mà người ta lựa chọn phương pháp chuyển gen phù hợp [6]

1.3.1 Các phương pháp chuyển gen trực tiếp

Chuyển gen nhờ kĩ thuật siêu âm ( mild sonication)

Kỹ thuật siêu âm dùng để chuyển gen trực tiếp vào các tế bào trần Huyền phù tế bào trần được trộn với các plasmid tái tổ hợp mang gen mong muốn và gen chọn lọc Sau đó, cắm đầu siêu âm của máy phát siêu âm ngập trong huyền phù tế bào trần 3 mm Cho máy phát siêu âm với tần số 20 kHz theo từng nhịp ngắn 110 mili giây Tổng thời gian tác động khoảng 500- 900 mili giây Tế bào trần sau khi xử lý siêu âm được nuôi trong các môi trường chọn lọc để tách các tế bào đã nhận được DNA và tái sinh thành cây [2]

Chuyển gen nhờ kĩ thuật xung điện (electroporation)

Trong công nghệ di truyền thực vật, người ta sử dụng phương pháp xung điện để chuyển gen vào protoplast thực vật Ở điện thế cao, trong thời gian ngắn có thể tạo ra các lỗ trên màng tế bào trần (protoplast) làm cho DNA bên ngoài có thể xâm nhập vào bên trong tế bào Người ta chuẩn bị môt huyền phù protoplast với các plasmid tái tổ hợp đã mang gen mong muốn cần chuyển vào thực vật

Dùng thiết bị điện xung tạo điện thế cao (200- 400 V/cm) trong khoảng thời gian 4-5 phần nghìn giây Kết quả làm màng tế bào trần xuất hiện các lỗ thủng tạm thời giúp cho plasmid tái tổ hợp có thể xâm nhập gắn vào hệ gen của thực vật Quá trình được thực hiện trong cuvet chuyên dụng Sau quá trình xung điện, đem protoplast nuôi trong môi trường chọn lọc để tách các

protoplast đã được biến nạp Tiếp theo là nuôi cấy in vitro, tái sinh cây và

chọn lọc cây chuyển gen [6]

Chuyển gen bằng súng bắn gen (gene gun)

Bắn gen là phương pháp linh hoạt để chuyển gen vào nhân, ty thể và lục lạp, mở ra rất nhiều triển vọng đối với việc chuyển gen vào các cây một lá mầm và các cây hạt trần, các đối tượng thực vật mà việc tạo ra cây chuyển

gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium không hiệu quả Phương pháp này cho

phép chuyển gen vào hầu hết các mô, cơ quan thực vật, không chỉ ở cây mô hình mà ở ngay cả những cây giá trị

Nguyên tắc chung của phương pháp này là ngâm các viên đạn nhỏ (vi đạn) bằng vàng hoặc tungsten có kích thước cực nhỏ, đường kính khoảng 0,5 – 1,5 µm với dung dịch có chứa đoạn DNA ngoại lai cần chuyển vào tế bào thực vật Các vi đạn này được làm khô trên một đĩa kim loại mỏng có kích thước 0,5- 0,9 cm Đĩa kim loại này được gắn vào một đầu viên đạn lớn (macroprojectile) bằng nhựa, hoặc vật liệu nhẹ Viên đạn lớn có kích thước vừa khít đầu nòng súng bắn gen Khi bắn, áp suất hơi sẽ đẩy viên đạn lớn đi với vận tốc cao Tới đầu nòng súng, viên đạn lớn sẽ bị cản lại bởi một lưới thép mịn, còn các viên đạn nhỏ (vi đạn) vẫn tiếp tục di chuyển với vận tốc lớn tới 130m/s đến đối tượng bắn rồi xuyên vào tế bào Sau khi bắn, tách các mô,

tế bào và nuôi cấy in vitro để tái sinh cây Gen cần chuyển có thể tham gia

vào bộ gen của tế bào Mục tiêu của công tác chọn tạo giống bằng chuyển gen

là phải chọn lọc được các thể có mặt các gen chuyển vào nằm trong bộ gen

của tế bào Có như vậy thì đặc tính này mới có thể di truyền lại cho các thế hệ sau Việc chọn lọc này rất công phu và khó khăn Gần đây, người ta đã cải tiến súng bắn gen theo hướng không sử dụng viên đạn lớn mà sử dụng bộ phận nén khí mạnh tạo áp lực đẩy vi đạn Thường sử dụng luồng khí Heli áp lực cao Việc chuyển gen bằng súng bắn gen có thuận lợi do dễ tiến hành và đặc biệt đối tượng nhận gen có thể đa dạng (ở mô, phôi, tế bào và tế bào trần) [6]

Chuyển gen bằng phương pháp hóa học

Chuyển gen bằng phương pháp hóa học là phương pháp chuyển gen vào tế bào protoplast nhờ các chất hóa học như polyethylen glycol (PEG) Ở nồng độ cao, PEG làm DNA cần biến nạp không còn ở trạng thái hòa tan nữa

mà kết dính lại trên màng sinh chất Sau đó, bằng cách loại bỏ PEG và xử lý nồng độ cao của Ca2+ hoặc ở nồng độ pH cao, DNA biến nạp sẽ được chuyển nạp vào trong tế bào trần [6]

Chuyển gen trực tiếp qua ống phấn (pollen tube)

Phương pháp chuyển gen qua ống phấn là phương pháp chuyển gen không qua nuôi cấy in vitro Phương pháp chuyển gen qua ống phấn được Ray Wu và các cộng sự ở trường Đại học Cornell (Mỹ ) đề xuất năm 1998 trên đối tượng cây lúa Nguyên tắc của phương pháp là DNA ngoại lai chuyển vào cây theo đường ống phấn, chui vào bầu nhụy cái Thời gian chuyển gen là vào lúc hạt phấn mọc qua vòi nhụy và bắt đầu đưa tinh trùng vào thụ tinh

Theo các tác giả cho biết tốt nhất là sự chuyển gen xảy ra đúng khi quá trình thụ tinh ở noãn và cho tế bào hợp tử chưa phân chia Như vậy sự chuyển gen chỉ xảy ra ở một tế bào sinh dục cái duy nhất và khi tái sinh cây sẽ không hình thành thể khảm [2]

Chuyển gen bằng vi tiêm (micro injection)

Phương pháp chuyển gen nhờ vi tiêm là phương pháp sử dụng các thiết

bị hiển vi và máy vi nhu động để chuyển gen trực tiếp vào tế bào Kĩ thuật

này có ưu điểm là: lượng DNA được biến nạp là tùy ý và xác định, DNA được đưa vào đúng vị trí mong muốn, thậm chí là nhân tế bào Có thể áp dụng đối với các tế bào có kích thước nhỏ bé như hạt phấn, phôi non mà các kĩ thuật khác không thể thực hiện được và có thể biến nạp vào các loài cây trồng, có thể thực hiện nuôi cấy riêng rẽ các tế bào vi tiêm Tuy nhiên phương pháp này tốn nhiều thời gian và công sức do mỗi lần biến nạp chỉ đưa được DNA vào một tế bào duy nhất và chỉ có thể thực hiện bởi các kĩ thuật viên có

kĩ năng cao với những thiết bị tương đối đắt tiền [6]

1.3.2 Các phương pháp chuyển gen gián tiếp

Chuyển gen nhờ virus

Virus được sử dụng làm vector chuyển gen cho cây trồng do rất dễ xâm nhập và lây lan trong cơ thể thực vật Tuy nhiên để trở thành vector chuyển gen thì virus cần có những tiêu chuẩn sau:

 Genome virus là DNA chứ không phải RNA

 Có khả năng di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác qua các lỗ thành

tế bào

 Có khả năng tải được các đoạn DNA gắn vào

 Có phổ kí chủ rộng

 Không gây hại hoặc gây hại không đáng kể

Tuy nhiên hiện nay, việc chuyển gen nhờ virus rất ít được sử dụng, do virus về nguyên tắc không truyền qua hạt do vậy việc nhân giống các cây chuyển gen nhờ virus phải tiến hành bằng phương pháp vô tính Điều này không phải thực hiện được với tất cả các loài cây Đây chính là một nhược điểm lớn của phương pháp chuyển gen bằng virus [6]

Phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium

Trong phương pháp này, DNA ngoại lai được chuyển vào tế bào thực vật nhờ cơ chế đặc trưng thông qua loài vi khuẩn đất gram (-) là Agrobacterium làm trung gian [6]

Ưu điểm :

- Số bản sao của gen biến nạp được chuyển vào tế bào thấp Do vậy giảm thiểu sự không biểu hiện của gen được chuyển, tăng khă năng chuyển gen bền vững, hiệu quả chuyển gen cao

- Tránh được sự hình thành các cây chuyển gen khảm

- Kĩ thuật đơn giản dễ thực hiện

- Không đòi hỏi kĩ thuật đắt tiền

Nhược điểm:

Phương pháp này sử dụng thành công ở nhiều cây hai lá mầm Nhưng hiệu quả chuyển gen ở các cây một lá mầm còn thấp, trong khi, nhiều cây một

lá mầm là cây lương thực quan trọng như: lúa, ngô, lúa mì…

Tuy nhiên, gần đây các phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium

đã thành công ở một số cây hòa thảo một lá mầm như: lúa Trong trường hợp này người ta dùng tế bào phôi ở dạng huyền phù làm đối tượng chuyển nạp hoặc trong môi trường nuôi cấy có bổ sung chất dẫn dụ acetosyringone

1.3.2.1 Giới thiệu vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

Agrobacterium là các loài vi khuẩn đất, thuộc nhóm Gram (-), yếm khí,

khi xâm nhập qua vết thương, các loài vi khuẩn này gây ra các triệu chứng

bệnh trên thực vật như tạo khối u hay lông rễ Agrobacterium thuộc họ Rhizobiacae, chi Agrobacterium có 4 loài chính: Agrobacterium tumefaciens,

Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium rubi

Trong đó A tumefaciens và A rhizogenes là hai loài được nghiên cứu nhiều

nhất gây ra bệnh khối u (crown gall) và bệnh lông rễ (hairy root) ở các vị trí tổn thương của thực vật hai lá mầm

A.rhizogenes gây bệnh rễ tơ ở thực vật hai lá mầm A.rhizogenes mang

Ri (root-inducing) plasmid, và plasmid này đã được xác định là tác nhân gây bệnh rễ tơ ở các mô tế bào thực vật bị xâm nhiễm [8] Khi tế bào thực vật bị