Western blot trong xác định protein

Với những thành công to lớn của nền công nghệ sinh học thế giới trong những năm gần đây, các phương hướng nghiên cứu đang ngày càng được thay đổi rõ rệt đem lại những lợi ích cực kỳ to lớn cho xã hội nói chung và y học nói riêng. Trước những thách thức đầy nguy hiểm của hàng trăm ngàn căn bệnh mới, việc xác định được tác nhân gây bệnh để đưa ra biện pháp chữa trị là hết sức cần thiết. Không chỉ vậy với các căn bệnh nan y, phát hiện sớm đồng thời là giúp làm tăng phần trăm chữa trị thành công cho người bệnh. Bên cạnh đó, việc nghiên cứu áp dụng công nghệ sinh học trong sản xuất thuốc và vắc xin là một lĩnh vực ưu tiên hàng đầu của nhân loại. Western blot là một trong số những kỹ thuật di truyền dựa vào miễn dịch học nhằm phát hiện protein có mặt trong mô hoặc trong mẫu tách từ tế bào (vi khuẩn, vi rút,…) với phương pháp này các nhà nghiên cứu có thể xác định được protein cụ thể trong hỗn hợp phức tạp có chứa hàng trăm protein được tách ra từ tế bào. Với đặc điểm này việc nghiên cứu và tìm hiểu sâu về Western blot là điều tất yếu. Vì vậy, sau đây tôi xin trình bày chuyên đề: “ Western blot trong xác định protein”.

Chương 1: MỞ ĐẦU Với thành công to lớn công nghệ sinh học giới năm gần đây, phương hướng nghiên cứu ngày thay đổi rõ rệt đem lại lợi ích to lớn cho xã hội nói chung y học nói riêng Trước thách thức đầy nguy hiểm hàng trăm ngàn bệnh mới, việc xác định tác nhân gây bệnh để đưa biện pháp chữa trị cần thiết Không với bệnh nan y, phát sớm đồng thời giúp làm tăng phần trăm chữa trị thành cơng cho người bệnh Bên cạnh đó, việc nghiên cứu áp dụng công nghệ sinh học sản xuất thuốc vắc xin lĩnh vực ưu tiên hàng đầu nhân loại Western blot số kỹ thuật di truyền dựa vào miễn dịch học nhằm phát protein có mặt mơ mẫu tách từ tế bào (vi khuẩn, vi rút,…) với phương pháp nhà nghiên cứu xác định protein cụ thể hỗn hợp phức tạp có chứa hàng trăm protein tách từ tế bào Với đặc điểm việc nghiên cứu tìm hiểu sâu Western blot điều tất yếu Vì vậy, sau tơi xin trình bày chun đề: “ Western blot xác định protein” Chương 2: PHƯƠNG PHÁP WESTERN BLOT VÀ ỨNG DỤNG Phương pháp Western blot a/ Khái niệm Western Blot Phương pháp Western blot (hay gọi protein immunoblot) kỹ thuật phân tích sử dụng rộng rãi nhằm phát proteins chuyên biệt mẫu mô hay dịch chiết xuất mô Phương pháp sử dụng điện di gel để phân tách protein nguyên vẹn cấu trúc 3-D hay protein biến tính theo độ dài mạch polypeptide Protein sau chuyển lên màng (thường sử dụng màng nitrocellulose hay màng PVDF), chúng gắn kháng thể đặc hiệu với protein đích Điện di gel đưa vào hệ thống phân tích Western Blot nhằm giải vấn đề phản ứng chéo kháng thể Nhiều cơng ty hóa chất chun cung cấp kháng thể (cả kháng thể đơn dòng kháng thể đa dòng) tương ứng vời hàng ngàn protein khác Các kháng thể thương mại thường có giá thành cao, kháng thể khơng liên kết tái sử dụng thí nghiệm Phương pháp sử dụng nhiều lĩnh vực sinh học phân tử, miễn dịch gen ngành sinh học phân tử khác Một số cơng cụ tìm kiếm, CiteAb, Antibodypedia, SeekProducts, sử dụng để giúp nhà nghiên cứu tìm kiếm kháng thể thích hợp để sử dụng phương pháp Western Blot Những phương pháp liên quan khác bao gồm phương pháp lai phân tử (dot blot), hóa mơ miễn dịch hóa tế bào miễn dịch, kháng thể sử dụng để phát protein mô tế bào cách nhuộm miễn dịch, hấp thụ miễn dịch lên liên kết enzyme (ELISA) b/ Các bước thực Chuẩn bị mơ Nên lấy mẫu từ tồn mô hay canh trường (môi trường nuôi cấy) tế bào Đầu tiên, xử lý mô rắn phương pháp học sử dụng máy nghiền (khi lượng mẫu lớn), sử dụng máy đồng hóa (máy nghiền đồng thể) siêu âm (với số lượng mẫu nhỏ) Cũng phá hủy tế bào phương pháp hóa học Tuy nhiên, mẫu virus hay mẫu lấy từ mơi trường nguồn protein xác định Western Blot, không bắt buộc phải nghiên cứu tế bào Có thể sử dụng loại chất tẩy rửa, muối, đệm để thúc đẩy ly giải tế bào hòa tan protein Thường bổ sung chất kìm hãm protease phosphatase để ngăn chặn phá hủy mẫu enzyme có mẫu Nên tiến hành chuẩn bị mơ nhiệt độ thấp để tránh tượng biến tính protein suy giảm (mất chức năng) Phối hợp kỹ thuật hóa sinh học – bao gồm nhiều phương pháp lọc ly tâm – sử dụng để phân tách thành phần tế bào bào quan khác Điện di gel Điện di gel để phân tách protein mẫu Sự phân tách protein dựa điểm đẳng điện (pI), khối lượng phân tử, điện tích, phối hợp yếu tố Đặc điểm (bản chất) trình phân tách phụ thuộc vào cách xử lý mẫu đặc điểm gel Đây cách hữu ích (hiệu quả) để xác định protein Cho tới nay, phương pháp điện di sử dụng phổ biến điện di gel polyacrylamide có bổ sung sodium dodecyl sulfate (SDS) Phương pháp SDS-PAGE (điện di gel polyacrylamide có bổ sung SDS) giữ polypeptide trạng thái biến tính sau chúng xử lý với chất khử mạnh cấu trúc bậc hai, cấu trúc bậc (ví dụ, cầu disulfide [S-S] tạo nên nhóm sulfhydryl [SH SH]) protein phân tách dựa khối lượng phân tử Protein mẫu mang điện tích âm SDS dịch chuyển tới cực dương thông qua mạng acrylamide gel (di chuyển qua mạng lưới acrylamide tới cực dương) Các protein nhỏ di chuyển nhanh qua màng chúng phân tách theo khối lượng (thường sử dụng đơn vị kilodaltons, kDa) Nồng độ acrylamide xác định khả phân tách gel – nồng độ cao phân tách tốt protein có khối lượng phân tử nhỏ Nồng độ acrylamide thấp, phân tách tốt protein có khối lượng phân tử lớn Protein di chuyển theo hướng dọc gel hầu hết màng lai (Tìm hiểu thêm phương pháp SDS- PAGE đây) Các mẫu nạp vào giếng gel Thường để lại giếng thị (marker) thang chuẩn (ladder), sản phẩm thương mại có chứa hỗn hợp protein với khối lượng phân tử xác định, nhuộm để tạo băng màu nhìn thấy Khi điện thiết lập gel, protein bắt đầu di chuyển với tốc độ khác phụ thuộc vào khối lượng phân tử chúng Vận tốc di chuyển khác protein (sự khác biệt độ di động điện di) tạo thành vạch khác giếng Cũng sử dụng gel hai chiều (two-dimensional (2-D) gel) để phân tách protein từ mẫu theo hai chiều Theo chiều thứ nhất, protein phân tách dựa điểm đẳng điện (pH protein mang điện tích trung tính), chiều thứ hai theo khối lượng phân tử protein Chuyển lên màng lai Để protein liên kết với kháng thể đặc hiệu, gel phải chuyển lên màng nitrocellulose hay polyvinylidene difluoride (PVDF) Phương pháp để chuyển protein gọi phương pháp thẩm tách điện sử dụng dòng điện để kéo protein từ gel lên màng PVDF màng nitrocellulose Các protein di chuyển từ gel lên màng mà trì xếp gel Một phương pháp khác (cũ) dịch chuyển protein bao gồm việc đặt màng lên mặt gel, đặt tiếp giấy lọc lên Đặt giấy lọc dung dịch đệm, dung dịch đệm thấm lên giấy lọc lực mao dẫn, mang theo protein Trên thực tế, phương pháp không sử dụng tốn nhiều thời gian, thẩm tách điện thường sử dụng nhiều Kết hai trình “lai thấm” (thẩm tách miễn dịch) protein phơi lớp bề mặt (bề mặt lớp mỏng) để tiến hành phát (sẽ trình bày bên dưới) Cả hai loại màng chọn đặc tính liên kết khơng đặc hiệu với protein (ví dụ, khả liên kết với tất protein đương đương) Liên kết protein dựa tương tác kị nước, tương tác điện tích màng protein Màng nitrocellulose rẻ màng PVDF, mỏng không bền tái sử dụng Có thể kiểm tra đồng hiệu cuối trình chuyển protein từ gel lên màng cách nhuộm màng với chất nhuộm Coomassie Brilliant Blue Ponceau S Ponceau S thường sử dụng nhiều có độ nhạy cao tính tan nước, làm cho chất nhuộm dễ bị rửa trơi dò màng mơ tả phần sau Blocking Từ màng chọn có khả liên kết với protein, kháng thể protein đích protein, nên cần thực bước để ngăn chặn liên kết màng kháng thể sử dụng để xác nhận protein mục tiêu Ngăn chặn liên kết không đặc hiệu cách đặt màng vào dung dịch protein lỗng- điển hình albumin huyết tương bò 3-5% (BSA) sữa gầy (cả hai có giá thành thấp) Tris-Buffered Saline (TBS) I-Block, với phần trăm chất tẩy rửa nhỏ (0.1%) Tween 20 Triton X-100 Protein dung dịch loãng khóa tất vị trí mà protein đích chưa gắn màng Do đó, bổ sung kháng thể, khơng thể gắn khơng đặc hiệu ngồi việc gắn với protein đích Điều làm giảm nhiễu trình Western Blot, cho kết rõ ràng loại trừ tượng dương tính giả Sự phát Trong trình phát hiện, màng có khả liên kết với enzyme thơng báo; enzyme tác dụng với chất tương ứng, thúc đẩy phản ứng phát quang tạo màu Vì nhiều nguyên nhân, điều thường diễn trình gồm hai bước, phương pháp phát bước áp dụng cho ứng dụng định Hai bước: Kháng thể sơ cấp: Kháng thể sơ cấp tạo cho vật chủ hay canh trường tế bào miễn dịch (môi trường nuôi cấy tế bào miễn dịch) tiếp xúc với protein quan tâm (hoặc phần nó) Thơng thường, phần đáp ứng miễn dịch, kháng thể thu nhận sử dụng công cụ xác định đặc hiệu mà liên kết trực tiếp với protein Sau phong bế (blocking), ủ dung dịch loãng kháng thể sơ cấp (thường sử dụng nồng độ 0.5 micrograms/mL) với màng lắc nhẹ nhàng Thông thường, dung dịch bao gồm dung dịch muối đệm với lượng nhỏ chất tẩy rửa có thêm sữa bột BSA Dung dịch kháng thể màng giữ ủ lại với nơi khoảng 30 phút tới qua đêm Cũng ủ nhiệt độ khác nhau, với nhiệt độ cao kích thích liên kết, liên kết đặc hiệu (đối với protein đích, “tín hiệu”) protein không đặc hiệu (“nhiễu”) Kháng thể thứ cấp: Sau rửa màng để loại bỏ kháng thể sơ cấp chưa liên kết, màng tiếp tục gắn kháng thể thứ hai (thứ cấp), bám trực tiếp vào phần đặc hiệu theo loài kháng thể sơ cấp Các kháng thể có nguồn gốc động vật (hoặc canh trường hybridoma nguồn gốc động vật); kháng chuột thứ cấp liên kết với hầu hết kháng thể sơ cấp có nguồn gốc từ chuột, điều cho phép tiết kiệm chi phí cho tồn phòng thí nghiệm cso thể dùng chung nguồn kháng thể sản xuất kháng thể hàng loạt, cung cấp kết ổn định theo thời gian Kháng thể biết đến kháng thể thứ cấp, có đặc điểm hướng đích, có xu hướng gọi “kháng- chuột” “khángdê,” vv Kháng thể thứ cấp thường liên kết với biotin enzyme thị alkaline phosphatase hay horseradish peroxidase Điều có nghĩa nhiều kháng thể thứ cấp liên kết với kháng thể sơ cấp khuếch đại tín hiệu Phổ biến sử dụng kháng thể thứ cấp gắn horseradish peroxidase để tách tác nhân phát quang hóa học, sản phẩm phản ứng phát huỳnh quang tỷ lệ với lượng protein Một film có độ nhạy cao film chụp ảnh đặt vào màng, tiếp xúc với ánh sáng từ phản ứng tạo ảnh kháng thể liên kết lai (blot) Chi phí phương pháp thấp nhiên nhạy sử dụng phương pháp nhuộm 4-chloronaphthol với 1% hydrogen peroxide; phản ứng gốc peroxide với 4-chloronaphthol tạo vệt tím sẫm chụp ảnh mà khơng cần sử dụng film chụp ảnh chuyên dụng Như với quy trình ELISPOT ELISA , enzyme phản ứng với chất phân tử chuyển đổi tạo sản phẩm phản ứng tạo màu phát màng (quan sát hình bên với dải màu xanh) Một phương pháp khác để phát kháng thể thứ cấp sử dụng xạ hồng ngoại (NIR) gần liên kết với kháng thể gắn chất huỳnh quang Ánh sáng huỳnh quang khơng thay đổi tạo từ kích thích chất nhuộm huỳnh quang, làm cho phát huỳnh quang xác thước đo xác cho khác tín hiệu tạo bới kháng thể đánh dấu liên kết với protein phương pháp Western Blot Có thể định lượng protein cách xác tín hiệu tạo lượng protein khác màng đo trạng thái tĩnh, so sánh với phát quang hóa học, ánh sáng đo trạng thái động Phương pháp thứ ba sử dụng đánh dấu phóng xạ thay enzyme kèm với kháng thể thứ cấp, gắn protein liên kết kháng thể Protein A Staphylococcus hay Streptavidin với chất đồng vị phóng xạ iot Kể từ phương pháp khác an toàn hơn, nhanh chi phí thấp đời, phương pháp sử dụng; nhiên, lợi phương pháp độ nhạy kỹ thuật chụp ảnh phóng xạ- tự động, cho phép định lượng protein với độ xác cao kết hợp với phần mềm quang học (vd Optiquant) Một bước Trong lịch sử, q trình dò thực theo hai bước tạo kháng thể sơ cấp kháng thể thứ cấp trình riêng biệt tương đối dễ Điều mang lại cho nghiên cứu viên tổ chức nghiên cứu lợi lớn linh động bổ sung bước khuếch đại trình phát Với đời phân tích protein hiệu cao giới hạn thấp phát hiện, nhiên, người ta quan tâm đến việc phát triển hệ thống dò tìm bước mà cho phép q trình diễn nhanh tốn Điều cần tới kháng thể dò vừa có khả nhận protein quan tâm vừa chứa nhãn xác định, đầu dò thường biết đến protein Ủ đầu dò sơ cấp với màng theo cách tương tự với kháng thể sơ cấp q trình hai bước, sau sẵn sàng để xác định trực tiếp sau rửa nhiều lần Phương pháp Western Blot sử dụng hệ thống phát phóng xạ Sự phát / Sự hiển thị Sau rửa đầu dò khơng gắn lên màng, màng lai sẵn sàng phát đầu dò đánh dấu liên kết với protein quan tâm Trong thực tế, tất biểu protein băng màng Khối lượng gần xác định cách so sánh băng nhuộm với thị thang chuẩn điện di Quá trình thường thực protein cấu trúc, actin hay tubulin, mà protein dạng không nên thay đổi mẫu Lượng protein mục tiêu định mức protein cấu trúc để kiểm sốt nhóm Một giải pháp tốt định mức tổng số protein hiển thị với trichloroethanol hay epicocconone Điều thực tế đảm bảo điều chỉnh tổng số protein màng trường hợp có sai sót q trình chuyển lên màng khơng hoàn thiện Xác định màu Phương pháp xác định màu phụ thuộc vào trình ủ Western Blot với chất phản ứng với enzyme để thị (như peroxidase) mà liên kết với kháng thể thứ cấp Nó chuyển đổi thuốc nhuộm hòa tan thành dạng không tan màu khác kết tủa vị trí enzyme gắn làm màng màu Quá trình màu dừng lại sau rửa chất nhuộm tan Đánh giá mức độ biểu protein thông qua mật độ kế (nhuộm đậm tới mức nào) hay quang phổ kế Xác định phát quang hóa học Phương pháp xác định phát quang hóa học phụ thuộc vào q trình ủ Western Blot với chất phát quang tiếp xúc với chất thị gắn kháng thể thứ cấp Ánh sáng phát thu máy chụp CCD mà bắt ảnh kỹ thuật số màng lai phim ảnh Phương pháp sử dụng phim để phát màng lai biến phi tuyến tính hình ảnh (định lượng khơng xác) Hình ảnh phân tích mật độ kế, đo lượng tương đối protein nhuộm định lượng kết theo mật độ quang Phần mềm cho phép phân tích nhiều liêụ khối lượng phân tử sử dụng loại chất Các công ty lớn thường cung cấp hệ thống hình ảnh Phát quang hóa học Analytik Jena, Syngene, UVP, Azure Biosystems, UVITEC, GE Biorad Xác định phóng xạ Phương pháp đánh dấu phòng xạ khơng cần chất enzyme, thế, phải đặt film X-quang trực tiếp trước màng lai, mà phát triển phơi lên dấu phóng xạ tạo vùng tối tương tứng với băng protein quan tâm (quan sát hình ảnh bên phải) Tầm quan trọng phương pháp đánh dấu phóng xạ giảm dần nguy hiểm phóng xạ, chi phí cao, ảnh hưởng lớn đến sức khỏe an toàn người sử dụng, thường thay ECL (tăng cường phát quang hóa học) lựa chọn hữu ích Xác định huỳnh quang Đầu dò đánh dấu huỳnh quang kích thích ánh sáng xác định ánh sáng phát cảm biến quang máy chụp CCD trang bị lọc ánh sáng tương ứng mà thu hình ảnh kỹ thuật số màng lai tiến hành phân tích khối lượng phân tử phân tích định lượng màng lai Phương pháp đánh dấu huỳnh quang xem xét phương pháp tốt để định lượng độ nhạy phương pháp phát quang hóa học Dò thứ cấp Một khác biệt lớn màng nitrocellulose màng PVDF liên quan đến khả hỗ trợ “việc tách” loại kháng thể tái sử dụng màng cho kháng thể đầu dò Trong có nhiều quy trình tốt thiết lập để tách loại kháng thể màng nitrocellulose, bền vững màng PVDF cho phép tách loại dễ dàng hơn, tái sử dụng nhiều trước thí nghiệm bị giới hạn nhiễu Một điểm khác biệt không giống màng nitrocellulose, màng PVDF phải lắc ethanol 95%, isopropanol hay methanol trước sử dụng Màng PVDF thường có xu hướng dày khả chống lại yếu tố gây hại cao trình sử dụng Điện di gel 2-D Phương pháp điện di SDS-PAGE 2- chiều sử dụng nguyên tắc kỹ thuật trình bày Như tên gọi phương pháp điện di SDS-PAGE 2- chiều, liên quan đến việc di chuyển polypeptides theo chiều Thí dụ, theo chiều thứ nhất, polypeptide phân tách dựa điểm đẳng điện, theo chiều thứ hai, polypeptide phân tách dựa theo trọng lượng phân tử chúng Điểm đẳng điện protein định xác định số lượng tương đối amino acid tích điện dương (thí dụ lysine, arginine) amino acid tích điện âm (thí dụ glytamate, aspartate), với amino acid tích điện âm góp phần tạo nên điểm đẳng điện thấp amino acid tích điện dương góp phần tích cực tạo nên điểm đẳng điện cao Các mẫu phân tách điều kiện không rút gọn sử dụng SDS- PAGE điều kiện rút gọn chiều thứ hai, làm tách rời liên kết disulfide mà có vai trò giữ tiểu đơn vị với SDSPAGE kết hợp với ure – PAGE tạo nên gel hai chiều Về nguyên tắc, phương pháp cho phép phân tách tất protein tế bào gel lớn Một ưu lớn phương pháp thường phân biệt khác đồng dạng loại protein riêng biệt- thí dụ protein phosphoryl hóa (bằng cách bổ sung nhóm tích điện âm) Protein phân tách cắt khỏi gel sau phân tích phương pháp quang phổ khối để xác định potein Ứng dụng - Xác định hoạt động gel thơng qua có mặt protein mơ - Nhận dạng protein mục tiêu - Đánh giá tính chuyên biệt kháng thể - Phân tích bệnh vi khuẩn virus gây ra: thử nghiệm khẳng định HIV, viêm gan B - Năm 2002, ứng dụng thành công phương pháp Western Blot việc xác định kháng nguyên giun đũa chó (Toxocara canis) thỏ (Olga Lucia Morales ctv, 2002), mở hướng việc xét nghiệm chẩn đốn xác bệnh ký sinh trùng người Chương 3: KẾT LUẬN Western blot phương pháp khó, tốn yêu cầu nhiều kỹ thuật đặc biệt thao tác xác Việt Nam sử dụng vài trung tâm nghiên cứu bệnh viện lớn nơi khơng có điều kiện phù hợp mà có trình độ chun mơn tương ứng Mặc dù để mở rộng việc phát chẩn đốn bệnh cách xác việc bổ sung phương pháp phòng thí nghiệm cần thiết đặc biệt phòng thí nghiệm phục vụ cho chẩn đoán bệnh truyền nhiễm, HIV,… /  ... PHƯƠNG PHÁP WESTERN BLOT VÀ ỨNG DỤNG Phương pháp Western blot a/ Khái niệm Western Blot Phương pháp Western blot (hay gọi protein immunoblot) kỹ thuật phân tích sử dụng rộng rãi nhằm phát proteins... phát huỳnh quang xác thước đo xác cho khác tín hiệu tạo bới kháng thể đánh dấu liên kết với protein phương pháp Western Blot Có thể định lượng protein cách xác tín hiệu tạo lượng protein khác màng... mức độ biểu protein thông qua mật độ kế (nhuộm đậm tới mức nào) hay quang phổ kế Xác định phát quang hóa học Phương pháp xác định phát quang hóa học phụ thuộc vào q trình ủ Western Blot với chất