Luận án Tiến sĩ Dược học “Bào chế hệ tiểu phân nano artemisinin và đánh giá tác động diệt ký sinh trùng sốt rét trên chuột” được thực hiện với các nội dung nghiên cứu sau: Đánh giá sự tương tác giữa hỗn hợp lipid (Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG) và ART, xây dựng công thức và quy trình bào chế hệ tiểu phân nano ART, đánh giá tính chất của hệ tiểu phân nano ART, đánh giá tác động diệt ký sinh trùng sốt rét của hệ tiểu phân nano ART trên chuột gây nhiễm Plasmodium berghei.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHƯU MỸ LỆ BÀO CHẾ HỆ TIỂU PHÂN NANO ARTEMISININ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG DIỆT KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT TRÊN CHUỘT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Thành Phố Hồ Chí Minh – Năm 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHƯU MỸ LỆ KHƯU BÀO CHẾ HỆ TIỂU PHÂN NANO ARTEMISININ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG DIỆT KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT TRÊN CHUỘT Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm bào chế Mã số: 62720402 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS HOÀNG MINH CHÂU GS.TS NGUYỄN MINH ĐỨC Thành Phố Hồ Chí Minh – Năm 2017 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết trình bày luận án trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả Khưu Mỹ Lệ MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan Mục lục Danh mục chữ viết tắt, bảng đối chiếu thuật ngữ Anh – Việt Danh mục bảng, hình, biểu đồ sơ đồ MỞ ĐẦU MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU .3 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu thành tựu công nghệ nano .4 1.2 Khái niệm phân loại tiểu phân nano ngành dược 1.3 Phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano lipid .9 1.4 Phương pháp phân tích tính chất hệ tiểu phân nano lipid 16 1.5 Các tá dược dùng bào chế hệ tiểu phân nano ART 25 1.6 Artemisinin nghiên cứu ứng dụng điều trị sốt rét 27 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .37 2.1 Đối tượng nghiên cứu 37 2.2 Phương pháp nghiên cứu 39 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 59 3.1 Kết đánh giá tương tác hỗn hợp lipid (Compritol 888® ATO – LabrafacTM PG) ART 59 3.2 Kết xây dựng công thức quy trình bào chế hệ tiểu phân nano ART 65 3.3 Kết đánh giá tính chất hệ tiểu phân nano ART .92 3.4 Kết đánh giá tác động diệt ký sinh trùng sốt rét hệ tiểu phân nano ART chuột gây nhiễm P berghei .122 Chương BÀN LUẬN 127 4.1 Tương tác hỗn hợp lipid (Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG) ART 127 4.2 Cơng thức quy trình bào chế hệ tiểu phân nano ART 128 4.3 Tính chất hệ tiểu phân nano ART 136 4.4 Tác động diệt ký sinh trùng sốt rét hệ tiểu phân nano ART chuột gây nhiễm Plasmodium berghei 142 KẾT LUẬN 144 KIẾN NGHỊ 146 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFM Atomic force microscopy ART Artemisinin ACTs Artemisinin – based combination therapies ARTs Artemisinin and its derivatives CT Công thức DĐ Dược điển DHA Dihydroartemisinin DM Dung môi D/N Dầu/Nước DSC Differential scanning calorimetry HPH High pressure homogenization HPLC High performance liquid chromatography HSNH Hiệu suất nang hóa KHV Kính hiển vi KT Kết tủa KST Ký sinh trùng KTTP Kích thước tiểu phân LD Laser diffraction N/D Nước/Dầu N/D/N Nước/Dầu/Nước NLC Nanostructured lipid carriers NT Nhũ tương PCS Photon correlation spectroscopy PD Pha dầu PdI Poly dispersity index PEG Polyethylen glycol PN Pha nước PTHC Phóng thích hoạt chất PTNH Phần trăm nang hóa RESS Rapid expansion from supercritical solutions RH Relative humidity SAS Supercritical antisolvent SEM Scanning electron microscopy SLN Solid lipid nanoparticles STH Siêu tới hạn TB Trung bình TEM Transmission electron microscope TN Thí nghiệm BẢNG ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ ANH – VIỆT Artemisinin and its derivatives Artemisinin dẫn chất Artemisinin – based combination therapies Các liệu pháp phối hợp dựa vào artemisinin Atomic force microscopy Phép đo kính hiển vi lực nguyên tử Differential scanning calorimetry Phép đo quét nhiệt vi sai High pressure homogenization Đồng hóa áp suất cao High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao Laser diffraction Nhiễu xạ laser Nanostructured lipid carriers Giá mang lipid cấu trúc nano Photon correlation spectroscopy Phổ tương quan photon Poly dispersity index Chỉ số đa phân tán Rapid expansion from supercritical solutions Khuếch trương nhanh từ dung dịch siêu tới hạn Relative humidity Độ ẩm tương đối Scanning electron microscopy Phép đo kính hiển vi điện tử quét Solid lipid nanoparticles Tiểu phân nano lipid rắn Supercritical antisolvent Đối kháng dung môi siêu tới hạn Transmission electron microscopy Phép đo kính hiển vi điện tử truyền qua DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Số lượng công bố vật liệu nano số nước ASEAN Nhật Bảng 1.2 Một số chế phẩm thuốc nano lưu hành thị trường Bảng 1.3 Một số lipid lớp đơn dầu dùng bào chế tiểu phân nano lipid 10 Bảng 1.4 Ưu nhược điểm phương pháp bào chế tiểu phân nano 15 Bảng 2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu .37 Bảng 2.2 Hóa chất dung môi nghiên cứu 37 Bảng 2.3 Trang thiết bị nghiên cứu 38 Bảng 2.4 Thành phần công thức bào chế tiểu phân nano ART 42 Bảng 2.5 Các mức yếu tố khảo sát .46 Bảng 3.1 Thể chất hỗn hợp Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG 59 Bảng 3.2 Nhiệt độ nóng chảy hỗn hợp Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG lượng ART khác 64 Bảng 3.3 Thành phần công thức bào chế hệ tiểu phân nano 65 Bảng 3.4 Kết khảo sát số tính chất hệ tiểu phân nano 65 Bảng 3.5 Thông số KTTP CT 68 Bảng 3.6 Thành phần công thức với chất diện hoạt polysorbat 80 69 Bảng 3.7 Thông số KTTP mẫu 25, 26 27 69 Bảng 3.8 Thành phần công thức với hỗn hợp chất diện hoạt polysorbat 80 – Gelucire® 50/13 71 Bảng 3.9 Kết đánh giá số tính chất mẫu 19, 20 21 71 Bảng 3.10 Thông số KTTP mẫu 19, 20 21 71 Bảng 3.11 Thành phần công thức với hỗn hợp polysorbat 80 - phosphatidylcholin 73 Bảng 3.12 Kết đánh giá số tính chất CT 22, 23 24 73 Bảng 3.13 Thông số KTTP CT 22, 23 24 75 Bảng 3.14 Thành phần công thức phối hợp phosphatidylcholin 75 Bảng 3.15 Kết đánh giá số tính chất CT 16, 17 18 76 Bảng 3.16 Thông số KTTP CT 17 18 77 Bảng 3.17 Thành phần công thức với hỗn hợp chất diện hoạt polysorbat 80 – SimulsolTM 4000 P 78 Bảng 3.18 Thông số KTTP CT 28, 29 30 80 Bảng 3.19 Thông số KTTP mẫu đồng hóa HPH 82 Bảng 3.20 Thông số KTTP mẫu sau tăng áp suất đồng hóa 84 Bảng 3.21 Tính chất hệ tiểu phân có hàm lượng ART khác .85 Bảng 3.22 Các mức yếu tố khảo sát 87 Bảng 3.23 Ma trận bố trí thí nghiệm kết 87 Bảng 3.24 KTTP TN điều kiện 88 Bảng 3.25 Kích thước tiểu phân TB thí nghiệm tiến đến vùng gần dừng 89 Bảng 3.26 Thông số KTTP lô kiểm chứng 90 Bảng 3.27 Sự thay đổi KTTP trình khảo sát .91 Bảng 3.28 Thông số kích thước hệ tiểu phân nano ART 92 Bảng 3.29 Các thông số sắc ký thẩm định tính tuyến tính 97 Bảng 3.30 Các thông số thẩm định độ lặp lại 98 Bảng 3.31 Các thông số sắc ký ART 99 Bảng 3.32 Các thông số thẩm định độ 99 Bảng 3.33 Hàm lượng % hiệu suất nang hóa hệ tiểu phân nano ART 100 Bảng 3.34 Dữ liệu lượng hoạt chất phóng thích hệ tiểu phân nano ART 101 Bảng 3.35 Thành phần công thức bào chế hệ tiểu phân nano ART 102 Bảng 3.36 Tiêu chuẩn nguyên liệu công thức bào chế hệ tiểu phân nano ART 103 Bảng 3.37 Chỉ tiêu chất lượng hệ tiểu phân nano ART 103 Bảng 3.38 Thông số KTTP hệ tiểu phân nano ART lô nâng cấp 109 Bảng 3.39 Hàm lượng %, PTNH HSNH lô nâng cấp 111 Bảng 3.40 Lượng hoạt chất phóng thích lô nâng cấp .112 Bảng 3.41 Tính chất hệ tiểu phân lơ nâng cấp 113 Phụ lục 4.11 So sánh mật độ KST máu chuột ngày thứ 35 lô – Phụ lục 4.12 Tỉ lệ giảm mật độ KST máu chuột Phụ lục 4.13 So sánh ngày bắt đầu KST máu Phụ lục 4.14 So sánh số ngày trì tình trạng KST máu lô – Phụ lục Tiêu chuẩn hệ tiểu phân nano ART Khoa Dược TIÊU CHUẨN Số TC: Đại học Y Dược TPHCM HỆ TIỂU PHÂN NANO ARTEMISININ Có hiệu lực từ: Quyết định ban hành số: , ngày tháng năm 2017 I TIÊU CHUẨN KỸ THUẬT 1.1 CÔNG THỨC BÀO CHẾ CHO LƠ 1.000 G Artemisinin 8g Compritol® 888 ATO 70 g LabrafacTM PG 30 g Polysorbat 80 10 g SimulsolTM 4000 P 10 g Nước cất vđ 1.000 g 1.2 TIÊU CHUẨN NGUYÊN LIỆU Artemisinin (Lô 100309-1001IN) Đạt tiêu chuẩn DĐ Việt Nam IV (2010) Compritol® 888 ATO Đạt tiêu chuẩn DĐ Châu Âu 7.0 (2011) LabrafacTM PG Đạt tiêu chuẩn DĐ Châu Âu 7.0 (2011) Polysorbat 80 Đạt tiêu chuẩn DĐ Châu Âu 7.0 (2011) SimulsolTM 4000 P Đạt tiêu chuẩn DĐ Mỹ 34 (2011) 1.3 CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM 1.3.1 Cảm quan: Hệ tiểu phân nano artemisinin đồng nhất, không kết bông, không kem không tách lớp 1.3.2 Kích thước Tiểu phân nano artemisinin có kích thước trung bình khoảng 105 – 125 nm, dãy phân bố kích thước từ 58 – 339 nm, d10 khoảng 70 – 85 nm, d90 khoảng 150 – 180 nm 1.3.3 Hình thể học Tiểu phân nano artemisinin có hình cầu, kích thước khoảng 58 – 339 nm 1.3.4 Thế zêta Trị tuyệt đối zêta khoảng |–13,5| – |–16,5| mV 1.3.5 Phần trăm nang hóa Hệ tiểu phân nano artemisinin phải có phần trăm nang hóa khoảng 7,0 – 8,5% 1.3.6 Hiệu suất nang hóa Hệ tiểu phân nano artemisinin phải có hiệu suất nang hóa khơng 92% 1.3.7 Phóng thích hoạt chất Lượng artemisinin phóng thích phải nằm khoảng 12 – 15 mg/cm2 II PHƯƠNG PHÁP THỬ 2.1 CẢM QUAN Quan sát mắt thường, hệ tiểu phân phân tán đồng nhất, không xuất chuyển đổi màu sắc, không kết hay kem,… 2.2 KÍCH THƯỚC VÀ DÃY PHÂN BỐ KÍCH THƯỚC 2.2.1 Thiết bị thử nghiệm Máy phân tích kích thước tiểu phân nhiễu xạ laser 2.2.2 Cách tiến hành Phân tích máy phân tích kích thước tiểu phân Tráng tế bào đo nước cất, cho nước cất vào tế bào đo, khử khí đo đường Tráng tế bào đo mẫu phân tích, cho mẫu vào tế bào đo, khử khí phân tích mẫu 2.3 HÌNH THỂ HỌC 2.3.1 Thiết bị thử nghiệm Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) 2.3.2 Cách tiến hành Phân tích kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) Pha loãng mẫu nước cất với tỉ lệ phù hợp (thường : 9), trải mẫu pha loãng lên lưới đồng phủ màng carbon theo phương pháp bốc bay chân không Đặt lưới đồng chứa mẫu vào đĩa petri, hút ẩm khoảng 24 để làm khô mẫu Khảo sát mẫu với nguồn electron có điện gia tốc 100 kV 2.4 THẾ ZÊTA 2.4.1 Thiết bị thử nghiệm Máy phân tích kích thước tiểu phân có chức đo zêta 2.4.2 Cách tiến hành Đo zêta máy phân tích kích thước tiểu phân Pha lỗng mẫu nước cất với tỉ lệ phù hợp (thường : 9), cho vào cốc đo, khử khí đo mẫu 2.5 ĐỊNH LƯỢNG ARTEMISININ: SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 2.5.1 Điều kiện sắc ký Pha động: Hỗn hợp acetonitril – nước (68 : 32) Cột thép không gỉ (250 mm x 4,6 mm) nhồi pha tĩnh C18 (5 µm) Nhiệt độ phân tích trì nhiệt độ phòng Detector quang phổ tử ngoại đặt bước sóng 216 nm Tốc độ dịng: 0,6 ml/phút Thể tích tiêm mẫu: 20 µl 2.5.2 Dung dịch chuẩn Cân xác khoảng mg ART chuẩn vào bình định mức ml, hòa tan pha động, siêu âm bổ sung pha động vừa đủ thể tích Lấy 100 l dung dịch, cho vào bình định mức ml, bổ sung pha động vừa đủ thể tích Lắc lọc qua màng lọc 0,2 m, bỏ vài giọt đầu Dung dịch chuẩn có nồng độ 50 g/ml 2.5.3 Dung dịch thử Cân xác khoảng 50 mg mẫu đơng khơ, đun cách thủy (80 oC), hịa tan ml methanol Siêu âm phút, ly tâm 3.500 vòng/phút (10 phút) Lọc, rửa tủa ml methanol (2 lần), thu dịch lọc vào bình định mức 10 ml, bổ sung methanol vừa đủ thể tích Pha loãng lần pha động, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,2 m, bỏ vài giọt đầu Định lượng ART HPLC 2.5.4 Cách tiến hành Tiêm lặp lại sáu lần dung dịch chuẩn, phép thử có giá trị độ lệch chuẩn tương đối diện tích đỉnh thời gian lưu artemisinin nhỏ 2% Tiêm dung dịch thử Tính hàm lượng (%) artemisinin từ diện tích đỉnh dung dịch thử dung dịch chuẩn 2.5.5 Cách tính hàm luợng (%) artemisinin 𝑋 (%) = 𝑆𝑡 𝐶𝑐 𝐻𝐿𝐶 𝐹 100 100 𝑆𝑐 𝑚 Sc, St Lần lượt diện tích đỉnh dung dịch chuẩn thử Cc Nồng độ (mg/ml) dung dịch chuẩn HLC Độ tinh khiết (%) chuẩn F Độ pha loãng mẫu thử m Khối lượng (g) mẫu thử 2.6 PHẦN TRĂM NANG HÓA VÀ HIỆU SUẤT NANG HÓA: PHƯƠNG PHÁP SIÊU LỌC 2.6.1 Thiết bị thử nghiệm Dụng cụ lọc với màng có kích thước lỗ lọc 3.000 Da 2.6.2 Cách tiến hành Cân xác khoảng 250 mg mẫu vào ngăn dụng cụ lọc Ly tâm 20.000 vòng/phút (tương đương 29.060 g) 20 phút (2 lần) Thu dịch lọc định lượng artemisinin tự HPLC 2.6.3 Tính phần trăm nang hóa hiệu suất nang hóa 𝑃ℎầ𝑛 𝑡𝑟ă𝑚 𝑛𝑎𝑛𝑔 ℎó𝑎 (%) = 𝐻𝑖ệ𝑢 𝑠𝑢ấ𝑡 𝑛𝑎𝑛𝑔 ℎó𝑎 (%) = 𝑛1 𝑥 100 𝑛2 𝑛1 𝑥 100 𝑛3 n1 Lượng hoạt chất nang hóa n2 Lượng lipid n3 Lượng hoạt chất định lượng toàn phần Lượng hoạt chất định lượng toàn phần lượng hoạt chất tiểu phân mơi trường phân tán Lượng hoạt chất nang hóa hiệu số lượng hoạt chất định lượng toàn phần hoạt chất môi trường phân tán tán – lượng hoạt chất tự do, không nang hóa tiểu phân 2.7 PHĨNG THÍCH HOẠT CHẤT: PHƯƠNG PHÁP KHUẾCH TÁN QUA MÀNG 2.7.1 Thiết bị thử nghiệm Túi thẩm tách có chiều dài cm (diện tích 3,2 cm2 tương ứng với cm chiều dài túi) tạo thành cách kẹp kín hai đầu màng bán thấm có MWCO 6.000–8.000 kẹp kẹp từ Màng bán thấm ngâm nước cất hai lần (1 giờ), rửa nước cất hai lần (3 lần) trước sử dụng 2.7.2 Điều kiện thử nghiệm Môi trường thử nghiệm 500 ml đệm phosphat pH 6,8 có natri laurylsulfat 0,5% Nhiệt độ mơi trường thử nghiệm: 37 ± 0,5 oC Tốc độ quay: 100 vũng/phỳt Thi im ly mu: ẳ gi, ẵ gi, ắ giờ, giờ, giờ, 3,5 giờ, Thể tích lấy mẫu: ml, bù dịch mơi trường đệm với thể tích tương ứng Lọc mẫu qua màng lọc 0,2 µm định lượng HPLC 2.7.3 Cách tính lượng hoạt chất khuếch tán (mg/cm2) thời điểm i 𝑋𝑖 (mg/cm2 ) = 𝑆𝑡 𝐶𝑐 𝐻𝐿𝐶 𝑉 100 + 𝑋 𝑆𝑐 𝑚1 d 3,2 100 𝑖−1 i Thời điểm lấy mẫu Sc, St Lần lượt diện tích đỉnh dung dịch chuẩn thử Cc, HLC Lần lượt nồng độ (mg/ml) độ tinh khiết (%) chuẩn Xi Lượng hoạt chất khuếch tán mẫu thử thời điểm i V Thể tích (ml) mơi trường thử nghiệm m1 Khối lượng (g) mẫu thử nghiệm d Chiều dài túi thẩm tách (cm) 3,2 Diện tích (cm2) ứng với cm chiều dài túi III BẢO QUẢN Bảo quản: Trong tủ lạnh, nhiệt độ ± oC TP Hồ Chí Minh, ngày 17 tháng 05 năm 2017 Người soạn tiêu chuẩn DS KHƯU MỸ LỆ ...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHƯU MỸ LỆ KHƯU BÀO CHẾ HỆ TIỂU PHÂN NANO ARTEMISININ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG DIỆT KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT TRÊN CHUỘT Chuyên... 4.2 Công thức quy trình bào chế hệ tiểu phân nano ART 128 4.3 Tính chất hệ tiểu phân nano ART 136 4.4 Tác động diệt ký sinh trùng sốt rét hệ tiểu phân nano ART chuột gây nhiễm Plasmodium... chất, tăng thời gian tác dụng thuốc nhằm hạn chế đề kháng [34], [121] Với mục đích đó, đề tài ? ?Bào chế hệ tiểu phân nano artemisinin đánh giá tác động diệt ký sinh trùng sốt rét chuột? ?? thực với nội