Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học một số loài thuộc chi Chòi mòi (Antidesma) ở Việt Nam (tt)

Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học một số loài thuộc chi Chòi mòi (Antidesma) ở Việt Nam (LA tiến sĩ)Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học một số loài thuộc chi Chòi mòi (Antidesma) ở Việt Nam (LA tiến sĩ)Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học một số loài thuộc chi Chòi mòi (Antidesma) ở Việt Nam (LA tiến sĩ)Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học một số loài thuộc chi Chòi mòi (Antidesma) ở Việt Nam (LA tiến sĩ)Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học một số loài thuộc chi Chòi mòi (Antidesma) ở Việt Nam (LA tiến sĩ)Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học một số loài thuộc chi Chòi mòi (Antidesma) ở Việt Nam (LA tiến sĩ)Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học một số loài thuộc chi Chòi mòi (Antidesma) ở Việt Nam (LA tiến sĩ)Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học một số loài thuộc chi Chòi mòi (Antidesma) ở Việt Nam (LA tiến sĩ)Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học một số loài thuộc chi Chòi mòi (Antidesma) ở Việt Nam (LA tiến sĩ)Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học một số loài thuộc chi Chòi mòi (Antidesma) ở Việt Nam (LA tiến sĩ)Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học một số loài thuộc chi Chòi mòi (Antidesma) ở Việt Nam (LA tiến sĩ)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - LÊ CẢNH VIỆT CƯỜNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC MỘT SỐ LỒI THC CHI CHỊI MỊI (ANTIDESMA) Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa Hữu Mã số : 62.44.01.14 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2017 Cơng trình hồn thành tại: Học Viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS TS Phan Văn Kiệm Người hướng dẫn khoa học 2: PGS TS Lê Mai Hương Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học Viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi , ngày Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học Viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Hà Nội tháng năm 2017 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), có khoảng 80% dân số sử dụng y học cổ truyền, đặc biệt dược liệu chăm sóc sức khỏe ban đầu Trong trình nghiên cứu phát triển thuốc kinh nghiệm sử dụng thuốc dân gian yếu tố quan trọng làm tăng tỷ lệ thành cơng tìm kiếm hợp chất dẫn đường (lead compounds) để tổng hợp thuốc thông qua việc giảm thời gian, tiết kiệm chi phí độc hại với thể sống Do đó, dược liệu đối tượng thu hút mạnh mẽ quan tâm nhà khoa học giới nghiên cứu tìm kiếm hoạt chất Theo Từ điển thuốc Việt Nam, chi Chòi mòi (Antidesma) Việt Nam có đến 11 lồi sử dụng làm thuốc dược liệu chữa bệnh như: ban nóng, lưỡi đóng rêu, đàn bà kinh nguyệt khơng đều, ngực bụng đau, đàn ơng cước khí thấp tê, giang mai, dày, sởi, thủy đậu, Các nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học cho thấy chi Antidesma chứa nhiều lớp chất đáng quan tâm alkaloid, terpenoid, steroid, megastigmane, flavonoid, lignanoid số dạng phenolic khác Các nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học cho thấy dịch chiết hợp chất phân lập từ lồi thuộc chi có hoạt tính đáng quan tâm như: gây độc tế bào ung thư, chống oxi hóa, trị tiểu đường, kháng vi sinh vật, Do đó, chúng tơi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học số lồi thuộc chi Chòi mòi (Antidesma) Việt Nam” Mục tiêu nghiên cứu luận án Nghiên cứu thành phần hóa học chủ yếu ba loài A acidum, A hainanensis A ghaesembilla Việt Nam Đánh giá hoạt tính sinh học hợp chất phân lập để tìm kiếm hoạt chất tiềm Các nội dung nghiên cứu luận án: Phân lập hợp chất từ ba loài A acidum, A hainanensis A ghaesembilla Việt Nam phương pháp sắc ký; Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập phương pháp vật lý, hóa học; Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào số hợp chất phân lập được; Đánh giá hoạt tính kháng viêm số hợp chất phân lập CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Phần trình bày tổng quan nghiên cứu nước quốc tế thành phần hóa học hoạt tính sinh học chi Antidesma CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1 Đối tượng nghiên cứu Lá loài A acidum thu Tam Đảo, Vĩnh Phúc, Việt Nam vào tháng 3/2013 Lá lồi A ghaesembilla thu Bn Đơn, Đắk Lắk, Việt Nam vào tháng 3/2013 Lá loài A hainanenis thu Tam Đảo, Vĩnh Phúc, Việt Nam vào tháng 12/2014 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp phân lập hợp chất Phối hợp phương pháp sắc ký bao gồm: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lớp mỏng điều chế sắc ký cột (CC) 2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học hợp chất Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học hợp chất kết hợp thông số vật lý với phương pháp phổ đại bao gồm: phổ khối (ESI-MS), phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS), độ quay cực ([]D), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), phổ lưỡng sắc tròn (CD) 2.2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học Hoa ̣t tiń h gây đô ̣c tế bào của các hoa ̣t chấ t đươ ̣c xác định theo phương pháp MTT Hoạt tính kháng viêm thơng qua ức chế sản sinh NO dòng tế bào BV2 kích thích LPS 2.3 Phân lập hợp chất 2.3.1 Phân lập hợp chất từ loài A hainanensis Phần trình bày trình phân lập hợp chất từ lồi A hainanensis Hình 2.4 Sơ đồ phân lập hợp chất từ loài A hainanensis 2.3.2 Phân lập hợp chất từ lồi A acidum Phần trình bày q trình phân lập hợp chất từ lồi A acidum Hình 2.5 Sơ đồ phân lập hợp chất từ loài A acidum 2.3.3 Phân lập hợp chất từ lồi A ghaesembilla Phần trình bày q trình phân lập hợp chất từ lồi A ghaesembilla Hình 2.6 Sơ đồ phân lập hợp chất từ lồi A ghaesembilla 2.4 Thơng số vật lý kiện phổ hợp chất 2.4.1 Thông số vật lý kiện phổ hợp chất phân lập từ lồi A hainanensis Phần trình bày thông số vật lý kiện phổ 18 hợp chất phân lập từ loài A hainanensis 2.4.2 Thông số vật lý kiện phổ hợp chất phân lập từ loài A acidum Phần trình bày thơng số vật lý kiện phổ 12 hợp chất phân lập từ loài A acidum 2.4.3 Thông số vật lý kiện phổ hợp chất phân lập từ loài A ghaesembilla Phần trình bày thơng số vật lý kiện phổ 14 hợp chất phân lập từ lồi A ghaesembilla 2.5 Kết thử hoạt tính hợp chất phân lập 2.5.1 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư hợp chất phân lập từ loài A acidum - 12 hợp chất (AC1-AC12) đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư HL-60 theo phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào MTT Bảng 2.1 % ức chế dòng tế bào HL-60 hợp chất AC1-AC12 nồng độ 100 µM Hợp chất Tỷ lệ ức chế (%) Hợp chất Tỷ lệ ức chế (%) AC1 95,18 ± 0,55 AC7 95,22 ± 0,20 AC2 42,10 ± 2,68 AC8 95,29 ± 0,53 AC3 93,95 ± 0,74 AC9 47,30 ± 3,20 AC4 95,00 ± 0,46 AC10 95,55 ± 0,12 AC5 94,99 ± 0,98 AC11 48,93 ± 4,44 AC6 95,51 ± 0,11 AC12 36,17 ± 3,96 Bảng 2.2 Kết đánh giá hoạt tính gây độc dòng tế bào HL-60 dòng tế bào HEL-299 theo nồng độ hợp chất AC1, AC3-AC8 AC10 IC50 (µM) Hợp chất HL-60 IC50 (µM) Hợp HEL-299 chất HL-60 HEL-299 AC1 4,8 ± 0,2 >100 AC6 22,5 ± 0,9 >100 AC3 26,4 ± 0,6 >100 AC7 28,1 ± 0,2 >100 AC4 8,0 ± 0,9 >100 AC8 25,4 ± 0,8 >100 AC5 24,8 ± 0,7 >100 AC10 44,7 ± 3,3 >100 ĐC* 6,8 ± 0,9 >100 *ĐC: Mitoxantrone sử dụng chất đối chứng dương 2.5.2 Kết thử hoạt tính kháng viêm hợp chất phân lập từ loài A hainanensis - Kết sàng lọc hoạt tính kháng viêm thơng qua ức chế sản sinh NO dòng tế bào BV-2 kích thích LPS 18 hợp chất (AH1-AH18) Bảng 2.3 % Ức chế sản sinh NO tế bào BV2 kích thích LPS hợp chất AH1-AH18 nồng độ 80 µM Hợp chất Tỷ lệ ức chế (%) Hợp chất Tỷ lệ ức chế (%) Hợp chất Tỷ lệ ức chế (%) AH1 90,1 ± 5,0 AH7 92,0 ± 4,1 AH13 62,2 ± 3,7 AH2 79,8 ± 4,6 AH8 96,7 ± 3,7 AH14 89,6 ± 6,7 AH3 83,2 ± 6,3 AH9 26,2 ± 4,3 AH15 95,3 ± 3,8 AH4 73,1 ± 5,3 AH10 41,8 ± 6,6 AH16 35,4 ± 3,6 AH5 86,5 ± 5,2 AH11 33,7 ± 5,8 AH17 24,0 ± 4,9 AH6 47,4 ± 7,5 AH12 38,7 ± 6,2 AH18 87,5 ± 4,1 ĐC* 85,0 ± 5,1 *ĐC: Butein (10 µM) sử dụng chất đối chứng dương Bảng 2.4 Kết đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO tế bào BV2 kích thích LPS hợp chất AH1-AH5, AH7, AH8, AH13-AH15 AH18 Hợp chất IC50 (µM) Hợp chất IC50 (µM) AH1 10,8 ± 1,1 AH8 5,3 ± 0,4 AH2 15,1 ± 1,2 AH13 48,2 ± 6,8 AH3 21,2 ± 3,1 AH14 8,6 ± 1,1 AH4 67,9 ± 26,0 AH15 5,0 ± 0,2 AH5 19,0 ± 0,9 AH18 7,4 ± 1,8 AH7 26,3 ± 1,3 ĐC* 3,8 ± 0,6 *ĐC: Butein sử dụng chất đối chứng dương 2.5.3 Kết thử hoạt tính kháng viêm hợp chất phân lập từ loài A ghaesembilla - Kết sàng lọc hoạt tính kháng viêm thơng qua ức chế sản sinh NO dòng tế bào BV-2 kích thích LPS 14 hợp chất (AG1-AG14) Bảng 2.5 % Ức chế sản sinh NO tế bào BV2 kích thích LPS hợp chất AG1-AG14 nồng độ 80 µM Hợp chất Tỷ lệ ức chế (%) Hợp chất Tỷ lệ ức chế (%) AG1 79,0 ± 5,6 AG6 62,4 ± 5,5 AG11 56,0 ± 6,3 AG2 96,0 ± 5,0 AG7 74,3 ± 5,7 AG12 95,0 ± 5,1 AG3 83,3 ± 4,6 AG8 105,0 ± 2,6 AG13 64,7 ± 4,9 AG4 77,2 ± 5,1 AG9 66,3 ± 4,0 AG14 40,1 ± 4,3 AG5 81,2 ± 4,4 AG10 68,3 ± 4,0 ĐC* 85,0 ± 5,1 Hợp chất *ĐC: Butein (10 µM) sử dụng chất đối chứng dương Tỷ lệ ức chế (%) Bảng 2.6 Kết đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO tế bào BV2 kích thích LPS hợp chất AG1-AG13 Hợp chất IC50 (µM) Hợp chất IC50 (µM) AG1 37,3 ± 8,7 AG8 5,4 ± 0,6 AG2 23,8 ± 3,1 AG9 48,3 ± 7,3 AG3 36,3 ± 3,8 AG10 50,2 ± 5,4 AG4 9,5 ± 1,3 AG11 72,7 ± 20,9 AG5 32,4 ± 9,9 AG12 21,4 ± 4,4 AG6 62,4 ± 11,2 AG13 44,3 ± 8,9 AG7 56,6 ± 5,7 ĐC* 3,8 ± 0,6 *ĐC: Butein sử dụng chất đối chứng dương CHƯƠNG THẢO LUẬN KẾT QUẢ 3.1 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ lồi A hainanensis Phần trình bày kết phân tích phổ xác định cấu trúc 18 hợp chất phân lập từ loài A hainanensis AH1: (7S,7'R,8S,8'R) -3,3'-Dimethoxy7,7'-epoxylignan-4,4',9-triol 4-O-β-Dglucopyranoside (hợp chất mới) AH2: 9-O-formylaviculin (hợp chất mới) 11 proton thuộc hai nhóm oxymethine δH 4,40 (1H, d, J = 9,0 Hz), 5,20 (1H, d, J = 8,5 Hz); proton anome đơn vị đường δH 4,92 (1H, d, J = 7,5 Hz); hai nhóm methoxy δH 3,88 (3H, s), 3,91 (3H, s) nhóm methyl δH 1,14 (3H, d, J = 6,5 Hz) Hình 3.1 Phổ HR-ESI-MS AH1 Hình 3.2 Phổ 1H-NMR AH1 Phổ 13C-NMR DEPT AH1 xuất tín hiệu 26 carbon, bao gồm: sáu carbon không liên kết trực tiếp với hydro, 15 nhóm methine, hai nhóm methylene ba nhóm methyl Sự có mặt proton anome δH 4,92 (1H, d, J = 7,5 Hz) sáu carbon đặc trưng đơn vị đường glucopyranose C 62,5 (CH2), 71,4 (CH), 74,9 (CH), 77,8 (CH), 78,2 (CH), 102,8 (CH) cho phép dự đốn có mặt phần đường βglucopranose Bên cạnh số liệu phổ 1D-NMR, với có mặt hai nhóm oxymethine C-7 (δC 82,6), C-7 (δC 89,3) số liên kết đơi tương đương AH1 tính 10, dự đốn hợp chất AH1 tetrahydrofuran lignan glycoside [Phytochemistry, 55, 843 (2000)] Hình 3.3 Phổ 13C-NMR AH1 Hình 3.4 Phổ DEPT AH1 12 Phân tích tương tác phổ HSQC cho phép gán tín hiệu proton liên kết trực tiếp với carbon Trên phổ 1H-1H COSY, nhận thấy có tương tác H-7 (δH 5,20) với H-8 (δH 2,40); H-8 (δH 2,40) với H-9 (δH 3,29, 3,21)/H-8 (δH 2,08); tương tác H-7 (δH 4,40) với H-8 (δH 2,08) H-8 (δH 2,08) với H-9 (δH 1,14)/H-8 (δH 2,40) cho phép gắn kết mảnh cấu trúc C-7/C-8/C-9; C-7/C-8/C-9; liên kết hai mảnh cấu trúc C-8/C-8′, góp phần khẳng định AH1 tetrahydrofuran lignan Trên phổ HMBC nhận thấy có tương tác H-7 (δH 5,20) với C-1 (δC 135,8)/ C-2 (δC 112,7)/ C-6 (δC 120,7), cho phép xác định giá trị độ dịch chuyển hóa học C-1, C-2 C-6 Tương tác HMBC H-2 (δH 7,08) H-6 (δH 6,99) với C-4 (δC 147,2)/ C-7 (δC 82,6) H-5 (δH 7,18) với C-1 (δC 135,8)/ C-3 (δC 150,4) cho phép xác định giá trị độ chuyển dịch hóa học carbon lại (C-3, C-4, C-5) thuộc vòng thơm thứ nhất, gắn với C-7 Tương tự, vị trí giá trị độ chuyển dịch hóa học carbon/proton thuộc vòng thơm lại C-7 xác định dựa vào tương tác HMBC H-7 (δH 4,40) với C-1 (δC 133,0)/ C-2 (δC 111,7)/ C-6 (δC 120,7), H-2 (δH 7,10)/ H-6 (δH 6,97) với C-4 (δC 147,6)/ C-7 (δC 89,3) H-5 (δH 6,84) với C-1 (δC 133,0)/ C-3 (δC 149,1) Vị trí nhóm methoxy glucopyranose C-3 C4 xác định dựa vào tương tác HMBC proton nhóm 3-OCH3 (δH 3,88) với C-3 (δC 150,4) proton anome H-1 (δH 4,92) với C4 (δC 147,2) Vị trí nhóm methoxy nhóm hydroxy C-3, C-4 xác định dựa vào tương tác HMBC proton nhóm 3OCH3 (δH 3,91) với C-3 (δC 149,1) độ dịch chuyển hóa học C-4 (δC 147,6) Vị trí nhóm hydroxy tự gắn vào C-9 xác định dựa vào giá trị độ chuyển dịch hóa học C-9 (δC 63,6) tương tác HMBC H-9 (δH 3,21, 3,29) với C-7 (δC 82,6)/ C-8 (δC 54,4)/ C-8 (δC 46,2) Ngoài ra, kết thủy phân AH1 môi trường acid thu đường D-glucose (so sánh với đường chuẩn GC) [Chem Pharm Bull., 57, 986 (2009)] khẳng định phần đường D-glucose 13 Hình 3.8 Các tương tác 1H-1H COSY, HMBC NOESY AH1 max (mdeg): 238 (+ 0,28) 223 (-0,36) λmax (Δε): 236 (+1,60) 219 (−0,23) AH1 Schisphenlignan G (AH1a) Hình 3.9 Cấu trúc giá trị phổ CD AH1 hợp chất tham khảo Cấu hình tuyệt đối AH1 xác định dựa phân tích phổ NOESY CD Trên phổ NOESY xuất tương tác H-7 (δH 5,20)/ H-8 (δH 2,40)/ H-9 (δH 1,14)/ H-7 (δH 4,40) gợi ý proton nằm gần giả định chúng định hướng β Hơn nữa, phổ CD AH1 có hiệu ứng Cotton dương bước sóng 238 (+ 0,28 mdeg) Cotton âm bước sóng 223 (-0,36 mdeg), phù hợp với hiệu ứng Cotton hợp chất schisphenlignan G (AH1a) λmax (Δε): 236 (+1,60) 219 (−0,23) [Fitoterapia, 86, 171 (2013)] cho phép xác định cấu hình tuyệt đối AH1 giống với AH1a 7S,7R,8S,8R Ngoài ra, cấu hình tuyệt đối vị trí C-7/C-7 hợp chất AH1 xác định dựa vào quy tắc phản xạ bất đối dương (positive exciton chirality) hợp chất có cấu trúc hóa học tương tự hợp chất AH1 công bố [J Nat Prod 74, 1444 (2011)] Từ phân tích trên, hợp chất AH1 xác định (7S,7R,8S,8R)-3,3- dimethoxy-7,7-epoxylignan-4,4,9-triol 14 4-O-β-D-glucopyranoside Tra cứu sở liệu Scifinder cho phép kết luận hợp chất Bảng 3.1 Số liệu phổ NMR hợp chất AH1 C δ Ca 135,8 112,7 150,4 147,2 117,4 120,7 82,6 54,4 63,6 DEPT C CH C C CH CH CH CH CH2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 133,0 111,7 149,1 147,6 116,2 120,7 89,3 46,2 16,6 C CH C C CH CH CH CH CH3 δHa (độ bội, J, Hz) 7,08 (d, 1,5) 7,18 (d, 8,5) 6,99 (dd, 1,5, 8,5) 5,20 (d, 8,5) 2,40 (m) 3,29 (dd, 7,5, 10,5) 3,21 (dd, 6,5, 10,5) 7,10 (d, 1,5) 6,84 (d, 8,5) 6,97 (dd, 1,5, 8,5) 4,40 (d, 9,0) 2,08 (m) 1,14 (d, 6,5) 56,7 56,5 CH3 CH3 3,88 (s) 3,91 (s) 102,8 74,9 77,8 71,4 78,2 62,5 CH CH CH CH CH CH2 4,92 (d, 7,5) 3,53 (dd, 7,5, 9,0) 3,49 (dd, 9,0, 9,0) 3,42* 3,42* 3,71 (dd, 5,0, 12,0) 3,90* 3-OCH3 3-OCH3 4-OGlc 1 2 3 4 5 6 a) đo CD3OD; *) tín hiệu bị che khuất 15 3.2 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập từ loài A acidum Phần trình bày kết phân tích phổ xác định cấu trúc 12 hợp chất phân lập từ loài A acidum AC1: Clauszoline B AC2: Clauszoline H AC4: 7-Methoxymukonal AC7: Xanthoxyletin AC5: Heptaphyline AC8: Alloxanthoxyletin AC10: p-Methoxycinnamaldehyde AC3: Mukonal AC6: 5-Demethyltoddaculin AC9: (E)-p-Propenylphenol O-β-D-glucopyranoside AC11: trans-4Methoxycinnamyl alcohol AC12: Vanilin Dưới trình bày chi tiết phương pháp xác định cấu trúc hợp chất có hoạt tính mạnh 3.2.1 Hợp chất AC1 : Clauszoline B Hợp chất AC1 thu dạng chất bột, màu vàng Trên phổ 1HNMR AC1 cho thấy xuất tín hiệu sáu proton thuộc hai nhóm methyl H 1,51 (6H, s); bốn proton thơm H 6,85 (1H, s), 6,92 (1H, d, J = 7,5 Hz), 7,45 (1H, d, J = 7,5 Hz), 8,09 (1H, s); hai proton 16 olefin H 5,63 (1H, d, J = 10,0 Hz), 6,48 (1H, d, 10,0 Hz) cho phép dự đốn có mặt liên kết CH=CH cấu hình Z, proton H 8,37 (1H, s) gọi ý có mặt nhóm NH proton H 9,91 (1H, s) gợi ý có mặt nhóm aldehyde Trên phổ 13C-NMR, DEPT AC1 cho thấy tín hiệu 17 carbon Trong đó, có hai nhóm methyl C 28,2; sáu nhóm methine C 97,1, 111,7, 119,6, 122,7, 127,4, 129,4; tám carbon không liên kết trực tiếp với hydro C 115,6, 118,1, 118,4, 124,9, 129,3, 138,2, 145,8, 161,3; nhóm aldehyde C 195,2 Trên phổ HMBC cho thấy có tương tác H-5 (H 7,45) với C4a (C 118,4)/ C-7 (C 118,1)/ C-8a (C 129,3); H-6 (H 6,92) với C5a (C 124,9)/ C-8 (C 138,2) xác định vị trí giá trị độ chuyển dịch hóa học carbon thuộc vòng thơm thứ Tương tự, vị trí giá trị độ chuyển dịch hóa học carbon thuộc vòng thơm lại xác định dựa vào tương tác HMBC H-1 (H 6,85) với C-3 (C 115,6)/ C4a (C 118,4) H-4 (H 8,09) với C-1a (C 145,8)/ C-2 (C 161,3) Tương tác HMBC H-4 (H 8,09) với C-5a (C 124,9), H-5 (H 7,45) proton nhóm NH (H 8,37) với C-4a (C 118,4) với giá trị độ dịch chuyển hóa học C-1a (C 145,8) C-8a (C 129,3) gợi ý hai vòng thơm gắn kết với qua cầu C-4a/C-5a C-1a/C-8a qua cầu nitơ Cấu trúc khung AC1 dự đoán carbazole alkaloid Vị trí nhóm hydroxy C-2 nhóm aldehyde C-3 xác định dựa vào giá trị độ chuyển dịch hóa học C-2 (C 161,3) tương tác HMBC proton nhóm aldehyde (H 9,91) với C-2 (C 161,3)/ C-3 (C 115,6)/ C-4 (C 127,4) Bên cạnh đó, tương tác HMBC H-1 (H 6,48)/ H-2 (H 5,63) với C-3 (C 77,2) tương tác H-4/H-5 (H 1,51) với C-2 (C 129,4)/ C-3 (C 77,2) gợi ý có mặt nhóm isoprenyl với liên kết đơi C-1/C-2 Tương tác HMBC H-1 (H 6,48)/ H-2 (H 5,63) với C-7 (C 118,1) giá trị độ dịch chuyển hóa học C-8 (C 138,2) gợi ý nhóm isoprenyl liên kết với khung carbazole C-1/C-7 C-3/C-8 thông qua cầu oxy 17 Bảng 3.20 Số liệu phổ NMR hợp chất AC1 hợp chất tham khảo C δC # δ Ca 96,72 97,1 1a 146,58 DEPT δHa (độ bội, J, Hz) CH 6,85 (s) 145,8 C - 160,73 161,3 C - 115,47 115,6 C - 127,68 127,4 CH 8,09 (s) 4a 118,04 118,4 C - 111,81 111,7 CH 7,45 (d, 7,5) 5a 125,13 124,9 C - 119,21 119,6 CH 6,92 (d, 7,5) 118,04 118,1 C - 138,23 138,2 C - 8a 129,77 129,3 C - 1′ 122,63 122,7 CH 6,48 (d, 10,0) 2′ 129,35 129,4 CH 5,63 (d, 10,0) 3′ 76,69 77,2* C - 4′ 27,28 28,2 CH3 1,51 (s) 5′ 27,28 28,2 CH3 1,51 (s) 195,76 195,2 CH 9,91 (s) 3-CHO đo CDCl3; #)C hợp chất clauszoline B đo acetone-d6 [ Chem Eur J., 20, 8536 (2014)] *) Tín hiệu chị che khuất a) Hình 3.41 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC hợp chất AC1 18 So sánh số liệu phổ 13C-NMR hợp chất AC1 với clauszoline B [Chem Eur J., 20, 8536 (2014)] cho thấy số liệu phù hợp cho tất vị trí Cho phép khẳng định AC1 clauszoline B Bên cạnh đó, phổ khối lượng ESI-MS xuất píc ion giả phân tử [M+H]+ m/z 294, hồn tồn phù hợp với cơng thức phân tử: C18H15 O3N (M = 293), điều minh chứng cho kết luận Hợp chất clauszoline B phân lập lần từ loài Clausena excavata [Chem Pharm Bull., 44, 2231 (1996)] Tuy nhiên, lần hợp chất clauszoline B phân lập từ chi Antidesma 3.3 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập từ loài A ghaesembilla Phần trình bày kết phân tích phổ xác định cấu trúc 14 hợp chất phân lập từ loài A ghaesembilla AG1: Antidesoic acid A (hợp chất mới) AG2: Antidesoic acid B (hợp chất mới) AG3: Vitexin AG4: Orientin AG5: Isovitexin AG6: Homoorientin AG7: Luteolin-4′-O-β-D-glucopyranoside AG8: Amentoflavone 19 AG9: Vanillyl alcohol 4-Oβ-D-glucopyranoside AG12: 3,4,5Trimethoxyphenyl-O-β-Dglucopyranoside AG10: 4-Hydroxy-3,5dimethoxybenzyl-O-β-Dglucopyranoside AG13: Sinapyl alcohol 4O-β-D-glucopyranoside AG11: 3-Hydroxy-4,5dimethoxyphenyl-O-β-Dglucopyranoside AG14: (–)-Syringaresinol 3.4 Hoạt tính sinh học hợp chất phân lập 3.4.1 Hoạt tính gây độc tế bào hợp chất phân lập từ loài A acidum Mười hai hợp chất (AC1-AC12) phân lập từ loài A acidum đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư máu cấp (HL-60) (Bảng 2.1 2.2.) Kết cho thấy hợp chất AC1 thể hoạt tính mạnh với giá trị IC50 4,8 µM (tương đương với chất đối chứng dương mitoxantrone, IC50 6,8 µM) Các hợp chất AC3-AC8, AC10 thể hoạt tính yếu với giá trị IC50 khoảng 8,0 µM đến 44,7 µM Bên cạnh đó, hợp chất kiểm tra khả gây độc dòng tế bào mơ phổi thường HEL-299 (Bảng 2.2.) Kết cho thấy, hợp chất ảnh hưởng đến phát triển bình thường dòng tế bào thử nghiệm (HEL-299) với giá trị IC50 >100 µM Hợp chất AC1 có hoạt tính mạnh lựa chọn để nghiên cứu chế gây chết tế bào Tế bào ung thư HL-60 xử lý với hợp chất AC1 (4,8 µM) 24 48 Kết cho thấy mẫu xử lý với AC1 24 xuất biểu đặc trưng hình thái nhân tế bào chết theo chương trình co lại phát sáng nhuộm với thuốc thử Hoechst 33342, gia tăng tế bào siêu lưỡng bội giai 20 đoạn sub-G1 Các thể đặc trưng xuất nhiều mẫu thử xử lý với hợp chất AC1 48 Một số protein đặc trưng cho trình tế bào chết theo chương trình như: Bcl-2, Bax, Caspase-3, Caspase-9, PARP… Ở cấp độ protein, xử lý với hợp chất AC1 (4,8 µM) 24 48 giờ, quan sát thấy thay đổi biểu protein liên quan đến trình tự chết tế bào như: tăng cường biểu Bax, Caspase-3 PARP, giảm độ biểu Bcl-2 Những kết cho thấy hợp chất AC1 gây nên trình chết theo chương trình tế bào thơng qua làm thay đổi mức độ biểu protein liên quan tế bào ung thư HL-60 (tăng biểu Bax, Caspase-3, PARP giảm biểu Bcl-2) Con đường tín hiệu PI3K/AKT điều hòa sống, tăng trưởng trình chết tế bào Đặc biệt, AKT dạng hoạt hóa tham gia vào q trình sống tăng trưởng tế bào ung thư thông qua protein c-myc, loại protein thường biểu mạnh nhiều dạng khối u Nhằm tìm hiểu xem đường tín hiệu nội bào bị ảnh hưởng AC1, chúng tơi phân tích q trình photphorin hóa AKT độ biểu c-myc thí nghiệm Western-blot Kết cho thấy, sau xử lý với hợp chất AC1, q trình photphorin hóa AKT bị giảm đi, dẫn đến tế bào tự chết Hơn nữa, mức độ biểu c-myc đồng thời thấp Đây chứng cho thấy tác dụng làm tế bào chết theo chương trình hợp chất AC1 thông qua giảm mức độ biểu p-AKT c-myc 3.4.2 Hoạt tính kháng viêm hợp chất phân lập từ loài A hainanensis Trong hợp chất phân lập từ loài A hainanensis, hợp chất AH8, AH14, AH15 AH18 gây ức chế sản sinh NO tế bào BV2 mạnh với giá trị IC50 5,3, 8,6, 5,0 7,4 µM so với chất đối chứng dương (butein, IC50 = 3,8 µM) Các hợp chất AH1-AH3, AH5 AH7 thể hoạt tính yếu với giá trị IC50 từ 10,8 đến 26,3 µM Trong hợp chất phân lập từ loài A hainanensis, hợp chất lignan glycoside (AH1-AH3, AH5) có hoạt tính ức chế sản sinh NO tốt so với hợp chất lignan khơng có phần glycoside (AH4) Bên cạnh đó, 21 hợp chất megastigmane có nhóm carbonyl C-9 (AH14, AH15) thể hoạt tính mạnh hẳn so với hợp chất megastigmane khơng có nhóm carbonyl C-9 (AH11-AH13) Như hợp chất phân lập được, hợp chất ligan có mặt phần đường nhóm carbonyl C-9 hợp chất dạng khung megastigmane làm tăng hoạt tính ức chế sản sinh NO tế bào BV2 3.4.3 Hoạt tính kháng viêm hợp chất phân lập từ lồi A ghaesembilla Kết đánh giá hoạt tính kháng viêm thông qua ức chế sản sinh NO tế bào BV2 kích thích LPS 14 hợp chất (AG1AG13) cho thấy, hợp chất AG4 AG8 thể hoạt tính mạnh với giá trị IC50 9,5 5,4 µM so với chất đối chứng dương (butein, IC50 = 3,8 µM) Ngồi trừ hợp chất AG14 khơng thể hoạt tính, 11 hợp chất lại (AG1-AG3, AG5-AG7, AG9-AG13) có hoạt tính mức trung bình với giá trị IC50 khoảng 21,4 µM đến 72,7 µM KẾT LUẬN Đây cơng trình nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học ba lồi A hainanensis, A acidum A ghaesembilla Việt Nam Nghiên cứu thành phần hóa học Sử dụng kết hợp phương pháp sắc ký phương pháp phổ đại phân lập xác định cấu trúc 44 hợp chất từ loài A hainanensis, A acidum, A ghaesembilla Cụ thể: - Từ loài A hainanensis phân lập xác định cấu trúc 18 hợp chất Trong đó, có hai hợp chất (7S,7R,8S,8R)-3,3- dimethoxy7,7-epoxylignan-4,4,9-triol 4-O-β-D-glucopyranoside (AH1) 9-Oformylaviculin (AH2); ba hợp chất lần phân lập từ họ Euphorbiaceae β-D-glucopyranosyl phaseate (AH11), megastigm-7ene-3-ol-9-one 3-O-α-L-arabinofuranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranoside (AH15), lotusanine B (AH18); ba hợp chất lần phân lập từ chi Antidesma (+)-isolariciresinol 9-O-β-D-glucopyranoside (AH3), (+)-lyoniresinol-9-O-β-D-glucopyranoside (AH5), ampelopsisionoside 22 (AH12) 10 hợp chất biết khác (–)-lyoniresinol (AH4), 1-O-(2,4dihydroxy-6-methoxyphenyl)-6-O-(4-hydroxy-3,5dimethoxybenzoyl)-β-D-glucopyranoside (AH6), 4-O-[6-O-(4hydroxy-3,5-dimethoxybenzoyl)-β-D-glucopyranosyl]-3-hydroxy phenethyl alcohol (AH7), 4-hydroxymethyl-2-methoxyphenyl-6-Osyringoyl-β-D-glucopyranoside (AH8), phenethyl α-L-arabinofuranosyl(1→6)-O-β-D-glucopyranoside (AH9), syringoyl-O-β-D-glucopyranoside (AH10), alangioside A (AH13), alangionoside L (AH14), N–transferuloyloctopamide (AH16) trans-linalool-3,6-oxide 7-O-β-Dglucopyranoside (AH17) - Từ loài A acidum phân lập xác định cấu trúc 12 hợp chất Trong đó, có hợp chất lần phân lập từ tự nhiên 5demethyltoddaculin (AC6); bảy hợp chất lần phân lập từ chi Antidesma clauszoline B (AC1), clauszoline H (AC2), mukonal (AC3), 7methoxymukonal (AC4), heptaphyline (AC5), xanthoxyletin (AC7), alloxanthoxyletin (AC8) bốn hợp chất biết khác (E)-p-propenylphenol O-β-D-glucopyranoside (AC9), p-methoxycinnamaldehyde (AC10), trans-4methoxycinnamyl alcohol (AC11), vanilin (AC12) - Từ loài A ghaesembilla phân lập xác định cấu trúc 14 hợp chất Trong đó, có hai hợp chất antidesoic acid A (AG1) antidesoic acid B (AG2); tám hợp chất lần phân lập từ chi Antidesma vitexin (AG3), orientin (AG4), isovitexin (AG5), homoorientin (AG6), 4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzyl-O-β-Dglucopyranoside (AG10), 3-hydroxy-4,5-dimethoxyphenyl-O-β-Dglucopyranoside (AG11), 3,4,5-trimethoxyphenyl-O-β-D-glucopyranoside (AG12), sinapyl alcohol 4-O-β-D-glucopyranoside (AG13) bốn hợp chất biết khác luteolin-4′-O-β-D-glucopyranoside (AG7), amentoflavone (AG8), vanillyl alcohol 4-O-β-D-glucopyranoside (AG9), (–)-syringaresinol (AG14) Nghiên cứu hoạt tính sinh học - Đã tiến hành đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư máu HL-60 12 hợp chất (AC1- AC12) phân lập từ loài A acidum Kết 23 cho thấy, hợp chất AC1 AC4 thể hoạt tính gây độc tế bào mạnh với giá trị IC50 4,8 µM 8,0 µM (tương đương với đối chứng dương mitoxantrone, IC50 = 6,8 µM) Các hợp chất AC3, AC5-8 có hoạt tính ức chế dòng tế bào HL-60 mức độ trung bình với giá trị IC50 khoảng từ 22,5 đến 28,1 µM hợp chất AC10 có hoạt tính yếu với giá trị IC50 = 44,7±3,3 µM Nghiên cứu chế gây chết tế bào ung thư HL-60 hợp chất AC1 theo hình thái tế bào nghiên cứu cấp độ phân tử hợp chất gây chết theo chương trình thông qua thay đổi biểu protein liên quan đến trình tự chết tế bào như: tăng cường biểu Bax, Caspase3 PARP, giảm độ biểu Bcl-2, p-AKT c-myc - Đã nghiên cứu hoạt tính kháng viêm thơng qua ức chế sản sinh NO tế bào BV2 kích thích LPS 18 hợp chất (AH1AH18) phân lập từ loài A hainanensis Kết cho thấy hợp chất AH8, AH14, AH15 AH18 thể hoạt tính mạnh với giá trị IC50 5,3 µM, 8,6 µM, 5,0 µM 7,4 µM so với chất đối chứng dương butein (IC50 = 3,8 µM) - Đã nghiên cứu hoạt tính kháng viêm thơng qua ức chế sản sinh NO tế bào BV2 kích thích LPS 14 hợp chất (AG1AG14) phân lập từ loài A ghaesembilla Kết cho thấy hợp chất AG4 AG8 thể hoạt tính mạnh với giá trị IC50 9,5 5,4 µM so với chất đối chứng dương butein (IC50 = 3,8 µM) KIẾN NGHỊ - Hợp chất AC4 có hoạt tính gây độc mạnh dòng tế bào ung thư máu cấp (HL-60) Vì vậy, cần thêm nghiên cứu sâu chế gây độc tế bào HL-60 hợp chất - Trong thí nghiệm chúng tôi, hợp chất AH8, AH14, AH15, AH18, AG4 AG8 thể hoạt tính ức chế mạnh sản sinh NO BV2 kích thích LPS với giá trị IC 50 khoảng từ 5,0 µM đến 9,5 µM Do vậy, cần nghiên cứu thêm thí nghiệm kháng viêm hợp chất để định hướng cho thực nghiệm in vivo 24 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đây cơng trình nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi A acidum, A hainanensis A ghaesembilla Việt Nam Đã phân lập xác định cấu trúc 44 hợp chất từ loài A acidum, A ghaesembilla A hainanensis Trong đó: - Bốn hợp chất antidesoic acid A, antidesoic acid B, (7S,7R,8S,8R)-3,3- dimethoxy-7,7-epoxylignan-4,4,9-triol 4-O-β-Dglucopyranoside 9-O-formylaviculin - Một hợp chất lần phân lập từ tự nhiên 5demethyltoddaculin - Ba hợp chất lần phân lập từ họ Euphorbiaceae βD-glucopyranosyl phaseate, megastigm-7-ene-3-ol-9-one 3-O-α-Larabinofuranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranoside lotusanine B - 18 hợp chất lần phân lập từ chi Antidesma Lần 12 hợp chất phân lập từ loài A acidum Việt Nam đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư máu cấp (HL-60) Kết hợp chất clauszoline B ,7-methoxymukonal, mukonal, heptaphyline, 5-demethyltoddaculin, xanthoxyletin, alloxanthoxyletin pmethoxycinnamaldehyde thể hoạt tính gây độc tế bào ung thư thử nghiệm với giá trị IC50 từ 4,8 µM đến 44,7 µM Hợp chất clauszoline B thể hoạt tính mạnh lựa chọn để nghiên cứu chế gây chết tế bào ung thư HL-60 Kết cho thấy hợp chất nàycó khả kích thích tế bào ung thư HL-60 chết theo chương trình - Lần 32 hợp chất phân lập từ loài A hainanensis A ghaesembilla Việt Nam đánh giá hoạt tính kháng viêm thơng qua ức chế sản sinh NO tế bào BV2 kích thích LPS Kết hợp chất 4-hydroxymethyl-2-methoxyphenyl-6-Osyringoyl-β-D-glucopyranoside, alangionoside L, megastigm-7-ene-3-ol-9one 3-O-α-L-arabinofuranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranoside, lotusanine B, orientin amentoflavone có hoạt tính mạnh với giá trị IC50 từ 5,0 µM đến 9,5 µM DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ Phan Van Kiem, Le Canh Viet Cuong, Do Thi Trang, Nguyen Xuan Nhiem, Hoang Le Tuan Anh, Bui Huu Tai, Le Mai Huong, Chau Van Minh, Taek Hwan Lee, Sun Yeou Kim, and Seung Hyun Kim New Alkaloids and Antiinflammatory Constituents from the Leaves of Antidesma ghaesembilla Natural Products Communications, 2017, 12 (1), 11-14 Phan V Kiem, Le C V Cuong, Nguyen T Cuc, Nguyen X Nhiem, Hoang L.T Anh, Bui H Tai, Tran H Quang, Chau V Minh, Le M Huong, Eun-Ji Kim, Hee K Kang, and Young H Kim Alkaloids from the leaves of Antidesma acidum and their cytotoxic activity Letters in Organic Chemistry, 2016, 13, 297301 Phan Van Kiem, Le Canh Viet Cuong, Bui Huu Tai, Nguyen Xuan Nhiem, Hoang Le Tuan Anh, Tran Hong Quang, Nguyen Thi Thanh Ngan, Hyuncheol Oh, and Youn Chul Kim New lignans from Antidesma hainanensis inhibit NO production in BV2 microglial cells Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2016, 64, 1707–1712 Le Canh Viet Cuong, Bui Huu Tai, Nguyen Xuan Nhiem, Pham Hai Yen, Hoang Le Tuan Anh, Le Mai Huong, Phan Van Kiem Phenyl derivatives from Antidesma haianensis Journal of Science and Technology, 2017, 55 (1), 8-14 Le Canh Viet Cuong, Do Thi Trang, Nguyen Thi Cuc, Nguyen Xuan Nhiem, Pham Hai Yen, Hoang Le Tuan Anh, Le Mai Huong, Chau Van Minh, and Phan Van Kiem Flavonoid glycosides from Antidesma ghaesembilla Vietnam Journal of Chemistry, 2015, 53 (2e), 94-97 Le Canh Viet Cuong, Do Thi Trang, Nguyen Xuan Nhiem, Pham Hai Yen, Bui Huu Tai, Hoang Le Tuan Anh, Le Mai Huong, Nguyen Quoc Binh, Chau Van Minh, and Phan Van Kiem Phenolic glycosides from Antidesma ghaesembilla Vietnam Journal of Chemistry ,2016, 54(2), 170-174 Le Canh Viet Cuong, Do Thi Trang, Nguyen Xuan Nhiem, Pham Hai Yen, Bui Huu Tai, Hoang Le Tuan Anh, Le Mai Huong, Chau Van Minh, Phan Van Kiem Cyclopeptide alkaloid and lignans from Antidesma hainanensis Merr Vietnam Journal of Chemistry, 2016, 54(6), 663-666 Le Canh Viet Cuong, Do Thi Trang, Nguyen Xuan Nhiem, Pham Hai Yen, Bui Huu Tai, Hoang Le Tuan Anh, Le Mai Huong, Chau Van Minh, Phan Van Kiem Megastigmans and other compounds from Antidesma hainanensis Merr Vietnam Journal of Chemistry, 2016, 54(6) 678-682 ... vi sinh vật, Do đó, chúng tơi lựa chọn đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học số lồi thuộc chi Chòi mòi (Antidesma) Việt Nam Mục tiêu nghiên cứu luận án Nghiên cứu thành phần. .. giá hoạt tính kháng viêm số hợp chất phân lập CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Phần trình bày tổng quan nghiên cứu nước quốc tế thành phần hóa học hoạt tính sinh học chi Antidesma CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ... sởi, thủy đậu, Các nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học cho thấy chi Antidesma chứa nhiều lớp chất đáng quan tâm alkaloid, terpenoid, steroid, megastigmane, flavonoid, lignanoid số