Giáo trình cơng nghệ sinh học Kỹ thuật nhân giống in vitro Líp C©y trång 49C - Nhãm C«ng nghƯ sinh häc n«ng nghiƯp Chun đề Trình bày kỹ thuật nhân giống in vitro o o -Nuôi cấy mô tế bào thực vật phạm trù khái niệm chung cho loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn vi sinh vật, môi trường dinh dưỡng nhân tạo, điều kiện vô trùng Nhân giống vơ tính trồng in vitro hay vi nhân giống (Micropropagation) lĩnh vực ứng dụng có hiệu trơng cơng nghệ ni cấy mơ tế bào thực vật Bao gồm: + Nuôi cấy trưởng thành + Nuôi cấy quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh + Nuôi cấy phôi: phôi non phôi trưởng thành + Nuôi cấy mô sẹo (callus) + Nuôi cấy tế bào đơn + Nuôi cấy protoplast: nuôi cấy phần bên trông tế bào thực vật sâu tách vỏ gọi ni cấy tế bào trần Đây phương pháp nhân giống đại thực phòng thí nghiệm nên gọi phương pháp nhân giống ống nghiệm (in vitro) để phân biệt với q trình ni cấy điều kiện tự nhiên ống nghiệm (in vivo) Khác vối phương pháp nhân giống truyền thống giâm, chiết cành ghép mắt, phương pháp nhân giống in vitro có khả thời gian ngắn tạo số lượng lớn để phủ kín diện tích đất định mà phương pháp nhân giống khác khơng thể thay Ngồi phương pháp không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên nên tiến hành quanh năm Đây hướng ứng dụng rộng rãi Ở Việt Nam có nhiều phòng thí nghiệm ni cấy mơ, nhiều trung tâm sản xuất giống trồng hàng năm cung cấp lượng đáng kể giống có chất lượng cao cho sản xuất chuối, dứa, khoai tây, loại lan, cảnh, lâm nghiệp *Cơ sở khoa học Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào (tissue culture) nói chung kỹ thuật nhân giống vơ tính nói riêng dựa vào sở khoa học tính tồn năng, phân hố phản phân hố - Tính tồn tế bào: Haberland (1902) lần quan niệm tế bào thể sinh vật đa bào có khả tiềm tàng để phát triển thành thể hoàn chỉnh Theo quan điểm sinh học đại tế bào chun hố chứa lượng thông tin di truyền (bộ ADN) tương đương với lượng thông tin di truyền thể trưởng thành Vì vậy, điều kiện định tế bào Líp C©y trång 49C - Nhãm C«ng nghƯ sinh häc n«ng nghiƯp phát triển thành thể hồn chỉnh Đặc tính tế bào gọi tính tồn tế bào Qua người ta biến tế bào (hoặc mẩu mô) thành thể hồn chỉnh ni cấy mơi trường thích hợp có đầy đủ điều kiện cần thiết cho tế bào thực q trình phân hố, phản phân hố - Tính phân hố phản phân hố tế bào + Tính phân hoá tế bào biến đổi tế bào phôi sinh thành tế bào mơ chun hố đảm nhiệm chực khác Trong thể thực vật có khoảng 15 loại mô khác đảm nhiệm chức khác (mơ dậu, mơ dẫn, mơ bì, mơ khuyết…) chúng có nguồn gốc từ tế bào mơi sinh trải qua giai đoạn phân hố tế bào để hình thành mơ riêng biệt + Tính phản phân hố tế bào: dó tế bào phân hố thành mơ riêng biệt với chức khác điều kiện định chúng quay trở trạng thái phơi sinh để phân chia tế bào Trong kỹ thuật nuôi cấy quan dinh dưỡng lá, thân…thì giai đoạn tạo mơ sẹo tế bào quay trở trạng thái phơi sinh có khả phân chia liên tục mà hẳn chức quan dinh dưỡng lá, thân… trước Sự phân hố phản phân hố tế bào phơi sinh tế bào chuyên hoá biểu diễn theo sơ đồ sau: Phân hoá tế bào Tế bào phơi sinh Tế bào chun hố Phản phân hố tế bào Về chất phân hoá phản phân hố q trình hoạt hố gen, thời điểm q trình phát triển thể số gen hoạt hố số gen khác bị ức chế Điều xảy theo chương trình mã hố cấu trúc phân tử ADN Khi nằm thể hồn chỉnh tế bào có ức chế lẫn nhau, tách rời điều kiện định gen hoạt hố dễ dàng nên chúng có khả mở tất gen để hình thành thể Đó sở làm tảng cho kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào *Các ứng dụng Đây lĩnh vực mà nuôi cấy mô tế bào thực vật mang lại hiệu kinh tế to lớn thực Một ưu việt phương pháp nhân giống in vitro việc sử dụng mơ ni cấy kích thước nhỏ Ở kích thước nhỏ, tương tác tế bào mô đơn giản Tác động phương pháp hiệu Mô nuôi cáy dễ phân hố sau dễ tái sinh Kỹ thuật nhân nhanh in vitro có ưu việt mà phương pháp khác khơng có là: nhân giống trồng quy mô công nghiệp (kể đối Líp C©y trång 49C - Nhãm C«ng nghƯ sinh häc n«ng nghiƯp tượng khó nhân phương pháp thơng thường), phương pháp có hệ số nhân cao cho cá thể hoàn toàn đồng mặt di truyền Ứng dụng: - Duy trì nhân nhanh kiểu gen quý làm vật liệu cho công tác chọn tạo giống - Nhân nhanh trì cá thể đầu dòng tốt để cung cấp giống loại trống khác + Nhân nhanh loài hoa, cảnh khó trồng hạt + Duy trì nhân nhanh dòng bố mẹ dòng lai để tạo hạt giống rau, hoa loại trồng khác + Nhân nhanh kết hợp với làm virus + Bảo quản tạp đoàn gen, đặc biệt với loại dễ bị nhiếm bệnh điều kiện tự nhiên, hoặccác dễ bị giao phấn Với phương pháp nhiều giống hoa (hoa lan, cẩm chướng, đồng tiền, cúc…), lương thực thực phẩm (khoai tây, súp lơ, măng tây, cọ dầu, mía, cà phê…), ăn (chuối, dứa, dâu tây…), lâm nghiệp (bạch đàn, keo lai, dứa sợi…) phổ biến nhanh vào sản xuất *Các bước nhân giống in vitro Bước 1: Chọn lọc chuẩn bị mẹ Trược tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy) Các cần bệnh, đặc biệt bệnh virus giai đoạn sinh trưởng mạnh Việc trồng mẹ điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc phòng trừ sâu bệnh hiệu truớc lấy mẫu làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả sống sinh trưởng mẫu cấy in vitro Bước 2: Tạo vật liệu khởi đầu Là giai đoạn khử trùng mẫu vào nuôi cấy in vitro Giai đoạn cần đảm bảo yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn sinh trưởng tốt Kết giai đoạn phụ thuộc vào nhiều vào cách lấy mẫu, tuỳ thuộc vào mục đích khác nhau, loại khác để nuôi cấy phù hợp Khi lấy mẫu cần chọn mô, giai đoạn phát triển cây, quan trọng đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách sau đỉnh chồi hoa cuối đoạn thân, mảnh Ví dụ: Vật liệu ni cấy thích hợp để nhân nhanh in vitro Măng tây: chồi (Kohter, 1975) Khoai tây: mầm (Morel, 1952) Dứa: chồi nách, chồi đỉnh (Paunethier, 1976) Bắp cải: mảnh (Bimomilo, 1975) Súp lơ: hoa tự (Kholer, 1978) Cần thiết phải khử trùng mẫu trước đưa vào ni cấy hố chất khử trùng để loại bỏ vi sinh vật bám bề mặt mẫu cấy Chọn phương pháp khử trùng đưa lại tỷ lệ sống cao chọn môi trường dinh dưỡng thích hợp đạt Líp C©y trång 49C - Nhãm C«ng nghƯ sinh häc n«ng nghiƯp tốc độ sinh trưởng nhanh Thường dùng chất: HgCl 0.1% xử lý 5-10 phút, NaOCl Ca(OCl)2 5-7% xử lý 15-20 phút, H2O2, dung dịch Br… Một số dạng mơi trường dinh dưỡng phổ biến: Muối khống: theo White (1943), Heller (1953), Murashige Skoog (1962) Chất hữu cơ: đường sarcaroza Vitamin: B, B6, inositol, nicotin axit Hoocmon: auxin (IAA, IBA, NAA…), Xytokinin (BA, Kin, 2P…), Gibberelin (GA3) Bước 3: nhân nhanh Mục đích cảu giai đoạn kích thích phát triển hình thái tăng nhanh số lượng chồi đơn vị mẫu cấy thời gian định thông qua đường: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định tạo phơi vơ tính Vật liệu khởi đầu in vitro chuyển sang mơi trường nhân nhanh có bổ sung chất điều tiết sinh trưởngnhóm xytokinin để tái sinh tù chồi thành nhiều chồi Hệ số nhân phụ thuộc vào số lượng chồi tạo ống nghiệm Vấn đề phải xác định môi trường điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu cao Chế độ nuôi cấy thường 25-270C 16 chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng 2000-4000 lux, ánh sáng tím thành phần quan trọng để kích thích phân hố chồi (Weiss Jaffe, 1969) Tuy nhiên với đối tượng ni cấy đòi hỏi chế độ nuôi cấy khác nhau: nhân nhanh súp lơ cần chu kỳ chiếu sáng giờ/ngày, nhân phong lan Phalenopsis giai đoạn đầu cần che tối… Bước 4: Tạo in vitro hoàn chỉnh Kết thúc giai đoạn nhân nhanh có số lượng chồi lớn chưa hình thành hồn chỉnh chưa có rễ Vì vậy, cần chuyển từ mơi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ Tách chồi riêng cấy chuyển vào mơi trường ni cấy có bổ sung chất điều tiết sinh trưởng nhóm auxin Mỗi chồi rễ thành hoàn chỉnh Một số loại phát sinh rễ sau chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu xytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng Đối với phơi vơ tính cần cấy chúng mơi trường khơng có chất điều tiết sinh trưởng mơi trường có chứa xytokinin nồng độ thấp phơi phát triển thành hồn chỉnh Bước 5: Thích ứng in vitro điều kiện tự nhiên Để đưa từ ống nghiệm vườn ươm với tỷ lệ sống cao, sinh trưởng tốt cần đảm bảo số yêu cầu: - Cây ống nghiệm đạt tiêu chuẩn hình thái định (số lá, số rễ, chiều cao cây…) - Cần có thời gian huấn luyện (từ 1-2 tuần tuỳ loại cây) để thích nghi với thay đổi nhiệt độ, độ ẩm, sâu bệnh cách đặt bình ngồi điều kiênj tự nhiên, mở nắp bình ni… Lớp Cây trồng 49C - Nhóm Công nghệ sinh häc n«ng nghiƯp Chuyển gen mã hố vỏ protein virus: Virus có cấu tạo phần, gồm lõi acidnucleic (ADN ARN) vỏ protein Khi có mặt gen mã hoá protein vỏ sẵn tế bào gây hiệu ứng ngăn chặn lột vỏ virus xâm nhập tế bào chủ, kìm hãm nhân lên virus Dựa chế này, người ta chuyển gen mã hoá vỏ protein nhiều lại virus vào đối tượng trồng khác tạo nên giống kháng virus như: đu đủ kháng bệnh đốm vòng PRSV, chống chịu virus khảm alfalfa (AMV), virus khảm dưa chuột (CMV), khoai tây kháng virus X, xoăn khoai tây, chuối kháng virus gây bệnh bó đọt Chiến lược tạo giống kháng virus thứ hai sử dụng gen mã hoá replicase virus Replicase enzyme giúp virus tổng hợp acid nucleic tế bào vật chủ Cây chuyển gen chứa đầu định gen replicase tổng hợp phân tử ARN nhỏ chứa điểm nhận biết để liên kết với replicase Do phân tử cạnh tranh với ARN virus trình liên kết với enzyme replicase Nếu tế bào thực vật mã đủ loại ARN có khả ức chế q trình nhân virus Khả thứ ba sử dụng gen có trình tự ngược chiều (anti sense) với gen định virus Gen có trình tự ngược mã mARN có trình tự bổ sung với ARN virus ARN ngược chiều can thiệp trực tiếp vào biểu gen virus cách kết hợp với ARN virus tạo thành phân tử kép, ngăn cản trình dịch mã hay vận chuyển ARN từ nhân tế bào chất b) Ví dụ: Những trồng chuyển gen kháng virus trồng diện tích lớn giới gồm thuốc lá, cà chua, bí đỏ đu đủ (James Krattiger, 1996; James, 1997) Một số thành tựu khác chuyển gen kháng virus: Cây Gen ngoại Phương pháp chuyển gen Tính trạng biểu trồng Cà chua CP-TMV Thông qua Agrobacterium Kháng virus khảm thuốc Lúa CP-stripe Xung điện protoplast Kháng lại virus sọc Chuyển gen kháng nấm: Chuyển gen kháng vi khuẩn: III/ Chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ: Trong nông nghiệp nay, việc sử dụng thuốc trừ cỏ trở nên phổ biến, thay cho phương pháp làm cỏ truyền thống khác Tuy nhiên phải đặt câu hỏi: “thuốc trừ cỏ tiêu diệt cỏ dại có tiêu diệt trồng hay không?” Để việc sử dụng thuốc trừ cỏ không làm ảnh hưởng đến trồng, phải tạo loại trồng có tính kháng thuốc trừ cỏ Cơng nghệ chuyển 48 Líp C©y trång 49C - Nhãm C«ng nghƯ sinh häc n«ng nghiƯp gen làm điều Chúng ta đưa gen kháng thuốc trừ cỏ vào gen trồng Cơ chế chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ: Trước hết, phải hiểu chế tác động thuốc trừ cỏ Thuốc trừ cỏ kìm hãm sinh tổng hợp thực vật, kìm hãm sinh hơ hấp, kìm hãm chuyển hố acidnucleic, gây rối loạn phân chia tế bào, kìm hãm sinh tổng hợp lipid, kìm hãm sinh tổng hợp amino acid Cơ chế chung việc chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ chuyển vào trồng gen có khả sản xuất dư thừa loại protein (enzyme) mẫn cảm với thuốc trừ cỏ, bảo đảm đủ lượng cần thiết cho chức tế bào có mặt thuốc; làm giảm khă liên kết protein mẫn cảm với thuốc cách thay đổi cấu trúc protein; trang bị cho khả làm hoạt tính chuyển hố thuốc trừ cỏ Sản xuất dư thừa protein (enzyme) mẫn cảm với thuốc trừ cỏ áp dụng với nhiều trồng để tăng tính kháng thuốc trừ cỏ, Ví dụ Phosphinothricin (tên thương phẩm Basta) bialaphos Phosphinothricin ức chế enzyme tổng hợp glutamin (glutamin synthaza – GS) Ức chế GS gây tích luỹ amonia nhanh chóng làm cho chết Tăng tổng hợp GS lên nhiều lần khắc phục tác động thuốc trừ cỏ De Block (1987) đề xuất chiến lược liên quan tới enzyme có khả khử độc thuốc trừ cỏ Basta Gen Bar phân lập từ Steptomyces hygroscopicus tham gia vào q trình sinh tổng hợp bialaphos mã hố enzyme phosphinothricin axetyltranferase (PAT) Enzyme axetyl hố nhóm NH2 tự phosphinothricin làm cho không bị ngộ độc Đột biến gen protein mục tiêu làm khả liên kết thuốc trừ cỏ tăng khả kháng hay chịu thuốc trừ cỏ, chẳng hạn thuốc trừ cỏ glyphosate, atrazine sulphonylurea Ví dụ: Một số trồng chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ trồng quy mô lớn: đậu tương, ngô, bông, cải dầu, thuốc Một số thành tựu chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ: Cây Gen ngoại Phương pháp chuyển gen Tính trạng biểu trồng Lúa Bar Chuyển qua protoplast Kháng thuốc trừ cỏ Basta môi trường đệm (phosphinothrricin) PEG Lúa Bar Bắn gen vào tế bào nuôi Kháng thuốc trừ cỏ Basta cấy dạng huyền phù (phosphinothrricin) Lúa mỳ Bar Bắn gen vào callus Kháng thuốc trừ cỏ Basta hình thành phơi (phosphinothrricin) 49 Lớp Cây trồng 49C - Nhóm Công nghệ sinh häc n«ng nghiƯp Ví dụ chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ Glyphosate Glufosinate: Glyphosate Glufosinate loại thuốc diệt cỏ kiểm soát hầu hết loại xanh khác Hai loại thuốc diệt cỏ hữu hiệu việc kiểm sốt có dại ảnh hưởng trực tiếp lên vật nuôi không tồn lâu đất Chúng có hiệu cao an tồn số hố chất dùng nông nghiệp Tuy nhiên chúng ảnh hưởng xấu tới trồng Những loại thuốc diệt cỏ nhắm vào số enzyme chủ yếu trình trao đổi chất trồng, phá vỡ trình sản xuất thức ăn cho cuối tiêu diệt Cây trồng kháng thuốc diệt cỏ Glyphosate: Cơ chế hại thuốc kìm hãm hoạt động enzyme enol pyruvat sikimat phosphat synthetase (EPSPS), biến đổi sản phẩm quang hợp thành acid mạch vòng sikimic Khi acid khơng hình thành gây rối loạn tồn q trình trao đổi chất thực vật, dẫn đến chết Người ta tìm gen mã hoá EPSPS từ vi sinh vật từ số thực vật có hoạt tính cao, sau cải biến chúng chuyển nạp cho trồng Kết tạo có hàm lượng hoạt tính enzyme EPSPS cao gấp lần so với bình thường hồn tồn chống chịu với thuốc Glyphosate Ngồi ra, người ta đưa vào trồng gen vi sinh vật khác tạo enzyme làm suy biến Glyphosate Cây trồng kháng thuốc Glufosinate: Thuốc diệt cỏ Glufosinate chứa thành phần kích hoạt phosphinothrcin tiêu diệt thực vật cách phong toả enzyme chịu trách nhiệm q trình chuyển hố nitơ giải phóng chất độc amoniac, dẫn xuất trình chuyển hố thực vật Cây trồng biến đổi gen chịu Glufosinate có chứa gen vi khuẩn tạo loại enzyme giải phóng chất phosphinothrcin ngăn chặn chúng không bị phá huỷ 50 ... đề Trình bày kỹ thuật nhân giống in vitro o o -Nuôi cấy mô tế bào thực vật phạm trù khái niệm chung cho loại ni cấy ngun liệu thực vật hồn tồn vi sinh vật, mơi trường dinh dưỡng nhân. .. pháp nhân giống đại thực phòng thí nghiệm nên gọi phương pháp nhân giống ống nghiệm (in vitro) để phân biệt với trình ni cấy điều kiện tự nhiên ngồi ống nghiệm (in vivo) Khác vối phương pháp nhân. .. sinh Kỹ thuật nhân nhanh in vitro có ưu việt mà phương pháp khác khơng có là: nhân giống trồng quy mô công nghiệp (kể i Lớp Cây trồng 49C - Nhóm Công nghƯ sinh häc n«ng nghiƯp tượng khó nhân