M-t s- -ng d-ng c-a PCR trong vi sinh v-t

M-t s- -ng d-ng c-a PCR trong vi sinh v-t tài liệu, giáo án, bài giảng , luận văn, luận án, đồ án, bài tập lớn về tất cả...

Một số ứng dụng PCR vi sinh vật GVC TS KIM VĂN VẠN BỘ MÔN: MÔI TRƯỜNG VÀ BỆNH THỦY SẢN Hà Nội, 2013-2014 Xác định cǎn nguyên bệnh nhiễm trùng Cǎn vào đặc điểm (tính trạng) thường gặp vsv quan tâm, người ta tìm đến gen định tính trạng đó, thiết kế gen mồi (primer) phù hợp nhằm để khuyếch đại vùng ổn định gen nói Sản phẩm trình khuyếch đại sau này, vậy, www.themegallery.com xác định (cả độ dài trình tự nucleotide) từ giai đoạn Xác định cǎn nguyên bệnh nhiễm trùng Khi đưa gen mồi nói vào hỗn hợp ADN tách chiết từ vi sinh vật, ADN có chứa đoạn gen có trình tự nucleotide bổ sung với trình tự gen mồi chúng cặp đơi với và, sau đó, gen mồi kéo dài phía đầu 3' nhờ ADN polymerase www.themegallery.com Đoạn ADN đó, nhờ vậy, nhân lên cách đặc hiệu nhiều lần; sau trình nhân lên, người ta tìm đoạn ADN này, thơng thường nhất, điện di gel agarose nhuộm ethidium bromide Xác định cǎn nguyên bệnh nhiễm trùng Kết sau điện di: Nếu có bǎng ADN chạy giống bǎng chuẩn điều có nghĩa có vi sinh vật cần tìm bệnh phẩm Nếu khơng thấy bǎng xuất có bǎng khơng giống với bǎng chuẩn có nghĩa khơng có tác nhân www.themegallery.com gây bệnh cần tìm bệnh phẩm Xác định cǎn nguyên bệnh nhiễm trùng Một số ứng dụng điển hình:  Dùng PCR cho vi sinh vật chưa nuôi cấy nhân tạo ni cấy khó khǎn:  Các xoắn khuẩn: tất xoắn khuẩn khó ni cấy Tác nhân gây bệnh giang mai (Treponema pallidum), chưa nuôi cấy nhân tạo Người ta dùng nước ối từ www.themegallery.com mẹ làm bệnh phẩm cho PCR Nhờ vậy, giang mai bẩm sinh chẩn đoán sớm  Các tác nhân gây bệnh đường sinh dục: Tác nhân gây bệnh lậu viêm niệu đạo sau lậu để khó ni cấy Xác định cǎn nguyên bệnh nhiễm trùng  Vi khuẩn lao: PCR cho kết vòng - ngày với độ nhạy gấp khoảng 10.000 lần so với phương pháp cổ điển Vì vậy, chứng minh có mặt vi khuẩn lao dịch não tuỷ, nước tiểu loại bệnh phẩm chứa vi khuẩn mà trước www.themegallery.com chẩn đốn khó khǎn  Helicobacter pylori (HP): HP vấn đề thời Y học giới vai trị quan trọng bệnh lý viêm, loét ung thư dày Xác định cǎn nguyên bệnh nhiễm trùng Tuy vậy, nuôi cấy HP khó PCR dùng để tìm HP trực tiếp từ mảnh sinh thiết dày, tìm gen (VacA, CagA) liên quan tới độc tính Nhờ PCR, người ta cịn biết phân bố chủng HP khác vùng địa lý khác chủng HP đặc biệt liên quan mật thiết đến www.themegallery.com tình trạng bệnh lý định Xác định cǎn nguyên bệnh nhiễm trùng Các vi khuẩn khác Coxiella burnetti với mảnh 438-bp gen mã hoá cho protein 27kDa màng ngoài; Salmonella typhi với mảnh 343-bp mã hố cho protein lơng 599-bp mã hố cho kháng nguyên Vi; Pseudomonas pseudomallei (nay Burkholderia pseudomallei) với mảnh 517-bp 16S ARNr khuyếch đại thành cơng PCR www.themegallery.com Amíp: Dùng PCR để tìm đoạn gen mã hố cho protein 30.000 Mdal liên quan tới độc tính Entamoeba histolytica, người ta phân biệt amíp gây bệnh amíp không gây bệnh Xác định cǎn nguyên bệnh nhiễm trùng  Vi rút: Vi rút viêm gan B, HIV, vi rút thuỷ đậu, vi rút Herpes simplex, Papillomavirus, Cytomegavirus Enterovirus chẩn đoán thành công PCR Đối với HIV, tài liệu dẫn cho thấy, PCR cho kết www.themegallery.com dương tính sớm dấu hiệu biến đổi miễn dịch từ tháng; đặc biệt cho phép chẩn đoán HIV trẻ sơ sinh, mà kháng thể kháng HIV trẻ lúc này, có thể, đơn từ mẹ truyền sang Xác định cǎn nguyên bệnh nhiễm trùng  Xác định độc tố vi sinh vật: PCR khuyếch đại gen e.coli (là gen gây độc tố) thay bổ sung cho thử nghiệm kinh điển có độ nhậy độ đặc hiệu thay cho kỹ thuật phức tạp Độc tố ruột vi khuẩn tả (CT - cholera toxin) đóng vai trị chủ đạo chế gây bệnh chúng PCR dùng khuyếch đại www.themegallery.com đoạn gen mã hoá cho CT; nhờ đó, phân biệt cách chắn Vibrio cholerae gây bệnh tả thực với Vibrio cholerae khác - nhóm huyết khơng gây bệnh tả 10 Xác định cǎn nguyên bệnh nhiễm trùng  Xác định vi khuẩn ngồi mơi trường: Các vi khuẩn khó ni cấy và/hoặc thường có mặt ngồi mơi trường tìm trực tiếp PCR Ví dụ Legionella, Salmonella, Shigella Vibrio www.themegallery.com cholerae 11 Định loại (identification) vi khuẩn Sau phân lập vi khuẩn, PCR góp phần quan trọng định loại chúng Đối với vi khuẩn cụ thể, qui trình cho PCR với bệnh phẩm từ lâm sàng thường giống với bệnh phẩm vi khuẩn www.themegallery.com Tuy vậy, việc chuẩn bị ADN mẫu (template) từ vi khuẩn cho PCR đơn giản: cần đun sôi cách thuỷ huyền dịch vi khuẩn 10 phút thu lấy dịch sau ly tâm loại bỏ tế bào đủ 12 Phân loại (classification) vi khuẩn Nhờ khuyếch đại đoạn gen phụ trách ARNr 16S, người ta so sánh mối quan hệ gần gũi hay xa vi khuẩn, góp phần phân loại vi khuẩn chi tiết xác www.themegallery.com 13 14 www.themegallery.com ... trùng  Vi rút: Vi rút vi? ?m gan B, HIV, vi rút thuỷ đậu, vi rút Herpes simplex, Papillomavirus, Cytomegavirus Enterovirus chẩn đốn thành cơng PCR Đối với HIV, tài liệu dẫn cho thấy, PCR cho kết... PCR Ví dụ Legionella, Salmonella, Shigella Vibrio www.themegallery.com cholerae 11 Định loại (identification) vi khuẩn Sau phân lập vi khuẩn, PCR góp phần quan trọng định loại chúng Đối với vi. .. cho PCR Nhờ vậy, giang mai bẩm sinh chẩn đốn sớm  Các tác nhân gây bệnh đường sinh dục: Tác nhân gây bệnh lậu vi? ?m niệu đạo sau lậu để khó ni cấy Xác định cǎn nguyên bệnh nhiễm trùng  Vi khuẩn