Định nghĩa,nguyên tắc, phân loại,phân tích ưu nhược điểm, quy trình thực hiện, ứng dụng của kỹ thuật ELISA và PCR trong y học (có hình ảnh minh họa và tài liệu tham khảo).MỤC LỤCI. PCR11. Khái niệm:12. Quy trình13. Phản ứng RTPCR (PCR ngược)23.1 Nguyên lí23.2 Tiến hành phản ứng RT PCR34. Realtime PCR34.1 Khái niệm:34.2 Nguyên tắc:34.3 Ưu, nhược điểm:44.3.1 Ưu điểm:44.3.2 Nhược điểm:45. Lưu ý với RTPCR: giống với PCR và cần chú ý thêm76. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR77. Những ứng dụng của PCR87.1 Vân tay di truyền97.2 Chẩn đoán bệnh di truyền97.3 Tách dòng gen107.4 Gây đột biến điểm107.5 Phân tích mẫu DNA cổ117.6 Xác định kiểu gene của các đột biến117.7 So sánh mức độ biểu hiện của gen11II. ELISA121. Khái niệm:122. Nguyên lý:123. Các yếu tố ảnh hưởng:144. Ưu, nhược điểm:144.1 Một số ưu điểm của kỹ thuật này:144.2 Tuy nhiên kỹ thuật này vẫn còn tồn tại một số hạn chế:145. Phân loại ELISA155.1 Direct ELISA (ELISA trực tiếp)155.2 ELISA gián tiếp155.3 Sandwich ELISA175.3.1 Sandwich ELISA trực tiếp185.3.2 Sandwich ELISA gián tiếp195.4 Phản ứng ức chế cạnh tranh195.5 Direct CElisa: Kiểm tra kháng nguyên205.6 Direct CElisa: Kiểm tra kháng thể216. Ưu điểm phương pháp elisa227. Ứng dụng kỹ thuật ELISA trong y học:237.1 ứng dụng phương pháp ELISA xét nghiệm HIV:237.1.1 Cấu trúc HIV:237.2 Nguyên lí của kỹ thuật ELISA phát hiện kháng thể kháng HIV:237.3 Sinh phẩm HIV UNIFORM II Plus O phát hiện nhiễm HIV:257.4 Phát hiện kháng thể trên bệnh giun lươn bằng phản ứng ELISA26III. Dịch bài báo “Isolation of RNA from Equine Peripheral Blood Cell: Comparison of Methods”.26 DANH MỤC CÁC BẢNG HÌNHHình 1: Thiết bị nhân ADN (máy PCR)1Hình 2: Chu trình PCR2Hình 3: Các thiết bị dùng trong kỹ thuật realtime PCR4Hình 4: Kết quả sau khi dùng kỹ thuật PCR5Hình 5: Sơ đồ Realtime PCR TaqMan6Hình 6: Kết quả thử nghiệm quan hệ cha con9Hình 7: Nhân bản một gen bằng plasmid10Hình 8: Kỹ thuật ELISA13Hình 9: Sự khác biệt giữa ức chế và cạnh tranh20Hình 10: Quy trình xét nghiệm HIV25Hình 11: Trung bình và sai số chuẩn của giá trị trung bình33Sơ đồ 1: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA trực tiếp15Sơ đồ 2: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA gián tiếp16Sơ đồ 3: Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp18Sơ đồ 4: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA Sandwich gián tiếp19Sơ đồ 5: Direct CELISA kiểm tra kháng nguyên21Sơ đồ 6: Direct CELISA kiểm tra kháng thể22Bảng 1: Kết quả cho mẫu lâm sàng……….……………………………………………31
TIỂU LUẬN DI TRUYỀN Y HỌC MỤC LỤC I PCR 1 Khái niệm: .1 Quy trình Phản ứng RT-PCR (PCR ngược) .2 3.1 Nguyên lí 3.2 Tiến hành phản ứng RT- PCR Real-time PCR 4.1 Khái niệm: 4.2 Nguyên tắc: 4.3 Ưu, nhược điểm: 4.3.1 Ưu điểm: .4 4.3.2 Nhược điểm: .4 Lưu ý với RT-PCR: giống với PCR cần ý thêm Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR .7 Những ứng dụng PCR .8 7.1 Vân tay di truyền .9 7.2 Chẩn đoán bệnh di truyền 7.3 Tách dòng gen 10 7.4 Gây đột biến điểm 10 7.5 Phân tích mẫu DNA cổ 11 7.6 Xác định kiểu gene đột biến .11 7.7 So sánh mức độ biểu gen 11 II ELISA 12 Khái niệm: .12 Nguyên lý: .12 Các yếu tố ảnh hưởng: 14 Ưu, nhược điểm: 14 4.1 Một số ưu điểm kỹ thuật này: 14 4.2 Tuy nhiên kỹ thuật tồn số hạn chế: 14 Phân loại ELISA 15 5.1 Direct ELISA (ELISA trực tiếp) 15 5.2 ELISA gián tiếp .15 5.3 Sandwich ELISA .17 5.3.1 Sandwich ELISA trực tiếp 18 5.3.2 Sandwich ELISA gián tiếp .19 5.4 Phản ứng ức chế /cạnh tranh 19 5.5 Direct C-Elisa: Kiểm tra kháng nguyên 20 5.6 Direct C-Elisa: Kiểm tra kháng thể 21 Ưu điểm phương pháp elisa 22 Ứng dụng kỹ thuật ELISA y học: 23 7.1 ứng dụng phương pháp ELISA xét nghiệm HIV: 23 7.1.1 Cấu trúc HIV: 23 7.2 Nguyên lí kỹ thuật ELISA phát kháng thể kháng HIV: 23 7.3 Sinh phẩm HIV UNIFORM II Plus O phát nhiễm HIV: 25 7.4 Phát kháng thể bệnh giun lươn phản ứng ELISA 26 III Dịch báo “Isolation of RNA from Equine Peripheral Blood Cell: Comparison of Methods” 26 DANH MỤC CÁC BẢNG HÌNH Hình 1: Thiết bị nhân ADN (máy PCR) Hình 2: Chu trình PCR Hình 3: Các thiết bị dùng kỹ thuật realtime PCR .4 Hình 4: Kết sau dùng kỹ thuật PCR Hình 5: Sơ đồ Realtime PCR TaqMan Hình 6: Kết thử nghiệm quan hệ cha Hình 7: Nhân gen plasmid 10 Hình 8: Kỹ thuật ELISA 13 Hình 9: Sự khác biệt ức chế cạnh tranh 20 Hình 10: Quy trình xét nghiệm HIV 25 Hình 11: Trung bình sai số chuẩn giá trị trung bình .33 Sơ đồ 1: Tiến trình thực phản ứng ELISA trực tiếp 15 Sơ đồ 2: Tiến trình thực phản ứng ELISA gián tiếp 16 Sơ đồ 3: Tiến trình thực ELISA Sandwich trực tiếp 18 Sơ đồ 4: Tiến trình thực phản ứng ELISA Sandwich gián tiếp 19 Sơ đồ 5: Direct C-ELISA kiểm tra kháng nguyên .21 Sơ đồ 6: Direct C-ELISA kiểm tra kháng thể 22 Bảng 1: Kết cho mẫu lâm sàng……….……………………………………………31 I PCR Khái niệm: PCR(Polymerase Chain Reaction) môt kỹ thuật cho phép khuếch đại đoạn gen đặc hiệu để thu nhiều phục vụ nghiên cứu Bên cạnh đó, PCR cho phép dễ dàng đưa thay đổi, đột biến vào ADN để nghiên cứu Hình 1: Thiết bị nhân ADN (máy PCR) Quy trình Quy trình PCR gồm 20 đến 30 chu kỳ Mỗi chu kỳ gồm bước (Hình 2) (1)Nhiệt độ tăng lên 94-96 °C để tách hai sợi DNA Bước gọi biến tính, phá vỡ cầu nối hydrogen nối sợi DNA Trước chu kỳ 1, DNA thường biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA mồi phân tách hồn tồn dạng sợi đơn Thời gian: 1-2 phút (2)Sau sợi DNA tách ra, nhiệt độ hạ thấp xuống để mồi gắn vào sợi DNA đơn Bước gọi gắn mồi Nhiệt độ giai đoạn phụ thuộc vào đoạn mồi thường thấp nhiệt độ biến tính 50 °C (4560 °C) Sử dụng sai nhiệt độ giai đoạn dẫn đến việc đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn cách tùy tiện Thời gian: 1-2 phút (3) Cuối cùng, DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống Nó bắt đầu bám vào hoạt động dọc theo sợi DNA Bước gọi kéo dài Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc DNA-polymerase Thời gian bước phụ thuộc vào DNA-polymerase chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại Như quy tắc …, 1000bp/ phút Hình 2: Chu trình PCR Phản ứng RT-PCR (PCR ngược) 3.1 Nguyên lí Thực chất RT-PCR phản ứng nhân trình tự từ khn ARN, gồm giai đoạn: (1) Tổng hợp trình tự ADN sợi từ sợi ARN làm khn; (2) Trình tự ADN sợi lại làm khuôn để thực phản ứng PCR Phản ứng biến đổi ARN thành ADN phải nhờ enzyme phiên mã ngược (Reverse-trancriptase) gọi giai đoạn chuyển ngược (RT) thực nhiệt độ 50oC – 55oC 30 phút Sau có sản phẩm ADN sợi phản ứng PCR thơng thường gồm giai đoạn RT-PCR sử dụng để nhân ARN retrovirut mARN tách từ tế bào chất 3.2 Tiến hành phản ứng RT- PCR - Giai đoạn (RT): chu kì, thực chép ngược từ ARN sợi đơn sang ADN sợi kép nhiệt độ 50oC- 55oC, 30 phút - Giai đoạn (PCR): (1) Biến tính nhiệt độ 94o-95oC /1phút; (2).Tiếp hợp mồi 40-65oC; (3) Tổng hợp ADN 72oC/1 phút Real-time PCR 4.1 Khái niệm: Trong sinh học phân tử, real-time PCR, hay gọi PCR định lượng trực tiếp, hay gọi PCR động học, dạng biến đổi PCR chuẩn thức để khuếch đại kèm gam chuẩn đồng thời định lượng trình tự đích đặc hiệu chúng tích tụ lại thời điểm định sau chu kỳ phản ứng Hệ thống “real-time” tuân thủ thường quy chung PCR cho đường cong khuếch đại tương tự đường cong phát triển vi khuẩn gồm giai đoạn: kéo dài đến dấu hiệu sản phẩm PCR lớn dấu hiệu hệ thống; tăng gia tốc kéo dài tạo hình phẳng Do vậy, tranh hoàn thiện trình PCR thể rõ khơng phải sản phẩm cuối phản ứng sau số chu kỳ định Với real-time PCR, kết phân tích lúc phản ứng chạy nên khơng bị nhiễm sản phẩm từ ngồi vào, kết thu nhanh lại kiểm sốt tốt hơn, tự động hồn tồn 4.2 Ngun tắc: Thực chất hệ thống Real time PCR gồm máy luân nhiệt (PCR) nối với máy quang phổ huỳnh quang máy vi tính Real-Time PCR cho biết kết lượng DNA hình thành thời điểm suốt tiến trình phản ứng Hình 3: Các thiết bị dùng kỹ thuật realtime PCR Real time PCR gồm hai trình diễn đồng thời: nhân DNA phản ứng PCR đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn DNA tạo thành 4.3 Ưu, nhược điểm: 4.3.1 Ưu điểm: Real-time PCR: Nhanh, cho phép theo dõi tiến trình phản ứng biết lượng DNA tạo thành thời điểm Không cần điện di nên tiến hành nhiều mẫu (gần 200 mẫu/ngày) Hạn chế tạp nhiễm Độ nhạy cao (3pg DNA) Lượng mẫu biến động (10-1010 copies) Độ lặp lại cao (CV < 2,0%) 4.3.2 Nhược điểm: Vấn đề Real-time PCR, không phân biệt tác nhân gây bệnh sống hay chết, đòi hỏi kỹ năng, thiết bị Ứng dụng Kỹ thuật Real time PCR chẩn đoán sớm HIV trẻ em Eric Nerrienet HIV/Hepatitis Laboratory IP Cambodia, Phnom Penh Nếu khơng có tầm soát sớm nhiễm HIV trẻ, BS Nhi Khoa phải chờ đợi đến tháng thứ 15 để biết tình trạng huyết học thực trẻ sinh từ bà mẹ HIV(+) Nếu trẻ không phát sớm điều trị thuốc kháng virus, trẻ có nguy tử vong 50% 02 năm sống Kỹ thuật kinh điển chẩn đóan nhiễm HIV trẻ - RT PCR/b-DNA: Giá thành đắt - Nested-DNA PCR (gen: Gag, Pol và/hoặc Env): Đắt, kỹ thuật phức tạp - Nuôi cấy phân lập virus: Đắt, kỹ thuật phức tạp, nhiều thời gian, cần labo an tòan mức độ - Kỹ thuật real time PCR Để chẩn đoán sớm, giá thành thấp trẻ sinh từ mẹ nhiễm HIV Hình 4: Kết sau dùng kỹ thuật PCR Thông thường, real-time PCR kết hợp với RT-PCR để định lượng lượng nhỏ ARN thông tin Ký hiệu real-time PCR rt PCR Định lượng trực tiếp có vai trò chẩn đốn mà có vai trò tiên lượng bệnh, định điều trị, tái điều trị, trì điều trị thuốc kháng virus đặc hiệu RT – PCR sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang Phương pháp phổ biến sử dụng thuốc nhuộm ADN, thường SYBR Green, thuốc nhuộm gắn không đặc hiệu vào tất chuỗi ADN kép phát huỳnh quang, sau chu kỳ phản ứng, lượng ADN sản phẩm tăng làm tăng cường độ tín hiệu huỳnh quang tương ứng Nhược điểm chất huỳnh quang gắn vào sản phẩm tự mồi gây nên tượng nhiễu, làm giảm độ xác phân tích định lượng kết trình tự đích cần khuếch đại Phản ứng thực máy chu kỳ nhiệt bình thường, trừ việc thêm thuốc nhuộm chuỗi ADN kép, thuốc nhuộm phát quang gắn với chuỗi ADN kép, đầu dò đo mức huỳnh quang sau chu kỳ Nếu kèm gam chuẩn ngồi phản ứng định lượng RT – PCR sử dụng đầu dò đánh dấu huỳnh quang (RT – PCR TaqMan) Sử dụng đầu dò mang chất huỳnh quang phương pháp xác đáng tin cậy nhất, đắt Nguyên lý phương pháp đầu dò chuyển lượng cộng hưởng huỳnh quang tới sản phẩm khuếch đại cần phát (hiện tượng FRET) Đầu dò ADN hay ARN gắn đặc hiệu vào khu vực hai đoạn mồi để định lượng ADN chứa trình tự đầu dò, làm tăng đáng kể độ đặc hiệu, chí cho phép định lượng có mặt số sản phẩm khuếch đại khơng đặc hiệu Khả cho phép làm thử nghiệm đa mồi sử dụng đầu dò đặc hiệu đánh dấu mầu khác Hình 5: Sơ đồ Realtime PCR TaqMan Thơng thường, đầu dò mang huỳnh quang đầu (Reporter – 5’) chất chặn đầu (Quencher – 3’), vị trí gần chất mang chất chặn làm thuốc nhuộm huỳnh quang truyền lượng tới chất chặn gần khơng phát quang Khi taq polymerase hoạt động, enzyme có hoạt tính 5’ – 3’ exonuclease nên đầu dò bị đánh bật khỏi khn mẫu, lúc này, trạng thái gần Sơ đồ 6: Direct C-ELISA kiểm tra kháng thể Ưu điểm phương pháp elisa Cho phép thực đồng thời nhiều mẫu Có thể dùng máy tự động giảm bớt thao tác cho người làm xét nghiệm, tránh sai sót lây nhiễm Đọc kết máy không phụ thuộc vào chủ quan người làm xét nghiệm Có thể lưu bảng kết thông số kỹ thuật thuận lợi cho việc kiểm tra đánh giá chất lượng xét nghiệm Giá thành xét nghiệm tương đối rẻ Nhược điểm Cần có đầu tư cho trang thiết bị ban đầu bảo dưỡng máy móc Các sinh phẩm phải bảo quản nhiệt độ lạnh (4-80oC) 22 Thời gian thực xét nghiệm 2-3 Khơng thích hợp cho nơi số lượng mẫu phải làm nhiều chứng Ứng dụng kỹ thuật ELISA y học: 7.1 ứng dụng phương pháp ELISA xét nghiệm HIV: 7.1.1 Cấu trúc HIV: HIV có đặc điểm chung họ retroviridae Hạt virus hồn chỉnh (virion) có cấu trúc gồm lớp Lớp vỏ (vỏ peplon): lớp màng lipid kép có kháng nguyên chéo với màng nguyên sinh chất tế bào Gắn lên màng nhú, phân tử Glycoprotein có trọng lượng phân tử 160 kilodalton (gp160) Nó gồm có phần: + Glycoprotein màng ngồi :có trọng lượng phân tử 120 kilodalton (gp120) GP120 kháng nguyên biến đổi nhất, gây khó khăn cho phản ứng bảo vệ thể chế vaccin phòng bệnh +Glycoprotein xuyên màng: có trọng lượng phân tử 41 kilodalton 2.Vỏ (vỏ capsid): vỏ gồm lớp protein: + Lớp ngồi hình cầu, cấu tạo protein có trọng lượng phân tử 18 kilodalton (p18) + Lớp hình trụ, cấu tạo phân tử có trọng lượng phân tử 24 kilodalton (p24) Đây kháng nguyên quang trọng để chẩn đoán nhiễm HIV/AIDS 3.Lõi Là thành phần bên vỏ capsid, bao gồm: + Hai phân tử ARN đơn, gen di truyền HIV(genom).Genom HIV chứa gen cấu trúc: Gag (group specific antigen) gen mã hoá cho kháng nguyên đặc hiệu capsid cuả virus; Pol (polymerase) mã hoá cho Enzym: reverve transcriptase (RT:Enzym mã ngược), protease endonuclease (còn gọi kháng nguyên integrase); EnV (envelop) mã hoá cho glycoprotein lớp vỏ peplon HIV 7.2 Nguyên lí kỹ thuật ELISA phát kháng thể kháng HIV: Elisa gián tiếp Kháng thể kháng HIV có máu bệnh nhân kết hợp đặc hiệu với kháng 23 nguyên virút HIV cố định sẵn giá đỡ (các giếng phản ứng phiến nhựa) Phức hợp kháng nguyên -kháng thể nhận biết đặc hiệu cộng hợp kháng thể kháng immunoglobuline người (Ig) có gắn enzyme cho phản ứng màu với chất thích hợp Giá trị mật độ quang phản ứng màu (OD: optical density) tỷ lệ thuận với lượng kháng thể kháng HIV diện mẫu thử Elisa cạnh tranh Nguyên tắc kỹ thuật dựa cạnh tranh kháng thể kháng HIV có mẫu thử với cộng hợp kháng thể kháng HIV gắn với enzyme để gắn lên kháng nguyên cố định giếng Giá trị mật độ quang (OD) tỷ lệ nghịch với lượng kháng thể mẫu thử Sanwich elisa Kháng thể kháng HIV mẫu thử kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên cố định giếng phát cộng hợp kháng nguyên virút gắn enzyme Giá trị mật độ quang phản ứng màu (OD) tỷ lệ thuận với lượng kháng thể kháng HIV diện mẫu thử Các hệ sinh phẩm Sinh phẩm hệ thứ sử dụng kháng nguyên vi rút toàn phần ly giải tinh chế từ tế bào gây nhiễm với HIV Các sinh phẩm có độ nhạy độ đặc hiệu hạn chế Sinh phẩm hệ thứ hai dùng kháng nguyên protein tái tổ hợp protein tổng hợp Sinh phẩm có độ nhạy độ đặc hiệu cao Sinh phẩm hệ ba xử dụng kháng nguyên tái tổ hợp proteine tổng hợp kháng thể phát theo nguyên tắc ELISA sandwich Độ nhạy độ đặc hiệu cải thiện rõ rệt Sinh phẩm hệ thứ tư phát đồng thời kháng nguyên kháng thể có mẫu thử Sinh phẩm cho phép phát nhiễm HIV trước có chuyển đổi huyết sinh phẩm khuyến cáo nên lựa chọn cho kiểm tra an toàn truyền máu Các sinh phẩm ELISA ngày hoàn thiện để phát sớm xác kháng thể kháng HIV, rút ngắn thời gian cửa sổ huyết Các sinh phẩm dùng kháng nguyên có epitop tạo kháng thể sớm có loại kháng nguyên cho phép phát kháng thể kháng virus HIV & 2, thứ type vius virus HIV nhóm O 24 7.3 Sinh phẩm HIV UNIFORM II Plus O phát nhiễm HIV: a- Nguyên tắc: Là phản ứng ELISA “Sandwich” bước •Kháng nguyên gắn giếng protein vỏ gp160 HIV-1 ANT70 (nhóm O); gp36 HIV2 •Nếu mẫu thử có kháng thể kháng HIV, kháng thể gắn đặc hiệu với kháng nguyên cố định giếng Đồng thời khối cầu cộng hợp kháng nguyên HIV gắn men có sẵn giếng tạo phức hợp kẹp chả: Kháng nguyên - Kháng thể - Cộng hợp •Phức hợp Kháng nguyên - Kháng thể - Cộng hợp phát phản ứng màu với chất b- Quy trình thực hiện: Lấy máu Huyết người pha loãng 400 lần Cho vào đĩa mà kháng nguyên HIV cố định Rửa giải thành phần khác huyết Nếu huyết có kháng thể HIV giữ lại Một kháng thể thứ cấp đặc hiệu với kháng thể HIV cho đĩa Rửa giải kháng thể thứ cấp có gắn enzyme giữ lại bề mặt có kháng thể HIV Cho chất đặc hiệu với enzyme kháng thể thứ cấp Đo OD So sánh kết với mẫu huyết người bình thường 25 Hình 10: Quy trình xét nghiệm HIV 7.4 Phát kháng thể bệnh giun lươn phản ứng ELISA Xét nghiệm ELISA phát kháng thể IgG chống bệnh giun lươn Strongyloides stercoralis huyết phản ứng ELISA sử dụng chất chiết từ ấu trùng giun lươn thể S stercoralis Các kháng thể tìm thấy với tỷ lệ cao độ nhạy hầu hết bệnh nhân Tuy nhiên, giá trị ELISA khơng có liên quan đến cường độ nhiễm khác biệt mặt lâm sàng thông số cận lâm sàng Khi giá trị ELISA người nhiễm giun lươn so sánh với không bị giun lươn S stercoralis thông qua xét nghiệm phân, có khác biệt có ý nghĩa ghi nhận nhóm Phản ứng chéo với nhiễm giun khác yếu rõ rệt so với giun lươn Strongyloides Người ta kết luận kháng thể có giá trị mạnh bệnh giun lươn người thử nghiệm cung cấp phương pháp chẩn đoán bệnh giun lươn có độ nhạy đặc hiệu cao Công cụ xét nghiệm ELISA cho bệnh giun lươn hữu ích chẩn đốn ca bệnh lâm sàng nghiên cứu dịch tễ học III Dịch báo “Isolation of RNA from Equine Peripheral Blood Cell: Comparison of Methods” Tạp chí lâm sàng , tháng 10 2005, p5055-5057 0059-1137/05/$08.00+0 doi:10.1128/JCM.43.10.5055/5057.2005 Bảng quyền 2005, xã hội người Mỹ cho vi sinh Tất quyền Real-Time Xếp Transcription PCR để phân tích phát định lượng 26 Ngựa virus cúm Nhận ngày tháng tư năm 2005 /trả lại cho điều chỉnh ngày 27 tháng năm 2005 /chấp nhận ngày 17 tháng bảy năm 2005 Cúm ngựa nguyên nhân gây bệnh đường hô hấp lây sang người ngựa Việc phát virus cúm ngựa sử dụng nguồn Ánh sáng CYCLER để chép ngược tức kỹ thuật khuếch đại gen (RT)-PCR đánh giá qua hai mùa cúm với việc phân tích 171 mẫu bệnh virut đường hơ hấp.Tính nhạy cảm tăng phát virus tổng thể với hệ thống so với Directigen Cúm A phân lập virus, mà 40% 23%, tương ứng, mà RTPCR Thí nghiệm đánh giá thay khả thi cho phương pháp truyền thống để định lượng virus cúm ngựa, 50% liều nhiễm trứng 50% liều nhiễm nuôi cấy mơ Có tương quan tích cực đáng kể (P