TAP CHỈ KHO A HOC DH Q G H N , KHTN & CN, T.xx, sỏ' 4, 2004 TINH SẠCH CHẤT ứ c CHE TRYPSIN (TI) TỪ HẠT ĐẬU TƯƠNG (G L Y C I N E M A X L.) P h a n T u â n N g h ĩa , Đ ặ n g Q u a n g H n g K hoa S in h học, Trường Đ ại học K hoa học T ự n h iên , Đ H Q G H N Đ ặ t v ấ n đề H ạt đậu tương 0Glycine m ax L.) có chứa h ức chế try p sin điển h ìn h với khôi lượng p hân tử kDa 20 kD a gọi tương ứng c h ấ t ức c h ế B ow m an-Birk ch ất ức chê K unitz theo cách gọi tác giả lần p h t tin h ng [2, 4,] Cho đến tính c h ấ t hai c h ất ức c h ế nghiên cứu r ấ t kỹ [1, 6] Cả hai chất số h ã n g hoá c h ấ t tin h sả n x u ấ t làm protein c h u ẩn cho việc xác định khôi lượng p h â n tử b ằn g sắc ký lọc gel b ằ n g điện di Tuy nhiên, Việt N am chưa có cơng trìn h báo cáo việc tin h c h ấ t ức chê N ghiên cứu n hằm mục đích th iế t lập qui trìn h tương đơi đơn giản, dề áp d ụ n g đê tin h ch ất ức chê K unitz (KI), với khôi lượng 20 kDa vốn k h bền với nhiệt, có h m lượng tương đôi cao nguồn nguyên liệu bột đậu tương dễ kiếm, giá rẻ để có th ế sử d ụn g n h protein chuấn cho việc đ n h giá khối lượng protein th a y cho việc n h ậ p ngoại giá cao N g u y ê n liệ u v p h n g p h p n g h i ê n c ứ u 2.1 N g u yên liệ u H t đậu tương (G lycine m a x L.) m ua từ h n g h t giống Hà Nội định tên khoa học bới chuyên gia p h â n loại thực vật Trypsin h ă n g Sigma (Mỹ), protein c h u ẩ n h ã n g P h a rm a c ia (Thụy điển) Trypsin-Sepharose ch ú ng tự tông hợp cách gắn try p sin tin h k hiết hãng Sigma vào S epharose 4B h o ạt hoá bằn g B rC N H ã n g P h a rm a c ia Các hố chất lại đ t độ tin h k h iế t d n h cho p h â n tích 2.2 P h n g p h p n g h iê n u H oạt độ ức c h ế try p sin (TIA) xác định theo phương ph áp kh uếch tá n trê n đĩa thạch phương p h p mô tả trorig [7] Một đơn vị ch ất ức c h ế tryp sin lượng c h ấ t ức chê có k m giảm 50% h o t độ mg try p sin tin h k h iế t điều kiện p hân tích P rotein xác định bằn g hai phương pháp: đo độ h ấ p th ụ n h sán g vùng bước sóng 280 nm (A2g0) p h â n đoạn th u qua cột sắc ký cột phương pháp Lowry [5] sử d ụ n g a lbu m in h u y ế t th a n h bò (BSA) làm ch ất chuẩn 19 Phan Tuấn NíihTa, Đặng Quang Hưng 20 Điện di trê n gel pháp Laem m li [3] polyacrylamid có SDS ( SDS-PAGE) thực theo phương Trong toàn nghiên cứu dùn g nồng độ gel tách 12,5% nồng độ gel cô 4% K ế t q u ả v t h ả o l u ậ n 3.1 C h u ấ n bị d ịc h c h iế t h t đ ậ u tư n g H t đậu tương nghiền mịn 20 g bột nghiền mịn loại mõ b ằ n g ete etylic (theo tỷ lệ g bột ml ete) P h a trê n chứa mõ ete gạn bỏ, p h ầ n bột loại mõ cho làm bav ete nh iệ t độ phòng Bột đậu tương loại mõ chiết b ằn g đệm Tris-HCl, 20 mM, pH 7,5 có chứa 50 mM KC1 (đệm A) theo tỷ lệ 1:5 (khơi lượng:thể tích) giò Dịch đồng th ê ly tâ m ỏ 14.000 v/ph 20 p h ú t 4°c Dịch trê n tủ a th u lại Kết tủ a c hiết lại với đệm A theo tỷ lệ 1:3 (w:v) th u dịch trê n tủ a b ằ n g ly tâm 3.2 S ắ c kỷ tra o đ ôi ion q u a côt DE-52 cellu lo se Dịch chiết h t đậu tương h a i lần trộn lại cho lên cột DE-52 cellulose (có kích thước l,6x cm) cân với đệm A Tốc độ lên cột 20 ml/giờ Sau cho to àn dịch chiết chảy qua cột, cột rửa b n g đệm A cho đên A ,80 dịch rửa chiết nhỏ 0,005 (khoảng 120 ml) sau p h ả n hấp th ụ gradient NaCl từ 0,05-1,0M pha đệm A Tốc độ rử a chiết 25 ml/giờ vói phân đoạn th u 2ml Kết cho th ấ y protein TIA p h t p h ầ n dịch không h ấ p th ụ (phân đoạn I) Tuy nhiên, qua th ứ nghiệm th ấ y c h ấ t ức c h ế K unitz (Kl) khồng thuộc p h ân đoạn I nên không tiếp tục tin h KI từ p h â n đoạn s ắ c ký đồ phần protein hấp th ụ trê n cột (hình 1) cho th ấ y có hai đỉnh protein chính, tro n g đỉnh thứ n h ấ t đẩy nồng độ NaCl từ 0,3 đến 0,5M có TIA (và ký hiệu phân đoạn II) Còn đỉnh protein th ứ hai đẩy ỏ nồng độ NaCl cao khơng có TIA Nhờ loại bỏ p h ầ n protein không gắn với cột p h ầ n protein có lực cao chê phẩm KI th u có độ tă n g lên 10,2 lần so với b a n đầu (bảng 1) Kết q u ả SDSPAGE ph ân đoạn II chứa r ấ t nhiều b ăn g protein, tro ng có b ăn g với khôi lượng p hân tử 20 kDa (hình 3) 3.3 S ắ c ký q u a cột lọc g e l S e p h a d e x G-100 Các ph ân đoạn II có TIA bước sắc ký qua cột DE-52 cellulose dồn lại, loại mi th ẩ m tích, đặc đến ml cho sắc ký qua cột qua cột lọc gel S e p h a d ex G-100 (có kích thưỏc 1x70 cm) cân đệm A Cột rử a chiết b ằ n g đệm A với tốic độ dòng chảy 20 ml/giờ, thu ơng 2,5 ml Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, KHTN ả CN T.xx, So 4, 2004 rinh cliàl ức chê Irypsin 21 Sac ký đồ p h â n đoạn II sau qua cột lọc gel có đỉnh pro tein lớn vù n g đinh kéo dài đến ông th ứ 40, tu y có đỉnh TIA, ứng với ơng từ 10-22 có TIA N hư bước sác ký lọc gel cho phép loại bỏ nhiều protein k hơng mong muốn, nhờ độ ch ế phẩm KI tă n g lên 12,6 lầ n so với b an đ ầu (bảng 1) Tuy vậy, k ế t chạy SDS-PAGE cho th ấ y ch ế phẩm số b ă n g protein k hác n h a u , chứng tỏ cần phái tiếp tục tin h 3.4 S ắ c ký i lự c q u a cột T ry p sin -S e p h a ro se 4B Đinh TIA từ bước sắc ký lọc gel th u lại, th ẩ m tích đối đệm A cho sắc ký qua cột try psin -sep harose 413 cân b àn g với đệm A có chứa mM CaCl._> Protein không hấp thụ gắn không đặc hiệu đẩy dung dịch NaCl IM p tro n g đệm A Phần protein gán đặc hiệu trê n cột đẩy b ằng d u n g dịch HC1 0,001 M có chứa mM CaClj Kết ph ản tích cho p h ầ n dịch đẩy NaCl có protein n hư n g khơng có TIA Dịch p hán h ấp th ụ có chứa protein TIA Độ c h ế p h ẩ m qua bước tă n g lên 37,2 lần Kết p h â n tích SDS-PAGE (hình 3) cho th , ch ế p h ẩ m KI th u (cột 8) có duv n h ấ t băn g protein với kích thước bằn g 20 kDa, n ằ m đ ún g vị trí băng c h ấ t ức chế Kunitz từ đậu tương trê n đường chạy protein ch uẩn K ết chứng tỏ chế pha 111 Tí thu tin h Qui trìn h tin h TI từ đ ậ u tương tóm t ắ t báng ỉ bao gồm bước: loại mỡ b ằ n g etylic chiết b ằ n g đệm Tris-HCl, sắc ký qua cột tra o đối ion DE-52 cellulose, sắc ký lọc gel qua cột Sephadex G-100 sắc ký lực qua cột TrypsinSepharose 4B T h ả o l u ậ n C h ất ức chê K u n itz (KI) với h o t tính ức c h ế try p sin lần K unitz tách từ h t đậu tương m ột qui trìn h nhiều bước khác n h a u [2] Sau F e d u rk in a Mosolov 111dã p h t triể n phương p háp tin h KI từ h t đậu tương r ấ t đơn giản sắc ký lìấp th ụ miễn dịch, tro n g tác giả sử dụng KI thương mại gây k h n g the k h n g KI ỏ thổ gắn k h n g th ể th u lên Sepharose 4B để tạo cột lực Tuy nhiên, bước phức tạp cua phương p h p phải gây k h n g th ê k h n g KI Qui trìn h với bước sác ký phôi hợp ỏ tr ê n dễ d àn g áp dụ n g với phòng th í nghiệm hố sinh thơng thường Qui trìn h cho phép th u kh o ả n g mg Kĩ từ 20 gam nguyên liệu ban đẩu Chê phẩm có độ tin h k h iế t cao, hoàn toàn p h ù hợp với mục đích sử dụng n h protein c h u ẩ n cho việc đ n h giá khôi lượng p h â n tử b ằ n g sắc ký h a y điện di Hơn t h ế nữa, với hoạt độ riêng 1,17 ĨU /m g protein (bảng 1) dựa trê n tỷ ]ệ ức c h ế lm ol KI: lm ol trypsin c ho thây KI th u v ẫn giữ nguyên hoạt độ ức chế enzym đích Ỉ ỤỊÌ chi Khoa học DIIỌ C Ì/IN K H IN & CN T.xx Sô'4 2004 20 40 60 Sò phán đoạn 80 100 Hình 1: sác ký qua cột DE-52 cellulose dịch chiết hạt đậu tương có chửa chất ức chê trypsin Cột có kích thước l,6x8cm cân với đệm A Tốc độ rứ a chiết 25 ml/giò, thu phân đoạn 2,0 ml Protein TIA ô X Hỡnh 2: sc ký qua cột Sephadex GlOO phân đoạn TI hạt đậu tương Cột có kích thước X 70cm cân với đệm A Tốc độ rửa chiết 20 ml/giò, thu ph ân đoạn 2,5 ml Tạp chí Khoa liọc fíflQ (}ỈIN K H Ỉ N ấ' CN 'Ị XX So 2004 Tinh chái ức chế trypsin 23 B ảng 1: Tóm tát qui trình tinh chất ức chê trypsin 20 kDa từ hạt đậu tương Kết tin h STT Bước tin h sach Protein (mg) 1.125 Loại mở b ằn g ete etylic chiết bằn g đệm A Sắc ký qua cột DE-52 Đ ỉnh th ứ n h ấ t Sắc ký qua cột Sephadex G100 đ ỉn h TIA côt DE-52 s c ký qua cột TrypsinS e p h a ro se 4B TIA H oạt độ riêng (đơn (đơn vị) vị/ mg protein) 33,28 0,0314 Hệ sô tinh (lần) 1,00 38,4 12,23 0,318 10,2 23,1 6,4 9,13 7,50 0,395 1,170 12,6 37,2 kDa 97 66 i 45 30 ém ằầ < 20 14 H ình 3: Điện di gel polyacrylamid 12,5% có SDS chế phẩm chất TI từ đậu tương 1: Dịch chiết hạt đậu tương, 2: Đinh TIA thu từ cột DE-52, 4: đỉnh TIA thu từ cột Sephadex G-100, 8: Chế phẩm TI thu từ cột sắc ký lực Trypsin-Sepharose 4B, 7: Các protein chuẩn bao gồm: Phosphorylase B, albumin huyết bò, ovalbumin, cacbonic anhydrase, chất ức chê trypsin (KI) đậu tương lactalbumin TÀI LIỆU THAM KHẢO Fedurkina N V and Mosolov.V.V., Purification of soy bean trypsin immunoabsorption, Applied Biochem and M ic r o b io l20(1984), 452-457 inhibitor by Kunitz M, Crystalline soy bean trypsin inhibitor II General properties, J 30(1947), 291-310 Gen Physiol I tip chi Khoa hục DHQCiHN K H IN & CN, T.XX, So 4, 2004 24 Phan Tuấn NiihTa, Đạiìii Qiumu Hưim Laemmli U.K Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Nature, 227(1970), 680-685 Laskowski M Jr and Kato I Proteinase inhibitors of proteinases, A nna Rev Biochem , 49(1980), 593-676 Õ Lowry O.H., Rousenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J., Protein the Folin phenol reagent, J Biol C h e m 193(1951), 265-275 Park D.S., Gramham M.Y., Graham T.L., Identification of soybean elicitation competency factor, CF-1, as the soybean Kunitz trypsin inhibitor Physiol Mol Plant P a t h o l 59(2001), 265-273 Phan T.N and Pham T.C., Trypsin inhibitors in developing seeds oỈ M omordica charantia L., Proc N atl Center Sci Res V i e t n a m 2(1990), 129-137 VNU JO URNAL OF SCIENCE Nat., S c L & Tech., T.xx, m easurem ent with N04, 2004 P U R IF IC A T IO N O F T R Y P S I N IN H IB IT O R (TI) F R O M S O Y B E A N S (G L Y C IN E MAX L.) P h an Tuan N ghia and D ang Q uang H ung D epartm en t o f Biology, College o f Science, V N Ư A protocol for purification of the soybean trypsin inhibitor (SBTI) or K un itz inhibitor (KI) h a s been reported The ground powder was extracted with ethylic e th e r to remove fat, then resu spen ded a n d m agnetically stirre d in 20mM Tris-HCl buffer, pH 7.5 co n tain in g 50 mM KC], followed by cen trifu gatio n to collect the clear s u p e r n a n ta n t fluid T h e e x tra c t th en u n d erw en t steps of purification: i) anion exchange column c h ro m a to g p h y on DE-52 cellulose, ii) gel filiation on Sephadex GlOO and iii) affinity c h ro m a to g p h y on TrypsinSepharose 4B The obtained TI p re p a ratio n contained only a single protein of a m olecular w eight of 20 kDa as shown at the sam e position of th e s ta n d a rd KI pre sen t in the molecular weight m a rk e rs on SDS-PAC tE The protocol allows to obtain 6.4 mg KI from 20 g of soybean ground powder and the purification factor of the KI a fte r the step s increased 37 fold Tạp chi Khou học ĐHQGHN Kin N & CN I XX So 2004 ... 12,5% có SDS chế phẩm chất TI từ đậu tương 1: Dịch chiết hạt đậu tương, 2: Đinh TIA thu từ cột DE-52, 4: đỉnh TIA thu từ cột Sephadex G-100, 8: Chế phẩm TI thu từ cột sắc ký lực Trypsin- Sepharose... ấ' CN 'Ị XX So 2004 Tinh chái ức chế trypsin 23 B ảng 1: Tóm tát qui trình tinh chất ức chê trypsin 20 kDa từ hạt đậu tương Kết tin h STT Bước tin h sach Protein (mg) 1.125 Loại mở b ằn g ete... n ằ m đ ún g vị trí băng c h ấ t ức chế Kunitz từ đậu tương trê n đường chạy protein ch uẩn K ết chứng tỏ chế pha 111 Tí thu tin h Qui trìn h tin h TI từ đ ậ u tương tóm t ắ t báng ỉ bao gồm bước: