PHÁT HIỆN và PHÁT TRIỂN ENZYME

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM KHOA CNSH & KĨ THUẬT MÔI TRƯỜNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ ENZYME BÁO CÁO ĐỀ TÀI: PHÁT HIỆN VÀ PHÁT TRIỂN ENZYME MỤC LỤC I SÀNG LỌC ENZYME Tổng quan 2 Cô lập sàng lọc tự nhiên .2 Sàng lọc phân tử .5 Sàng lọc gen môi trường 5 Sàng lọc gen 6 Sàng lọc proteomic II KỸ THUẬT PROTEIN .9 Giới thiệu Ứng dụng Kỹ thuật Protein 13 Cách nhìn .15 I SÀNG Tổng quan LỌC ENZYME Trong tự nhiên enzyme vô phong phú, chúng có nhiều nguồn gốc khác từ động vật, thực vật, vi sinh vật enzyme có đặc tính khác có tác dụng khác cho mục đích khác Chúng ứng dụng nghành cơng nghiệp, y dược, thực phẩm … Vì vậy, lựa chọn loại enzyme cho phù hợp với mục đích phản ứng enzyme tồn nhiều nên việc lựa chọn sàng lọc tìm loại enzyme cần dùng bước quan trọng Thông thường, việc chọn lựa sàng lọc enzyme chiến lược dựa kiến thức mặt vật lý, điều kiện hóa học phải đảm bảo cho enzyme phải hoạt động Vì lựa chọ hiệu suất enzyme điều kiện ứng dụng quan trọng trình sàng lọc Trong việc tìm kiếm gen , khảo sát môi trường khắc nghiệt núi lửa, suối nước nóng, hồ hypersaline , bắc cực mang lại nhiều vi sinh vật lạ với tính chất đặc thù cách kết hợp sàng lọc enzyme với kỹ thuật đại kỹ thuật protein, lai phân tử với hiệu suất cải thiện điều kiện ứng dụng cụ thể, hiểu thêm phương pháp kiểm tra khác sử dụng ngành công nghiệp để tạo enzyme với đặc tính mong muốn Cơ lập sàng lọc tự nhiên Nguồn nguyên liệu cho thu nhận enzyme thực vật động vật, vi sinh vật sinh vật nhân sơ (vi khuẩn vi khuẩn cổ ) sinh vật nhân chuẩn (nấm nấm men) ngồi có số vật chất (đất, đá, nước, khơng khí…) Trong vi sinh vật nguồn thu nhận enzyme Phát kháng sinh (ví dụ , penicillin , streptomycin ) liên quan đến việc kiểm tra hàng ngàn mẫu đất , nguyên liệu thực vật , vv cách ly ngẫu nhiên kiểm tra nơi vi khuẩn sinh sống, giới hạn quy mơ thử nghiệm quy trình liên quan đến việc phải chịu áp lực chọn lọc, sử dụng nguyên tắc nuôi cấy để tăng sinh khối giống vi sinh vật chọn Ví dụ: tăng sinh khối vi khuẩn cách cung cấp xylan nguồn carbon lượng, vi khuẩn sản xuất xylanase cảm ứng phát triển, môi trường để ni cấy vi khuẩn la mơi trường có tính acid , pH thường dao động khoảng 4-6 Ngoài việc lựa chọn môi trường yếu tố thiêt yếu để phân lập chúng dễ dàng Ví dụ: phân lập chúng từ đất chua , đầm lầy than bùn Một phương pháp tiếp cận sinh thái nhờ vào áp lực chọn lọc tự nhiên môi trường Ví dụ, mơi trường kiềm số hồ nước có pH nơi sinh sống vủa vi sinh vật alkaliphilic Có khả sinh vật có enzym ngoại bào ổn định thực tối ưu pH cao Ví dụ môi trường sống tự nhiên cho vi sinh vật sản xuất phytase Phytate phosphate lưu trữ, thường thành phần số hạt giống, sàng lọc vi sinh vật gắn mật thiết với nguồn gốc hạt giống nảy mầm ( rễ ) thích hợp phù hợp để kiểm tra Thời gian kiểm tra mẫu quan trọng , có thay đổi q trình ni cấy Trong việc bảo quản mẫu tốt , điều kiện hóa chất vật lý thay đổi dẫn đến chết số sinh vật nuôi cấy giảm khả tồn vi sinh vật khác Có nhiều lợi xử lý mẫu trường hợp , điều dẫn đến lập số lồi vi khuẩn khác Ví dụ làm giàu chỗ mẫu vi sinh vật lấy từ môi trường hồ trầm tích đặt vào mơi trường có sợi bơng vải Sau mẫu đưa trở lại phòng thí nghiệm sàng lọc cellulolytic, kỹ thuật làm giàu khác chẳng hạn việc sử dụng nước chitin -agar để phân lập làm chậm phát triển xạ khuẩn , ý tưởng vô hạn Trong thực tế, việc xử lý mơi trường bao gồm đất có nhiều chất hữu có chứa số lượng lớn vi khuẩn Thuốc kháng sinh đưa vào mơi trường phát triển Ví dụ, Grampositive vi khuẩn nhạy cảm penicilin vi khuẩn Gram âm Thông qua chiến lược sàng lọc, tất phương pháp tiếp cận dựa số hình thức tiêu chí lựa chọn cho kết hợp sinh vật - hoạt động tìm kiếm phương pháp ứng dụng rộng rãi có liên quan đến việc phát triển vi khuẩn đĩa thạch có chứa chất enzyme thích hợp cho việc theo dõi hoạt động enzyme mong muốn Ví dụ, kết hợp casein nguồn carbon vào môi trường thạch với bề mặt mờ đục viền sáng xung quanh protease Tương tự , hoạt động lipase giám sát thay đổi màu sắc giảm pH việc tạo axit béo từ chất lipid Phản ứng phân chia cụ thể phát cách tạo sản phẩm huỳnh quang chất hấp thụ mạnh ( sinh màu ) Sản phẩm từ chất thích hợp Việc lựa chọn vi sinh vật giai đoạn quan trọng trình sàng lọc Mặc dù sàng lọc q trình khơng dễ dàng để phân lập vi sinh vật khác môi trường thạch Điều đưa đến hạn chế lớn phương pháp ngẫu nhiên để cách ly kiểm tra chủng tự nhiên Như chi nấm Aspergillus Trichoderma, trực khuẩn Pseudomonas loài động vật vi khuẩn, có nguồn gốc phong phú sử dụng làm enzym thương mại trước việc tìm hiều đặc tính sinh vật khó khăn, ngày với kỹ thuật phân tích đại tìm hiểu phân lập cách dễ dàng Một số kỹ thuật đại thường sử dụng như: khuếch đại phân tử, kỹ thuật PCR, kỹ thuật protein, … Ngày nay, việc giải trình tự gen thực dễ dàng, kết hợp với sở liệu lớn phát triển để so sánh, có nghĩa cụ thể sinh vật thường nhanh chóng giao cho nhóm phân loại để biết mối quan hệ lồi đặc tính lồi Các phân nhóm sinh vật thành nhóm liên quan chủng kết hợp với sàng lọc liệu để dễ dàng lựa chọn Ngày nay, công việc thực thiết bị máy móc đại với hệ thống máy tính Một vấn đề thường gặp q trình sàng lọc tự nhiên vi sinh vật phân lập thường tạo enzyme quan trọng thương mại nồng độ thấp cần phải tối ưu hóa mơi trường, đảm bảo điều kiện nuôi cấy ổn định cho chúng phát triển tốt trước thao tác di truyền chọn chủng đột biến có tiềm làm tăng sản lượng Các kỹ thuật cổ điển đột biến lựa chọn cho vi sinh vật cải thiện thuộc tính áp dụng cho nhiều thập kỷ qua Phương pháp đại sinh học phân tử đẩy nhanh khả tạo vi sinh vật phòng thí nghiệm với hoạt động cải thiện Sàng lọc phân tử Nếu dẫn enzyme phù hợp , ví dụ: xylanase axit , xác định lồi cụ thể sau tìm kiếm thực cho enzyme tương đồng lồi Q trình đòi hỏi ứng dụng di truyền đảo ngược Enzyme polyme có liên kết hóa trị chuỗi acid amin xác định Thứ tự amino axit xếp theo enzyme phân tích q trình gọi N4 nhánh cuối trình tự Từ mã di truyền phổ qt dự đốn trình tự nucleotide base gen mã hóa enzym cụ thể nhờ thăm dò xây dựng bao gồm 15 đến 20 nucleotide (bộ mồi ) trình tự xác Trong đó, DNA có chất chuỗi xoắn kép , liên kết với sợi bổ sung Bằng việc sử dụng mồi phản ứng chuỗi polymerase (PCR) nhiễm sắc thể DNA từ sinh vật có liên quan , gen tương đồng khuếch đại chuyển vào sinh vật chủ E coli, biểu cho gen sản phẩm, nghĩa là: enzyme tương đồng Trong thực tế quy trình nhiều hơn, phức tạp hơn, theo dõi enzyme có chức giống (xylanase), với trình tự khác đáng kể axit amin, yếu tố quan trọng enzyme vị trí hoạt động bảo tồn thơng qua q trình tiến hóa Trong thử nghiệm ứng dụng enzym'' mới'' có đặc tính khác đáng kể, chẳng hạn cải thiện nhiệt độ hay ổn định pH so với phân tử trước Bằng cách dòng họ sinh vật có liên quan kiểm tra Ngồi ra, DNA vi sinh vật thăm dò với DNA mang theo phóng xạ nhãn huỳnh quang kỹ thuật gọi lai Tuy nhiên, tất phương pháp phân tử dựa kiểm tra tương tự có nhược điểm lớn họ dựa so sánh với liệu ghi nhận Sàng lọc Gene môi trường Mặc dù sàng lọc phân tử kỹ thuật mạnh mẽ giới hạn khả phát triển giải nén suitable DNA từ sinh vật mục tiêu sàng lọc Gene môi trường giới hạn vi sinh vật, phân lập để mơi ni cấy Có nhiều lý không nuôi cấy số tế bào giai đoạn nghỉ ngơi, hư hỏng, hay bị nhiễm sinh vật khác Nuôi cấy phòng thí nghiệm tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật nuôi cấy phát triển tốt nhờ vào đa dạng sinh học ta chia làm nhóm chính: archaea, bacteria eukarya Số lượng lồi mơ tả cách hợp lệ sinh vật nhân sơ khoảng 4500 tăng với tốc độ 100-200 năm Năm 1987, Woese mô tả lĩnh vực vi khuẩn bao gồm khoảng 12 nhóm liên quan đến tự nhiên ( đơn vị ) dựa ssRNA phân tích trình tự sinh vật canh tác quen thuộc cho thấy tiến hóa sinh vật đa dạng di truyền so với thực vật, động vật, nấm Ba tiên phong, báo cáo nghiên cứu chuyên đề, tất xuất năm 1990, đa dạng sinh học vi khuẩn dựa nghiên cứu phân tử lớn đáng kể biết đến từ việc nuôi cấy túy Hai nghiên cứu khác báo cáo hồi canh tác độc lập phần 16S rDNA trình tự từ sinh vật phù du biển suối nước nóng, trình tự 16S rRNA lấy khơng phù hợp với vi khuẩn nuôi cấy biết đến từ cung cấp sở cho nhiều loại vi khuẩn chưa biết rõ Sự khác biệt đơn vị phát sinh lồi vi khuẩn phản ánh khác biệt đáng kể sinh lý Phát triển công nghệ gần may mắn phép tiếp cận vào phần vi sinh vật tự nhiên Có thể chiết xuất DNA chí RNA trực tiếp từ sinh khối mẫu lấy từ môi trường Mặc dù có nhiều kỹ thuật để chiết xuất DNA nhiễm sắc thể từ cộng đồng vi sinh vật tự nhiên , tất tế bào dễ bị ly giải, DNA hồi phục hồn tồn Mơi trường DNA kiểm tra gen biết đến cách sử dụng kỹ thuật phân tử mô tả q trình đòi hỏi DNA chất lượng tốt, kể từ sàng lọc PCR đặc biệt nhạy cảm với xáo trộn tạp chất mơi trường Ngồi ra, mơi trường DNA cắt thành mảnh nhỏ cách sử dụng enzyme hạn chế , mảnh vỡ nhân vơ tính thành vật chủ biểu E coli Các dòng sau kiểm tra gen mã hóa enzyme cách tương tự nhiều kỹ thuật mô tả cho sàng lọc sinh học tự nhiên phân lập, từ cho phép phát hoạt động mã hóa gen mong muốn Sàng lọc gen Sự tiến ngoạn mục thực trực tiếp trình tự nucleotide Sợi DNA Đã có hàng triệu chuỗi gen sở liệu chung.Tồn bộ gen 800 sinh vật tìm thấy sở liệu chung công đồng Entrez Genomes [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Genome ] Tại có sinh vật có gen giải trình tự hoàn toàn bao gồm sinh vật có trình tự giải mã Cả ba lĩnh vực đời sống như: vi khuẩn, vi khuẩn cổ , eukaryota, đại diện khác, nhiều virus bào quan Hiện (2006) có khoảng 302 gen prokaryote ( 279 vi khuẩn vi khuẩn cổ 23 ) số gen vi sinh vật nhân chuẩn giải trình tự tồn bộ, trình tự gen 20 vi sinh vật giải trình tự Ngẫu nhiên shotgun trình tự cho phép làm sáng tỏ nhanh chóng gen vi sinh vật, tiến kỹ thuật dự kiến tiếp tục đẩy mạnh giải trình tự gen Ban đầu, trình tự gen vi sinh vật nguồn tác nhân gây bệnh, nhiều vi khuẩn có tiềm cơng nghiệp thấy có trình tự gen có ích Ví dụ, gen sinh vật ưa nhiệt, ưa kiềm ,ưa acid ,và ưa muối giải trình tự Điều cho thấy điều việc phân tích gen tiết lộ chế lối sống tương ứng vi khuẩn , hỗ trợ việc xác định enzym extremophilic công nghiệp có liên quan, cho phép đưa quy tắc chung tạo protein mà kết thu enzyme mong muốn thực điều kiện ni cấy khắc nghiệt Ví dụ phân tích chung hình thức protein ưa nhiệt, xu hướng giảm kích thước protein ; tăng liên kết hydro, hàm lượng beta-sợi , ổn định qua cặp xoắn ion , ưu tiên cho dư lượng tính dư lượng cực tích điện Khi trình tự gen vi sinh vật có sẵn , gen mã hóa protein xác định tính tốn hai phương pháp khác Ngay từ đầu tìm kiếm sử dụng mẫu tích hợp hiểu biết chung thành phần gen tín hiệu để tìm gen Một phương pháp tính tốn đáng tin cậy sử dụng tương tự với gen mã hóa protein sinh vật khác để xác định gen Tuy nhiên phương pháp thứ hai phụ thuộc vào sẵn có gen tương đồng , bổ sung gen có chức có lợi Bởi gen prokaryote thường xuyên chồng chéo lên nhau, nên việc dự đốn xác gen khó khăn, kết số lượng gen mã hóa protein thực gen vi sinh vật gây tranh cãi Một biến chứng thêm cho biết thêm khác biệt dự đoán gen protein biểu có mặt cách thay ghép nối, xảy vi sinh vật nhân chuẩn Một số phương pháp thực nghiệm , chẳng hạn giải trình tự EST phân tích microarray qt - ốp lát , cho phép tính tốn xác định gen xác Số lượng lớn liệu chuỗi phạm vi chung khiến xuất tin sinh học, định nghĩa giao diện sinh học khoa học tính tốn Tin sinh học sử dụng cơng cụ tính tốn để tổ chức phân tích liệu sinh học mục đích để trích xuất thơng tin sinh học kiến thức sinh học.Ví dụ điển hình bao gồm việc xác định gen tương đồng protein cụ thể chuyển giao chức biết đến từ liên kết với gen hay protein có chức tương tự để từ dự đốn chức gen Ví dụ, tìm kiếm tương tự mức độ gen, cho phép sàng lọc silic cho enzyme Tuy nhiên cần lưu ý, liệu cho trình tự chắn khơng phải hồn hảo, phân tích cho phép sai số mức độ Tần số lỗi giảm tích hợp thơng tin bổ sung lấy từ gen liệu thử nghiệm Dựa vào số phương pháp tính tốn khác mà ta sử dụng trình tự gen có sẵn để suy chức gen, ví dụ nhóm chức gen có liên quan đến gen, phát sinh lồi, liên kết chuyển hóa tiếp cận tổ hợp Mặc dù công cụ giải trình tự gen mạnh mẽ khoảng 25% gen biểu tổng số dự án giải mã gen Thêm 25 % gen có chức khơng rõ dường liên quan đến loài riêng biệt chúng Ngược lại, gần 40 % hoạt động enzyme xác định EC số cụ thể, enzyme chưa xác định với trình tự gen cơng bố Những liệu nguồn lực để sàng lọc enzyme phần lớn chưa khai thác Một tia sáng phát mới, số lượng công nghệ thực nghiệm phát triển nhằm mục đích xác định chức cho gen chưa biết đến Trong số gen khác, nghiên cứu biểu cấu trúc thực để xác định có gen mã hóa Nhiều phương pháp phát triển để sử dụng hết chức , định vị tế bào, tương tác protein để dự đoán chức protein gọi chức gen Về , hầu hết phương pháp suy luận gián tiếp cho chức kết hợp thời gian không gian với đặc trưng protein Ví dụ, loạt kỹ thuật có sẵn để phá vỡ gen , ngẫu nhiên có định hướng , quy mơ lớn sinh vật Tiếp theo phân tích kiểu hình, giống với sàng lọc lập tự nhiên, cho phép xác định chức sinh học giả định protein bất hoạt Một số phương pháp gián đoạn gen cho phép phân tích xác định vị trí protein, hỗ trợ cho biết chức protein Khi sàng lọc, đặc biệt enzym ngoại bào, việc tiết enzyme dự đốn dựa sở thơng tin trình tự gen ghi phân tích Ngồi ra, việc sử dụng dấu hiệu dựa dảy nấm men cho phép lựa chọn protein tiết từ eukaryote prokaryote khơng có thơng tin trình tự trước Phân tích quy mô lớn tương tác protein gen – hybrid hay phương pháp tiếp cận phổ sinh hóa /phổ khối lượng sử dụng để gán chức Ngồi ra, phương pháp tính tốn chứng minh thành cơng việc dự đốn tương tác protein chức Tuy nhiên nay, hệ gen-rộng phân tích lên hầu hết sử dụng công cụ để nghiên cứu cấu trúc gen Căn theo giả định prôtê in với chức tương tự cho thấy quy định trình tự tương tự, liệu lưu giữ dùng để phân loại theo chức gen Các hạt nhỏ chuỗi pơlime ngắn hay tồn gen đại diện cho hệ gen hồn tồn lai giống với cDNA đánh dấu khác đạt từ tế bào riêng biệt tế bào So sánh lưu giữ cho biết quy tắc chuyển đổi thông tin di truyền tế bào nhờ việc thay đổi điều kiện bên tế bào Còn khơng thì, cách biểu theo cách khác prơtêin sinh trực tiếp từ vị trí prơtêin, thơng lượng thấp thay đánh giá gián tiếp qua phân tích Nó quy định gen ( prơtêin ) sau dùng để nhận biết gen có liên quan đến q trình đặc biệt tế bào Chẳng hạn như, phân tích toàn Thermotoga maritima dùng để nhận gen liên quan đến phân hủy sinh học đơn giản phức tạp hợp chất cao phân tử thực vật, với tiềm nguồn lượng tái tạo, chẳng hạn xylan xenlulơ Thiết kế hạt DNA xếp theo trình tự đầy đủ cho toàn hệ gen cho vi khuẩn khái niệm đơn giản Sự xếp nhiều mảng DNA lúc tăng thêm lượng cho việc phân tích Chẳng hạn như, mức biểu gen người 6000 49 kiểu tế bào khác gần tìm thử nghiệm lai giống Nhiều ứng dụng khác hình thành cho việc sử dụng hạt DNA xếp Sàng lọc proteomic Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc gen thực nói rõ ràng tất quý giá, họ suy gián tiếp chức prôtêin.Thực nghiệm trực tiếp cho chức đòi hỏi số lượng gen nhận biết biểu cao, sau phân tích làm prơtêin Biện pháp giới thiệu thử thách để biểu prôtêin, bao gồm yêu cầu cần có lượng protein cao có tinh cao Nhiều công nghệ tạo điều kiện thuận lợi mở quy mô lớn không giới hạn cho việc bổ sung xếp theo trình tự hệ gen, phần bổ trợ prôtêin hệ gen tạo ra, điều chỉnh để phân tích chức nhiều prôtêin tái tổ hợp, chẳng hạn mã hoá cDNA thư viện xung quanh Mặc dù gen ứng dụng để thay đổi vị trí phân cắt tạo điều kiện thuận lợi nhân thành véctơ thích hợp, q trình khơng thể hiệu thực tập hợp gen lớn Để tránh nhược điểm này, vài phương pháp tái tổ hợp trung gian phát triển cho phép nhân linh hoạt nhiều véctơ khác Số lượng cao prôtê in tinh đòi hỏi hợp với lực cụ thể tạo điều kiện thuận lợi cho việc làm tinh sạch, suy giảm miễn dịch- định vị, / suy giảm miễn dịchkết tủa Chẳng hạn như, hệ gen lớn hợp với nhóm khác cho phép tinh song song mơ tả đặc tính hàng ngàn prôtêin khác Sự tổng hợp prôtêin thường cải thiện việc tiết tính tan nhỏ hay thấp protein Mặc dù bổ sung thêm nhóm ảnh hưởng đến chức prơtêin, họ mạnh mẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc tinh phát protein, cho phép biểu lên bề mặt tế bào giữ nguyên vị trí hạt chất hỗ trợ khác Một số ví dụ thú vị sàng lọc protein báo cáo vào cuối thập kỷ 90 đầu năm 2000 Hơn 6000 gen men hợp glutathione S - transferaza ( GST ) biểu làm tinh Nhóm protein tinh khiết khảo nghiệm cho hoạt động khác enzym, sau hoạt động bước đầu từ quy tắc áp dụng cho gen chưa biết đến Liên quan gần tất kinaza prôtêin từ men làm bánh xếp microwells lúc phân tích cách sử dụng 17 chất khác Tác giả bày tỏ gen với nhóm 6xHIS , để ràng buộc prôtêin hợp Prôtêin tinh in slides trình chiếu cho khả tương tác với prơtêin photphoslipit Thăm dò mảnh protê in tương tác mang lai nhiều chức Ở hai nghiên cứu độc lập tổng hợp protêin dùng tinh mô tả multi prơtein quy mơ chưa có Ở nghiên cứu liên quan cho thấy mối quan hệ phức tạp điều tiết làm tinh lực – gắn thẻ để giữ hoạt động Nhiều ý tưởng xây dựng mảnh prôtêin theo đuổi việc sàng lọc nên tập trung vào phương pháp mà có nhiều khả giữ hoạt động enzim Trong giải pháp thay thú vị, thay protêin, biểu thư viện cách diễn đạt in overlayed với tế bào khả biến, dẫn đến cục cách diễn đạt transformants Cụm tế bào kiểm tra cho nhân - depen - vết lõm đặc tính Sự sàng lọcbề mặt tế bào thư viện protein sử dụng để chọn dây cải thiện tiểu thuyết hay dùng để kiểm tra cho hoạt động enzim Chẳng hạn như, đột biến với cải thiện xúc tác hoạt tính xác định sàng lọc bề mặt cellulase subtiligase Kết hợp sàng lọc chất huỳnh quang thư viện biến thể protease sử dụng để kiểm tra cho đặc trưng chất lí thuyết II KỸ THUẬT Giới thiệu PROTEIN Kỹ thuật protein sử dụng kết hợp công cụ cho phép axit amin chuỗi axit amin loại protein thay số 19 khác tự nhiên xảy axit amin protein để thay đổi thuộc tính chúng Mã di truyền mở rộng cách đưa acid amin từ ngồi vào tạo prơtêin Thay đổi vừa chuyển đến vị trí ngẫu nhiên phát tán dọc theo toàn chuỗi Thành lập kỹ thuật protein công nghệ kích hoạt đời công nghệ DNA tái tổ hợp , kèm với cải tiến liên tục 3D xác định cấu trúc tinh thể tia X quang phổ NMR Cho đến năm 1980, khả thay đổi loại enzyme giới hạn hóa học sửa đổi , giới hạn bên chuỗi amino axit phản ứng Công nghệ DNA tái tổ hợp thay đổi việc điều chỉnh prơtêin nhiều cách Nó khơng để thay acid amin mà 19 acid amin khác, thay đổi vĩnh viễn Vật liệu biến đổi prơtêin có chất lượng có sẵn việc điều chỉnh lên men lặp lại sinh vật sản xuất, sau việc tinh Ngoài ra, enzym tạo hệ thống tái tổ hợp tạo số lượng lớn độ tinh khiết cao Điều tạo điều kiện cho việc xác định cấu trúc 3D protein làm tăng kiến thức sở để biết thêm thí nghiệm protein - kỹ thuật Cả hai cơng nghệ cho xác định cấu trúc prô - tê - in, tinh thể học tia X NMR quang phổ học, hưởng lợi từ sẵn có số lượng lớn tinh khiết prơtêin, khơng có phát triển đồng thời phương pháp vật lý lớn số lượng liệu cấu trúc khơng có ngày hôm (xem Chap 1) Chất lượng OFX –ray liệu cải thiện cách phát triển phần cứng tia X-quang truyền thống nguồn đặc biệt , sẵn có chùm tia X mạch lạc tạo xạ synchroton , cho phép độ phân giải liệu tinh thể đưa xuống xuống chí hn 1A Â ê (Hỡnh 28) cp ny nguyên tử hydro hydro trái cấu trúc 3D protein quan sát trực tiếp Ở độ phân giải siêu cao 0,54 Một ¢ ª chí nghiên cứu electron hóa trị mật độ protein NMR quang phổ đạt từ phát triển nam châm tốt cho phép tách tốt tín hiệu xác định tốt thay đổi hóa học nguyên tử Quang phổ học NMR đạt từ phát triển nam châm tốt cho phép tách tín hiệu tốt phạt xác định dịch chuyển hoá học nguyên tử Quang phổ học NMR ảnh hưởng tổng quát diễn biến công nghệ sinh học cho phép hiệu sản xuất cần thiết 13 C / 15 N nhãn prôtêin Cả hai phương pháp xác định cấu trúc, nhiên, hầu hết ảnh hưởng vào năm 1980 tính sẵn có đột ngột liên tục gia tăng quyền lực tính tốn hay khơng Từ tinh thể học tia X prôtêin quang phổ học NMR phương pháp gián tiếp, họ nặng phụ thuộc quyền lực tính tốn hay khơng để xử lý liệu, họ đòi hỏi kiểm tra mắt kết máy tính đồ họa cao cấp Hệ thống máy tính đồ họa mở đường cho thành lập tảng kiến thức cho kỹ thuật prôtêin, thành lập cấu trúc quan hệ chức Cho đến lúc nghiên cứu kiện quanh xúc tác enzim giải thích liệu động lực điều kiện khác, với sẵn có liệu cấu trúc máy tính họa rẻ cho hình dung, trở thành để hợp lý hoá quan sát chi tiết nguyên tử cách kết hợp thí nghiệm cấu trúc liệu Một ví dụ tốt cho giải thích cấu trúc cho giảm hoạt động xúc tác subtilisin bị ơxi hố OTT et al b xác định cấu trúc ơxi hố dạng subtilisin 10 Hình 29 So sánh cấu trúc subtilisin bẩm sinh với cấu trúc enzym với peroxid ơxi hố gặp 222 ( EC 3.4.21.62 ) từ amyloliquefaciens Trực khuẩn so sánh với dạng bẩm sinh nonoxidized ( hình 29 ) Ở dạng ôxi hoá, nguyên tử ôxi methyonin ôxi hoá 222 dự án vào lỗ oxyanion Do đó, nguyên tử cacbonila chất không ràng buộc cách đồng Điều khơng ảnh hưởng đến lượng bẻ gẫy liên kết tương đối mK chất nền, tỉ lệ xúc tác tương tự, từ lỗ oxyanion cho thấy để cho quan trọng xúc tác Thay Asn 155, chẳng hạn, cho thấy để giảm hoạt động xúc tác đo lường kcat 100 - gấp 1000 lần Ngoài kiến thức cấu trúc, hệ đột biến khía cạnh kỹ thuật thí nghiệm prơtêin Phần lớn thí nghiệm đột biến thực trình đột biến, kỹ thuật mà acid tự nhiên 19 acid amin thay vị trí định Từ biến thể ( thể đột biến ) nghiên cứu có thay đổi chất đặc trưng tìm thấy hiển thị gia tăng đặc trưng nhiều gấp 1000 lần giới thiệu biến đổi Hơn nữa, giá trị pK dư lượng xúc tác sửa đổi cấu hình tốc độ pH phù hợp với mơ hình cho hiệu mong muốn Kỹ thuật cho phép hệ vị trí bị biến đổi q trình đột biến ngẫu nhiên định rõ vùng phân tử Sử dụng kỹ thuật này, nhiều vị trí tồn quan trọng định Ba acid amin thay đổi đủ để trao đổi đặc trưng subtilisins có liên quan, nhiều trypsin thay đổi vị trí 189 chuỗi bên quan trọng để trao đổi trypsin đặc trưng cho chymotrypsin Những nỗ lực dấu hiệu chủ đề định kỳ kỹ thuật protein đại, cụ thể là, việc khai thác đa dạng tự nhiên để hướng dẫn việc lựa chọn vị trí thay Đa dạng tự nhiên kết hàng triệu năm việc thích nghi với điều kiện khác nhiệt độ, pH, chất Kỹ thuật trình đột biến Sau ghi nhận cơng nghệ DNA tái tổ hợp dùng để điều chỉnh dãy trình tự làm thay đổi chức enzym bị thay đổi chuỗi ADN mã hố cho prơtêin, tiến xuất trình đột biến Khoảng thời gian đó, ý tưởng quét alanine giới thiệu Trong mơ hình này, nhiều vị trí kiểm tra cách thay amino acid với alanine Trong trường hợp này, đa dạng để xác định vị trí đóng vai trò quan trọng cho hoạt động enzyme Trong phương pháp vị trí tiềm kiểm tra sau khám phá cách phân tích cấu trúc / hệ đa dạng Việc phát sai khác phản ứng dây chuyền polymerase (PCR) cách mạng hệ enzyme đột biến Trong thực tế, PCR cho phép việc tạo biến thể protein Tần số đột biến thí nghiệm PCR cao, thúc đẩy điều kiện phản ứng lựa chọn polymerase Một phương pháp khác để tạo phân tử đa dạng mức độ gen xáo trộn gen Trong thí nghiệm xáo trộn gen tập hợp gen tương đồng gộp lại cắt thành miếng Cuối mảnh vỡ kết hợp lại cách ngẫu nhiên 11 phản ứng PCR Kết thư viện enzyme đột biến thu nhận, cho phép kết hợp tất thể đột biến tự nhiên mà phân bố gen khám phá Các thể đột biến không cho phép biến thể axit amin riêng lẻ kiểm tra, mà ảnh hưởng tới amino axit chèn xóa bỏ tạo protein khác Khả nhận biết thể đột biến quan trọng cho việc định thành công cho kỹ thuật protein Một vị trí đột biến khoa học dễ dàng để mô tả, để sàng lọc cho thư viện ngẫu nhiên đòi hỏi kiến thức tuyệt vời để sàng lọc Thể thực khuẩn công cụ quan trọng cho việc sàng lọc lựa chọn protein Trong cách tiếp cận sàng lọc nhờ thực khuẩn, gen mã hóa cho protein thiết kế có liên quan đến gen mã hóa cho protein bề mặt thể thực khuẩn Kết protein thể N-hoặc C-cuối protein bề mặt Vì bề mặt, protein hiển thị chọn để liên kết với mục tiêu định Sự sàng lọc thể thực khuẩn cho phép chọn từ 109 thể đột biến thí nghiệm Ngồi ra, protein chọn lọc ln lập kết hợp với gen mã hóa cho Gen nhân vật chủ bị nhiễm thể thực khuẩn, sau xếp trình tự tạo trình đột biến Sự sàng lọc thể thực khuẩn qua thực nghiệm công cụ tốt để lựa chọn protein, chọn lọc đến phân tử đích Mặc dù enzym chủ động biểu thể thực khuẩn, sàng lọc thể thực khuẩn khơng thích hợp để thay đổi đặc tính xúc tác enzym, cần phải thiết kế trình giành riêng cho việc phát thể thực khuẩn - hiển thị enzym với hoạt động xúc tác cao Để nâng cấp loại enzyme để áp dụng kỹ thuật nằm ngồi tầm quan trọng hoạt động khảo nghiệm chọn lọc giống với ứng dụng cuối Một số ví dụ chứng minh rõ ràng xét nghiệm hoạt động với chất nhân tạo cho thấy khơng có mối tương quan với hiệu suất ứng dụng thực tế Điều thể hiệu suất thủy phân tương ứng protease với hoạt động enzyme casein Thí nghiệm hoạt động cải thiện hoạt động galactose oxidase (EC1.1.3.9) cho thấy mối tương quan hợp lý hoạt động khác galactose oxidase biến thể onthemodel substratemethyl galactose hiệu suất chúng bề mặt đường Trớ trêu thay chất biểu hoạt động tốt việc áp dụng kỹ thuật phải loại trừ khỏi liệu để có hệ số tương quan tốt r2 ¼ 0.92 (với chất thể tốt bao gồm hệ số tương quan r2 ¼ 0,72) Rõ ràng khơng kỹ thuật protein cải thiện enzym Sức mạnh kỹ thuật protein nằm kết hợp cấu trúc/chức với cách tiếp cận sinh học phân tử phù hợp với hệ thể đột biến Cuối cùng, tầm quan trọng công nghệ sàng lọc phát triển vài năm qua Chủ yếu, tự động hóa kết hợp với thu nhỏ xét nghiệm xuống kính hiển vi quy mơ dẫn đến thay đổi đột ngột thể đột biến Việc sử dụng toàn diện kỹ thuật protein biết đến tên hướng tiến hóa, tiến hóa phân tử, giống phân tử Các phương pháp tiếp cận phổ biến tiếp lặp lặp lại tạo nên ngẫu nhiên lựa chọn mới, tạo tiến hóa phòng thí nghiệm giống q trình tiến hóa tự nhiên Nó thành cơng, phòng thí nghiệm cho phép tạo điều kiện chọn lọc nhân tạo áp dụng cho việc đạo cải tiến 12 loại enzyme đặc biệt, để cải thiện hiệu enzym môi trường kỹ thuật Tiến hóa chứng minh thành cơng, thường ba chu kỳ lặp lặp lại ngẫu nhiên trình lựa chọn cho lượng sản phẩm mong muốn đạt cải thiện lớn Thành công chủ yếu giải thích thực tế ảnh hưởng đến tiến hóa tự nhiên không ép buộc phân tử để thực tốt Ngồi ra, nhà nghiên cứu cho thấy nhiều tần số đột biến cao xảy thiên nhiên Ứng dụng Kỹ thuật Protein Giới học viện Công nghiệp Việt Nam Cả hai học thuật giới khoa học công nghiệp, nhà khoa học nắm chặt công nghệ kỹ thuật protein trở thành có giá trị nửa sau năm 1980 Trong giới học viện, kỹ thuật protein sử dụng rộng rãi để làm sáng tỏ chất protein enzym đặc tính ổn định, chế xúc tác, hoạt động điều kiện khác Nhà khoa học công nghiệp tập trung vào kỹ thuật để cải thiện hiệu suất enzym ứng dụng công nghiệp Giải mã kỹ thuật cấu xúc tác Protein dùng để nhận biết acid amin mà tham gia vào chế xúc tác, trước sau có sẵn thơng tin cấu trúc 3D Nghiên cứu tồn diện chế enzym kỹ thuật protein thực tyrosyl - tRNA synthetase bắt đầu vào năm 1980 Những nghiên cứu toàn vẹn trình bày số tài liệu khác Kỹ thuật protein dùng để xác định vị trí có hoạt tính prơtê in, chẳng hạn, lipaza Chất cho electron, nguyên tắc lipase nhạy cảm với hooc môn xác định dãy phân tích đoạn GXSXG đặc trưng nếp / b - hydrolase thay tiếp vị trí 423của serine, vài acid amin khác Vì tất thể đột biến khơng có hoạt tính này, tác giả kết luận serine 423 vị trí có hoạt tính lipase nhóm khác nhận biết thí nghiệm tương tự, toàn bộ ba xúc tác lipaza khác Điều tra ARTINELLE M, H OLMQUIST et al Mở rộng khái niệm việc kiểm tra vai trò acid amin gần vị trí có hoạt tính lipase đặc trưng chất Nghiên cứu ổn định Enzym Sự ổn định protein ảnh hưởng axit amin lên ổn định protein nghiên cứu với kỹ thuật protein Kể từ việc thay đổi axit amin cấu trúc protein có ảnh tới protein, điều cần phải sử dụng mơ hình phù hợp lập kế hoạch đột biến dựa sở cấu trúc 3D protein Một đường để protein ổn định đời liên kết disulfide - nơi điều khiển trình đột biến Trong subtilisin, enzym khơng có dư lượng cysteine, đưa vào cysteine cho serine alanin vị trí 22 87 24 87 dẫn đến hình thành cầu disulfide mang lại enzym có khơng có ổn định tổng thể LARKE et al c cho thấy đề tài nghiên cứu barnase ứng dụng liên kết disulfide làm ổn định làm ổn định prôtêin Cầu disulfide giữ cân toàn cấu trúc phân tử dẫn đến ổn định vùng theo liên kết hydro Cầu disulfide làm thay đổi ổn định cấu trúc, bao gồm chuyển động vùng gần liên kết disulfide Ảnh hưởng thay acid amin đơn nghiên cứu chi tiết với vài protein mơ hình Nghiên cứu cho thấy ảnh hưởng acid amin ổn định hình xoắn tùy theo vị trí đường xoắn nó, vị trí hình xoắn cấu trúc protein hình cầu, khả tiếp cận dung môi vị trí đột biến 13 Sự phức tạp tương tác ổn định gây bất ổn đột biến q trình tiến hóa chứng minh nghiên cứu đột biến so sánh barnase binase Cả RNA có 85% dãy nhận diện.Chỉ có 17 axit amin rải rác tồn trình tự, khác biệt với protein , có cấu trúc 3D khác ổn định Từng acid amin thay kết hợp thể đột biến đơn cho thấy đột biến có ảnh hưởng đến ổn định tác động khác Tuy nhiên, kết hợp sau biến đổi tạo protein ổn định hai phân tử gốc ban đầu khơng có ảnh hưởng hoạt động Nghiên cứu cho thấy so sánh đơn giản trình tự cấu trúc 3D enzym từ sinh vật ưa nhiệt không dẫn đến việc xác định ổn định thay đổi axit amin , chất cân số hiệu ứng q trình tiến hóa để có tập hợp enzyme đủ tốt cho mục đích Enzym ứng dụng cơng nghiệp ứng dụng thành công vào chế biến tinh bột công nghiệp Trong giai đoạn đầu enzym amilaza dùng để chia cắt tinh bột thành đường chưa bão hoà thành phân tử ngắn Ở trình thương mại enzym phải chịu qua áplực nước 105 oC, để phá vỡ hạt tinh bột, thực hiên 90 o C 1-2 h Với enzym amilaza tự nhiên tùy ý, B licheniformis enzym amilaza - ( BLA ), pH phải điều chỉnh đến điều chỉnh lại giai đoạn Một ứng dụng enzym amilaza hoạt động độ pH thấp cần thời gian tiền bạc lớn loại bỏ nhu cầu cần có điều chỉnh pH Phân tích BLA chức pH cho thấy ổn định enzym giảm độ pH thấp Ban đầu, ngẫu nhiên trình đột biến bảo vệ thực khơng có mơ hình đáng tin cậy cấu trúc ba chiều, vài thể đột biến xác định Một lần cấu trúc trở thành có sẵn cho thấy thể đột biến đại diện cho thay Lạ điều enzym amilaza có ổn định tổng thể thấp BLA Bằng cách sử dụng cấu trúc ba chiều hướng dẫn để nhận biết toàn thay khác nằm bề mặt BLA Subtilisin hoạt động mơi trường hồn tồn khác với mơi trường tự nhiên nó, chất tẩy rửa chất phụ gia, subtilisin phải thực pH có tính kiềm cao, bề mặt cao tập trung, nhiệt độ cao Nó phải hoạt động loạt protein gặp phải tác nhân khác oxy hóa hydrogen peroxide, thêm vào chất tẩy trắng Vì vậy, enzyme thiết kế để chủ động ổn định theo điều kiện Một kết có lợi đột biến mà từ nhạy cảm với oxy hóa tìm thấy chất tẩy trắng thương mại loại bỏ Điều chủ yếu đạt cách thay dư lượng thuốc tẩy nhạy cảm methionine Điều tra Protein Folding Việc áp dụng kỹ thuật protein cho giải phẫu đường gấp nếp protein xem xét Số lượng kỹ thuật thực nghiệm khác sử dụng cho mục đích rõ ràng nhấn mạnh tính chất liên ngành kỹ thuật protein Thay đổi Chất Enzym Specifity việc sử dụng enzym chất xúc tác sinh học cho phản ứng hóa học gần lấy lại quan tâm ( xem phần 6.1 ) Vài dự án kỹ thuật protein thực thành công Họ chủ yếu áp dụng phương pháp tiếp cận theo hướng tiến hóa khác để chứng minh khả cho phát triển cải thiện biocatalysts Hoạt động subtilisin E dung dịch nước DMF cải thiện kỹ thuật protein Subtilisins có hoạt động thấp giảm tính ổn định DMF tác giả tăng cường ổn định 40% DMF gấp đôi Nhưng nhiều quan trọng tăng cường hoạt động thực cách phát triển chu kỳ Các phân 14 tử cuối cho thấy cải tiến hoạt động 471 lần 60% DMF kiểm tra bề mặt so với hoang dại phân tử Khả thay đổi phạm vi chất chọn lọc kỹ thuật protein phương pháp chứng minh nhiều tác giả Trương et al Được sử dụng DNA xáo trộn để thay đổi đặc trưng bề mặt b-galactosidase (EC 3.2.1.23) Trong đó, dại phân tử cho thấy khơng có hoạt động thử nghiệm với gốc fucose, enzyme cuối hoạt động chống lại chất Các hoạt động chống lại galactose chất giảm đáng kể Sự thành công kỹ thuật enzym enantioselective cuối chứng minh công nghệ protein-kỹ thuật ngày chí giải vấn đề tinh tế tổng hợp hóa học Trong số nghiên cứu enzym khác chứng minh enzyme protein-kỹ sư để có cải thiện enantioselectivity, chủ yếu cho phản ứng thủy phân Cách nhìn Có điểm giống tự nhiên điều khiển tiến triển, khác biệt phần lớn quản lý đa dạng Kỹ thuật prôtêin điều khiển tiến triển nơi bảo vệ đa dạng quản lý can thiệp thay cho chọn lọc tự nhiên Mặc dù thế, kiến thức cấu trúc ba chiều quan hệ để chức thường quan trọng xác định vị trí nơi khu vực, quan trọng cho tập trung đa dạng tuyển chọn Kỹ thuật DNA lại sử dụng kiểm tra chiến lược để kết hợp tính gen chọn lọc tự nhiên để cố gắng tái kết hợp tuyển chọn đặc tính nguồn enzyme Bây với kiến thức hệ gien toàn so sánh mong đợi hệ gien lồi có liên hệ mật thiết, để thực silico shuffling có lẽ hiểu ưu đãi cố hữu tiến triển phân tử riêng áp đặt metabolome sinh vật - ban nhạc chức phân tử cần thiết cho bảo trì chuyển hố sinh sản sinh vật tồn Yếu tố tiến triển điều khiển silico u cầu để dự đốn ba - thứ nguyên cấu trúc với thêm nhận tiềm xúc tác chí để suy luận sinh lý xảy vai phân tử metabolome 15 ... rãi có liên quan đến việc phát triển vi khuẩn đĩa thạch có chứa chất enzyme thích hợp cho việc theo dõi hoạt động enzyme mong muốn Ví dụ, kết hợp casein nguồn carbon vào môi trường thạch với bề... khiết prơtêin, khơng có phát triển đồng thời phương pháp vật lý lớn số lượng liệu cấu trúc khơng có ngày hơm (xem Chap 1) Chất lượng OFX –ray liệu cải thiện cách phát triển phần cứng tia X-quang... vi khuẩn chưa biết rõ Sự khác biệt đơn vị phát sinh lồi vi khuẩn phản ánh khác biệt đáng kể sinh lý Phát triển công nghệ gần may mắn phép tiếp cận vào phần vi sinh vật tự nhiên Có thể chiết