đề tài microbial production, isolation and purification

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỀ TÀI: MICROBIAL PRODUCTION, ISOLATION AND PURIFICATION Mục Lục 3.1 vi sinh vật sản xuất Sử dụng lên men hiếu khí chìm lò phản ứng khuấy trộn cơng nghiệp đặc trưng trình sản xuất enzyme liên quan đến vi sinh vật chủ yếu enzym ngoại bào Phần tập trung vào trình điển hình Hình 11 cho thấy hoạt động trình sản xuất, thơng tin tìm thấy đây! Cơng nghệ sinh học sổ tay nguyên tắc phương pháp [119-121] vi sinh Phần có liên quan với thân q trình lên men, có ba yếu tố - sinh vật, thiết bị, phương pháp cho trình lên men - thảo luận Những yếu tố phải bố trí cách hiệu để đạt kết tối ưu kinh tế cơng nghiệp Tối ưu hóa quy trình cơng nghệ sinh học nỗ lực nhiều ngành Trong khứ, trình phát triển cơng nghệ sinh học nhìn giống nghệ thuật q trình kiểm sốt thiếu chặt chẽ Chương nói lên điều đó, dựa trạng nó, quy trình sản xuất kiểm soát chặt chẽ Để đạt mức độ kiểm sốt q trình lên men, sinh vật biến đổi gen phải điều chỉnh, phương pháp trình phải phù hợp với khả sinh lý thể vi sinh vật hạn chế thiết bị 3.1.1 Sinh vật enzyme tổng hợp Một loạt vi sinh vật khác sử dụng cho sản xuất công nghiệp enzym chúng bao gồm gam phân loại từ loài điển nấm men nấm hệ thống prokaryote từ hai họ gram âm gram dương Khi chế phẩm sinh học coi tốt, dòng tế bào động vật côn trùng tham gia Đối với hầu hết ứng dụng enzyme lịch sử quan tâm đến sản xuất xảy biến đổi biết đến để tạo enzyme Điều giải thích nhiều loại vi sinh vật khác sử dụng để làm enzym Protease tự nhiên tiết Bacillus licheniformisto phá vỡ proteinaceous kết emzym sản xuất thương mại Enzyme, subtilisin Carlsberg, sử dụng chất tẩy rửa Chúng lựa chọn để sản xuất protease cấp cao hơn, ngành công nghiệp đời Một câu chuyện tương tự theo dõi sản xuất một-amylase Một lần nữa, licheniformis Bacillus tự nhiên tiết chất chịu nhiệt amylase có khả phá vỡ tinh bột để dễ dàng oligosaccharides tiêu hóa Chủng Bacillus ngựa thồ sản xuất enzyme nhiều thập kỷ, chủ yếu dựa vào khả chúng để sản xuất thừa subtilisin amylase [125] Trong lịch sử Amylase từ vi khuẩn Bacillus sử dụng để hóa lỏng tinh bột Tuy nhiên, để phá vỡ chúng hoàn toàn tạo thành đơn vị nhỏ glucose, enzyme thứ hai, cụ thể glucoamylase bổ xung Enzyme sử dụng rộng rãi cho sản xuất glucose từ tinh bột gluco amylase từ chủng nấm genus Aspergillus [126] Chủng vi khuẩn phân lập năm qua va glucoamylase sản xuất số lượng nhiều Enzyme cellulase axit phức tạp tìm thấy nấm Trichoderma [127] Hỗn hợp enzyme cho có khả phá vỡ chất cellulose thành glucose, tương tự enzym thủy phân tinh bột Ứng dụng cụ thể ban đầu không thương mại hóa Thay vào đó, tìm thấy nhiều ứng dụng ngành dệt may Kỹ thuật giúp cải thiện enzyme phức tạp tái tạo lại đặc tính sử dụng chất phụ gia cho phân hủy cellulose Như với hệ thống khác trên, chủng phân lập suất cao Một ví dụ cuối sản xuất glucose từ xylose isomerase isomerase xúc tác xếp lại tạo đường glucose từ fructose, tăng vị ngọt, hương vị cho sản phẩm Enzyme phát có khả chuyển đổi cơng nghiệp aspecies có nguồn gốc từ Steptomyces Tất loại giống mô tả ví dụ có khả phân lập Trực khuẩn phát triển mạnh tự nhiên khả tồn chấn thương khác cách nảy chồi, tồn đọc lập, bào tử Các bào tử trạng thái ngủ gặp mơi trường mà nảy mầm phân chia Quy định sản xuất protease có liên quan đến khác biệt Đặc tính phức tạp tạo khó khăn cho việc hỗ trợ q trình phát triển Tương tự nói loài nấm Aspergillus Trichoderma Sự khác biệt chúng làm cho q trình phát triển mơ khó khăn Mặc dù Streptomyces khơng thực sinh bào tử, phân biệt cách thành sợi trái ngược với lập riêng tế bào Đặc tính có tác dụng hình thành sản phẩm tính chất vật lý nước dùng lên men Một sinh vật xem hệ thống trao đổi chất, chuyển đổi chất vào tế bào sản phẩm phụ chức enzyme có hệ thống chất xúc tác cho phản ứng khác Mỗi tế bào trang bị chế điều chỉnh trình tổng hợp hoạt động enzyme để kích hoạt tế bào để đáp ứng đầy đủ thay đổi môi trường Vì vậy, dạng nó, sinh vật mơ tả tập hợp thành phần trao đổi chất với chế để tổng hợp enzyme máy quản lý Động học trình xác định thành phần cấu trúc thể yếu tố khác vật lý hóa học, nhưtrong hinh 12 Vai trò mà enzyme xuc tác q trình sinh học dẫn đến nghiên cứu sâu rộng chế quy định tổng hợp [128], [129], số kết có liên quan đến vấn đề trình phát triển Các chế tổng hợp enzyme, bao gồm chép, biến dạng xử lý post translational, bảo tồn cao Tuy nhiên, số khác biệt tồn lớp khác sinh vật, số khác biệt sinh vật prokaryote eukaryote khác vô lớn khối lượng phân tử, số chuỗi polypeptide, điểm đẳng điện, mức độ glycosyl hóa Ngồi ra, nhiểu emzyme tồn loài Mặc dù tất khác biệt ảnh hưởng đến đặc điểm mơ hình tổng hợp, chế để tổng hợp enzyme giống đủ phép xử lý trình sản xuất vi sinh vật Tuy nhiên, khác biệt động lực học sản xuất loài khác đủ lớn để làm cho chương trình cá nhân tối ưu hóa cần thiết Sinh vật khác khác phù hợp cho trình lên men, đặc điểm trình độ nhớt thu hồi, giải phóng thể, kiến thức có sẵn vật lựa chọn, phải xem xét Q trình phát triển phải đối phó với phức tạp hệ thống tổng hợp enzyme oặc cách thay đổi đặc điểm cấu trúc, bao gồm yếu tố cấu trúc hệ thống quản lý (xem mục 3.1.2), cách chọn tối ưu môi trường (xem Phần 3.1.3) 3.1.2 Cải thiện giống Hầu hết chủng sử dụng để sản xuất enzyme biết từ trước Đột biến hóa chất tia cực tím sử dụng để nhanh chóng biến bị nhanh tìm thấy biến bị hữu ích Nhiều tế bào phải đưa vào đột biến thủ tục khuyến kết hợp sau thử nghiệm cho kết hợp mong muốn đặc điểm cách lựa chọn Đột biến làm thay đổi cấu trúc protein làm thay đổi chức chúng Đột biến thay đổi thành phần cấu trúc có lợi mát cụ thể chức cần thiết cho mục đích sản xuất, ví dụ như, chức điều tiết làm giảm kết tăng cường sản xuất enzyme Đột biến lựa chọn hướng chủ yếu hướng tới suất tổng thể cao đột biến chức cụ thể, chúng chức quy định xảy Tuy nhiên, số nghiên cứu mơ tả tầm sốt đột biến chức cụ thể [135] Dựa phụ thuộc lẫn phức tạp đường cạnh tranh chất thể, đột biến ngẫu nhiên ảnh hưởng đến tỷ lệ tổng hợp enzyme Chỉ thay đổi nên dự kiến, loạt đột biến dẫn đến mức độ dáng ý cải tạo Trong thí nghiệm kỹ thuật recombina hóa sử dụng để bổ sung cho kỹ thuật đột biến cách đưa đột biến dòng tế bào khác làm chủng đột biến có hại khơng mong muốn [122] Cải thiện giống cách mạng hóa đời kỹ thuật di truyền Khả cải thiện đặc biệt giống thao tác hệ gen vật chủ bổ sung yếu tố DNA nhiễm sắc thể tăng đáng kể tốc độ cải thiện giống Trong giai đoạn đầu, hầu hết công việc thực giống mà phương pháp để thao tác DNA tạo thành Nỗ lực thực để thể tạo enzyme khác Escherichia coli Tuy nhiên, E coli thường không tiết protein thay vào chúng thơng qua hình thức khơng hòa tan (gọi thể vùi) tế bào chất tế bào Nó chứng minh hiệu qủa thao tác kỹ thuật DNA nguồn góc enzym khác Hiện nay, gần tất chủng sản xuất sử dụng thương mại biến đổi gen Giống cải thiện thông quat hêm gen quan tâm, loại bỏ tính ức chế, tăng cường tính tích cực Nếu khơng có mặt tính chất nêu ra, cải thiện đáng kể cách thực tăng tỷ lệ đạt bước tổng hợp Kỹ thuật di truyền sử dụng để tăng tỷ lệ tổng hợp mRNA cách xây dựng plasmid có chứa gen mong muốn (nhân gen) Số lượng plasmid tế bào cao Tỷ lệ tổng hợp mRNA liên quan tuyến tính với số lượng gen, tỉ lệ tổng hợp enzyme giới hạn lại bước trình Những kỹ thuật cho phép thay promoter cho hiệu [139] Cùng phương pháp cho phép thay chuỗi gen, dẫn đến tiết enzyme tế bào Kỹ thuật di truyền sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzyme sinh vật, vị trí gen tương ứng đưa vào vi sinh vật sau diện intron ngăn chặn biểu thích hợp gen, kỹ thuật phát triển để vượt qua khó khăn [136] Chymosin (E.C 3.4.23.4) [9001-98-3], bê men dịch vị, nhân vơ tính nhiều nhóm sinh vật nhân sơ hay men bia, enzyme động vật có vú nhân vơ tính sản xuất công nghiệp vi sinh vật [141] Phương pháp để cải thiện hiệu suất giống phát triển (khoảng 2002) Chúng bao gồm xáo trộn gen thay đổi tiến hóa Hầu hết tài liệu liên quan đến kỹ thuật tập trung vào việc cải thiện đặc tính enzyme cụ thể (xem phần 4.2) Tuy nhiên, tiến triển áp dụng cho sản xuất vượt mức enzym định tốt Bởi mutagenizing plasmid chứa gen subtilisin, sản xuất enzyme tăng lên năm lần [142] Người ta thấy gen cấu trúc không thay đổi hiệu promoter cải thiện chép số lượng plasmid cao dẫn đến phiên mã cao 3.1.3 Tối ưu hóa sinh lý Hình 12 cho thấy khơng có đặc điểm cấu trúc hệ thống, mà thông số đầu vào, xác định hoạt động trao đổi chất Khi sinh vật thích hợp tìm thấy, cải thiện di truyền hay không, nhiệm vụ trình phát triển xác định thông số đầu vào tối ưu - Tỷ lệ enzyme tổng hợp lại xác định bởi: re = cxqe re tỷ lệ tổng hợp enzyme đơn vị: lít/giờ Cx nồng độ sinh khối gram/lít Qe tỷ lệ enzyme tổng hợp cụ thể đơn vị gam sinh khối Về động lực học, tối ưu hóa tốc độ tổng hợp enzyme có nghĩa tìm tỷ lệ tổng hợp cụ thể cao cho số lượng định sinh khối Vì tổng hợp enzyme phụ thuộc nhiều vào trao đổi chất bản, máy móc di động hồn tồn phải hoạt động tất lần Vì vậy, điều kiện thuận tổng hợp enzyme có lợi cho tăng trưởng, đề xuất Hình 12 Việc tìm kiếm điều kiện tối ưu để tổng hợp enzyme sau giảm tới điều kiện ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng mối quan hệ tốc độ tổng hợp enzyme cụ thể tốc độ tăng trưởng Tăng trưởng thể tốc độ tăng trưởng µ cụ thể số lượng sinh khối tổng hợp đơn vị sinh khối đơn vị thời gian: µ= dc x cx dt Trong cx nồng độ sinh khối gram/lít t thời gian Cụ thể tỷ lệ tổng hợp enzyme tốc độ tăng trưởng cụ thể thể hoạt động trao đổi chất tế bào Monod [143] xây dựng mối quan hệ tốc độ tăng trưởng chất xây centration như: µ = µ max đó: ks cs cs cs + k s µ max tốc độ tăng trưởng đạt tối đa bão hòa nồng độ chất Theo mối quan hệ tốc độ tăng trưởng thực tế nồng độ chất thấp thấp giá trị tối đa xác định thuộc tính cấu trúc sinh vật Khi cs >> ks ,tốc độ tăng trưởng đạt giá trị tối đa Các thơng số µ max ks phụ thuộc vào độ pH, nhiệt độ, áp suất thẩm thấu yếu tố khác Khi tất chất có mặt mơi trường dư thừa ngoại trừ ( µ< µ max ), bề mặt gọi yếu tố hạn chế, trường hợp này, giới hạn tăng trưởng bên tồn tăng trưởng coi trạng thái tự nhiên cho vi sinh vật [144] Động lực học tổng hợp enzyme thể phương trình cho tất enzym Thay vào đó, số mơ hình tỷ lệ tổng hợp so với tốc độ tăng trưởng µ thể hình 13 Các đường cong lý tưởng, nhiều ví dụ tìm thấy tài liệu [145-148] Điều kiện sinh lý để tổng hợp Hoàn chỉnh mô tả đặc điểm sinh lý bao gồm kiến thức mối quan hệ qe đến µ, suất khác nhau, ảnh hưởng yếu tố V0 = khối lượng bắt đầu V= khối lượng trao đổi Hình 21 mơ-đun siêu lọc khác : A) mơ-đun khung (với giúp đỡ DDS, Ro-Division); B) mô-đun sợi rỗng (với giúp đỡ Amicon); C) mô-đun băng từ (với giúp đỡ Millipore) Do đó, hồn thành 99% việc trao đổi muối khối lượng thấm V0, không phụ thuộc vào nồng độ bắt đầu 3.2.4 Quá trình tinh Trong nhiều ứng dụng công nghiệp, chế phẩm enzyme phần tinh khiết đủ, nhiên, enzyme cho mục đích phân tích sử dụng y tế phải tinh khiết cao.Phương pháp đặc biệt sử dụng để lọc enzyme kết tinh, điện, sắc ký 3.2.4.1 Phương pháp kết tinh Sự phát triển nhanh chóng việc sử dụng enzyme lĩnh vực thương mại nông nghiệp sản phẩm tiêu dùng đòi hỏi phải có phương pháp tinh thuộc quy mô công nghiệp đồng thời dùng chi phí thấp thành phẩm cao Kết tinh cơng nghệ tinh hóa học lâu đời có khả đáp ứng đầy đủ yêu cầu Kết tinh ezyme hình thành hạt enzyme dạng rắn với hình dạng kích thước xác định Một enzyme cảm ứng để kết tinh hình thành tương tác protein-protein cách tạo điều kiện hòa tan dẫn đến bão hòa enzyme Phần lớn trọng tâm việc kết tinh enzyme tập trung vào vấn đề thu tinh thể dùng cho việc phân tích nhiễu xạ tia X khơng phải quy trình tinh Tuy nhiên, quan tâm thu hút ngày tăng việc kết tinh lại quy trình tinh Thách thức lại việc phát triển lý thuyết lẫn kiểm tra kỹ thuật để thiết lập khu vực chắn quy trình kết tinh với suất cao mà không cần nhiều thử nghiệm thực tế Những tiến gần theo hướng bao gồm việc sử dụng phương pháp sắc ký tự tương tác việc đo lường hệ số thẩm thấu protein virian lần thứ hai để dự đoán kiểu protein kết tinh [238]và phát triển hệ thống sàng lọc phân tích cơng suất cao thiết lập nên điều kiện kết tinh protein vững chắc[239] Lý thuyết thực hành kết tinh protein quy mô xem xét [240], [241] Rất nhiều báo cáo kết tinh enzyme từ trình lên men số lượng lớn nhằm mục đích lọc cơng bố [242-244] Enzyme kết tinh để sản xuất thương mại gồm có cellulase [245], [246], isomerase đường [247] subtilisin [247], [248], rượu oxidase [249] Hình 22 cho thấy bước liên quan quy trình kết tinh cho loại enzyme cơng nghiệp [248] Thể tích ngun liệu ban đầu trình kết tinh enzyme điển hình lớn lên đến hàng ngàn lít dung dịch enzyme chưa tinh khiết Những đặc điểm mong muốn kết tinh enzyme quy mô công nghiệp độ tinh khiết sản phẩm, suất trình, dễ dàng phục hồi tinh thể, thời gian thực tổng thể ngắn Để đạt mục tiêu này, trình kết tinh cần thiết kế cách cẩn thận cải thiện nhằm sản xuất tinh thể với kích thước tương đối lớn với hình dạng mong muốn Hình 22 Mơ hình kết tinh muối halogen subtilisin quy mô công nghiệp Rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến kết tinh enzyme, gồm loại muối, nồng độ, pH, nhiệt độ, diện số lượng khác tạp chất, chất trộn lẫn, hạt tinh thể, Kiểm sốt mức độ bão hòa suốt q trình kết tinh điều cần thiết để tối ưu hóa kích thước tinh thể, điều kiểm soát cách sử dụng phương pháp kết tủa muối, pH, nhiệt độ [235], [250] nhiệt độ đóng vai trò quan trọng tốc độ kết tinh enzyme Cellulase [245], [248] subtilisin [251], [252] chứng minh tốc độ kết tinh tăng lên nhiều mà ta gia tăng nhiệt độ Một số enzyme tạo để phát triển nhiều hình thái khác cách thay đổi điều kiện kết tinh trình kết tinh Subtilisin thể dạng tinh thể có hình hình chữ nhật cách tạo hạt nhân nhiệt độ thấp, sau phát triển tinh thể nhiệt độ cao Tinh thể dạng hình chữ nhật hình thái pha trộn hình thái nhiệt độ thấp hình thái nhiệt độ cao, tương ứng dạng dạng hình vng 3.2.4.2 Phương pháp điện di Điện di sử dụng để phân lập enzyme tinh khiết quy mơ phòng thí nghiệm Tùy thuộc vào điều kiện mà phương pháp sau sử dụng: vùng điện di, phép điện di đẳng tốc, nồng độ xốp Lượng nhiệt sinh trình điện di cản trở gây đối lưu vấn đề liên quan đến việc mở rộng quy mô phương pháp 3.2.4.3 Phương pháp sắc ký Sắc ký tảng quan trọng phương pháp tinh enzyme (Bảng 5) Bảng 5: phương pháp sắc ký Loại sắc ký Hấp phụ Phân bố Trao đổi ion Sắc ký lọc gel Nguyên tắc Bề mặt liên kết Phân bố cân Liên kết ion Lỗ rỗng khuyếch tán Ái lực Chất kị nước Đồng hóa trị Kim loại chelat hóa Sự hấp thụ đặc biệt Chất kị nước chelat hóa Liên kết đồng hóa trị Hình thành phức hợp Cơ sở phân tách Bề mặt lực Cực tính Điện tính Kích thước phân tử, hình dạng phân tử Cấu trúc phân tử Cấu trúc phân tử Cực tính Cấu trúc phân tử Các phân tử tách dựa theo tính chất vật lý chúng (kích thước, hình dạng, điện tích, tương tác kỵ nước), tính chất hóa học (liên kết cộng hóa trị), đặc tính sinh học (mối quan hệ sinh học đặc biệt) Trong sắc ký gel (còn gọi sắc ký lọc gel), ta dựa vào tính ưa nước, hạt gel liên kết ngang với lỗ có kích thước giới hạn sử dụng cột để phân tách phân tử sinh học Giải pháp cô đặc thực cần thiết cho việc phân tách thể tích mẫu cho vào cột giới hạn khoảng 10% thể tích cột Các phân tử lớn lỗ lớn hạt gel, tức vượt giới hạn cho phép nhập vào gel rửa giải Các phân tử nhỏ khuếch tán vào lõi hạt gel để thay đổi mức độ phụ thuộc vào kích thước hình dạng chúng, di chuyển chậm lại phân đoạn thơng qua cột rửa giải dần theo thứ tự giảm dần khối lượng phân tử Thể tích rửa giải protein hình cầu tỷ lệ thuận với logarit khối lượng phân tử [255] Bằng cách thay đổi mức độ liên kết ngang, ta có hạt gel với độ xốp khác đồng thời thu dải phân đoạn khác Mơi trường chung bao gồm cho tất kích thước phân tử thể (bảng 6) Chúng bao gồm dạng khác Sephadex, thu liên kết ngang dextran [9004-54-0] với epichlorohydrin [106-89-8]; Sephacryl, tạo liên kết ngang allyldextran với N, N-methylene-bisacrylamide [110-26-9] Sắc kỹ lọc gel sử dụng theo mục đích thương mại cho việc phân tách lẫn khử muối giải pháp enzyme Bảng 6: Mơi trường sắc kí lọc gel Tên thương mại (sản xuất) Biogel (Bio-Rad) Ultrogele (LKB) Fractogel (Merck) Sephadex (Pharmacia) Sepharose Nền polyacylamide (P-type) agarose (A-type) agarose/polyacrylamide agarose vinyl polymer (various types) dextran (various types) agarose Phạm vi phân đoạn, Mr 100–400 000 1000–150 106 60 000–1.3 106 25 000–20 106 100–5 106 50–600 000 10 000–40 106 (Pharmacia) Sephacryl (Pharmacia) Glycophase (Pierce) cross-linked agarose sephacryl/bisacrylamide 10 000–40 106 5000–1 106 surface-modified glass (1,2-dihydroxypropylsubstituted) 1000–350 000 Sắc ký trao đổi ion kỹ thuật phân tách dựa điện tích phân tử protein Các phân tử enzyme vừa tích điện dương lẫn tích điện âm Mạng lưới điện tích bị ảnh hưởng pH, sử dụng để phân tách protein phương pháp sắc ký trao đổi anion (mang điện tích dương) trao đổi cation (tích điện âm) (Bảng 7) Mẫu cho vào môi trường nước cường độ lực ion thấp, rửa giải tốt ta tiến hành với gia tăng nồng độ muối Do hiệu ứng tập trung, mẫu áp dụng dạng pha loãng Bảng : Trao đổi ion Tên thương (sản xuất) Cellex mại Nền cellulose Bio-Gel A (Bio- agarose Rad) synthetic polymer Trisacryl (LKB) vinyl polymer Fractogel (Merck) Sephadex (Pharmacia) Sepharose (Pharmacia) Sepharose FF * Q-Sepharose S-Sepharose Sephacel (Pharmacia) dextran Trao đổi anion Nhóm cation DEAE ECTEOLA QAE TEAE DEAE CM Phosphoryl DEAE DEAE CM CM SP CM SP CM agarose DEAE QAE DEAE cellulose DEAE CM Khả xử lý lượng lớn việc rửa giải thành phần mẫu pha loãng dạng đậm đặc khiến trao đổi ion trở nên tốt Chất sử dụng để sản xuất trao đổi ion cần có đầy đủ tính thấm nước để ngăn chặn enzyme biến tính có dung lượng cao cho phân tử lớn cân nhanh chóng Ngồi ra, ứng dụng cơng nghiệp yêu cầu trao đổi ion phải mang lại độ phân giải tốt, cho phép tốc độ dòng chảy cao, chịu thay đổi nhỏ khối lượng với nồng độ muối thay đổi độ pH, dễ dàng phục hồi Đối với sắc ký tương tác kỵ nước, mơi trường có nguồn gốc từ phản ứng CNBr – d nhằm kích hoạt Sepharose với aminoalkanes việc thay đổi chiều dài chuỗi cho phù hợp [256] Phương pháp dựa tương tác nhóm tương tác kỵ nước phân tử protein với nhóm kỵ nước chất Quá trình hấp phụ xảy nồng độ muối cao, phân đoạn liên kết hợp chất đạt cách cho giải hấp với nồng độ muối âm tính Phương pháp lý tưởng cho việc tiếp tục tinh chế enzym sau enzyme tập hợp việc kết tủa với muối amoni sulfat Trong sắc ký lực, enzyme tinh khiết cách đặc biệt đảo ngược hấp phụ tác nhân phản ứng gắn vào hỗ trợ khơng hòa tan Tác nhân phản ứng phù hợp chất tương ứng, chất ức chế enzyme, thuốc nhuộm, chelate kim loại, kháng thể Nguyên tắc sắc ký lực thể hình 23 Chất khơng hòa tan (C) chứa cột Các tác nhân phản ứng sinh học đặc biệt, ví dụ như, chất ức chế enzyme (I), gắn vào chất Hỗn hợp enzym khác (E1, E2, E3, E4) áp dụng cho cột Các tác nhân phản ứng cố định liên kết đặc biệt với enzyme bổ sung Các chất không ràng buộc rửa giải, enzyme cần quan tâm (E1) thu hồi cách thay đổi điều kiện thí nghiệm, ví dụ thay đổi pH cường độ ion Hình 23 Sắc kí lực Các ion kim loại xem nhân phản ứng Chúng gắn vào chất với giúp đỡ tác nhân tạo phức, ví dụ như, iminodiacetic axit [142-734] Ở đây, enzyme tách dựa sức mạnh tương tác khác với ion kim loại [257] Sắc ký miễn dịch chiếm vị trí đặc biệt cơng nghệ tinh Trong quy trình này, kháng thể đơn dòng sử dụng tác nhân phản ứng Do đó, việc phân lập chất cụ thể từ hỗn hợp sinh học phức tạp thao tác hoàn toàn Trong quy trình này, enzyme tinh kháng thể miễn dịch đặc hiệu enzyme mong muốn Một phương pháp tổng quát cung cấp tổng hợp protein kết hợp với protein A cách'' kỹ thuật protein'' Protein A protein vi khuẩn Staphylococcus có lực cao nhiều globulin miễn dịch, đặc biệt lớp IgG kháng thể Bằng cách này, enzyme không liên kết với kháng thể tinh chế sắc ký miễn dịch Sắc ký liên kết cộng hóa trị khác so biệt với loại sắc ký khác liên kết hóa trị hình thành protein yêu cầu pha tĩnh Nguyên tắc minh họa hình 24 cho loại enzyme có chứa nhóm phản ứng mercapto, chẳng hạn urease (EC 3.5.1.5) [9002-13-5] [258] Hình 24 Sắc kí cộng hóa trị Sắc ký quy mơ cơng nghiệp Các ứng dụng phương pháp sắc ký quy mô công nghiệp năm 1960 khử muối giải pháp enzyme cách sử dụng gel liên kết ngang cao Sephadex G-25 phân tách hàng loạt phương pháp trao đổi ion DEAE-Sephadex A-50 Tính ổn định thủy tính mơi trường sắc ký cải thiện mà kỹ thuật sử dụng quy mô sản xuất Các thông số quan trọng cho mở rộng quy mô hệ thống sắc ký chiều cao cột, tốc độ dòng chảy tuyến tính, tỷ lệ khối lượng mẫu khối lượng giường [259] Khoanh vùng lây truyền cản trở hoạt động cột Yếu tố góp phần khoanh vùng lan truyền khuếch tán theo chiều dọc cột, thiếu cân bằng, lấp đầy cột không đầy đủ Khuếch tán theo chiều dọc giảm thiểu cách sử dụng dòng chảy tốc độ cao Mặt khác, cân pha tĩnh pha động tối ưu hóa lưu lượng thấp Do kinh tế quy trình hiệu phụ thuộc phần lớn vào tốc độ dòng chảy, thỏa hiệp phải thực Ngoài ra, tốc độ dòng chảy phụ thuộc vào kích thước phân tử, yếu tố định thường giảm áp suất dọc theo cột lớn Mặc dù độ phân giải tối ưu đạt phân tử nhỏ nhất, gel sử dụng phải có kích thước phân tử mà phải có ưu cho thơng lượng tốt giảm bớt thời gian xử lý Việc sử dụng cột phân khúc ngăn chặn sụt giảm lượng áp suất lớn cột (Hình 25) [260] Trên hết cột phải lấp đầy cách thống cho phân bố kích thước phân tử, độ xốp, khả kháng lại dòng chảy suốt cột Nếu điều không thực hiện, giải pháp protein đột nhớt mang đến rửa giải cấu tử không đồng đều, dẫn đến khoanh vùng bị thất thoát Thiết kế đầu cột quan trọng phân phối đồng mẫu áp dụng Điều thường thực cách xếp đối xứng vài cửa hút gió chèn vào lỗ khoan để phân phối chất lỏng tốt Đầu cột phải tích tối thiểu để ngăn chặn lại pha trộn trở lại thành phần tách rời Các cột thủy tinh, nhựa, trường hợp cột lớn kim loại (thép không gỉ) sử dụng Các cột kim loại thường đánh giá cao việc đánh bóng bề mặt nhẵn mịn giúp tăng khả chống ăn mòn Viton poly (tetrafluoroethylene) (PTFE) dùng làm vật liệu hàn kín Ống dẫn nhựa polyethylene sử dụng để nối cột nhỏ Ống dẫn lớn hơn, với đường kính mm, phải làm kim loại, với kết nối trục vít đặc biệt Khơng có góc nhìn chết nên nhìn thấy rõ chất lỏng thu gom gây ô nhiễm tăng trưởng vi khuẩn Hình 25 Sắc ký KS 370 cột chồng (với giúp đỡ Pharmacia) Hình 26 cho thấy cột sắc ký cơng nghiệp điển hình Để tránh nhiễm cột, lọc khử trùng đặt lối vào lối Hệ thống sản xuất tối ưu hiệu đáp ứng tiêu chuẩn thức người Cục Quản lý Thực phẩm Dược phẩm (FDA) Bundesgesundheitsamt (BGA), mà phải tuân thủ quy tắc thực hành tốt sản xuất (GMP), sạch-tại chỗ (CIP) cần thiết Hình 26 Cột sắc ký sản xuất quy mơ (Pharmacia) 3.2.5 Hình thành sản phẩm Enzyme bán dạng dung dịch cô đặc ổn định chất rắn dạng hạt Nhiệm vụ q trình giảm thiểu thất thoát khả hoạt động enzyme trình vận chuyển, lưu trữ sử dụng Các enzyme thường tiếp xúc với môi trường ẩm ướt, nóng, oxy hóa ứng dụng cơng nghiệp công nghiệp tẩy rửa, công nghiệp dệt may, thực phẩm nước giải khát chế biến Nhiều enzyme thực giai đoạn sàng lọc nghiên cứu để xác định enzyme có cấu trúc ổn định kháng oxy hóa; ổn định hóa học làm để bảo vệ nhiệt hóa học enzyme khơng bền [261] Cơng thức tăng cường ổn định cách chống lại lực khử hoạt tính: biến tính, xúc tác-chỗ vơ hiệu hóa phân giải protein [262] Biến tính vật lý xảy diễn tiến cấu trúc protein đại học enzyme bị căng thẳng nhiệt hóa chất Khi loại enzyme bắt đầu phơ trở thành nhanh chóng dễ bị khử hoạt tính phân giải protein Để giảm thiểu diễn ra, người hoạch định làm thay đổi mơi trường protein để tạo cấu trúc protein nhỏ gọn, điều thực hiệu “loại bỏ ưu đãi” nước từ bề mặt protein cách thêm hợp chất nước kết hợp đường, rượu polyhydric , muối lyotropic [263] Những cách tốt để chống lại hoạt động chỗ khử hoạt tính để đảm bảo đủ mức độ yếu tố then cần thiết, để thêm chất ức chế thuận nghịch, để loại bỏ loại oxy hóa phản ứng từ việc xây dựng Bên cạnh tính ổn định enzym, công thức thành lập phải đáp ứng số yêu cầu trọng yếu, bao gồm trì tính chống lại nhiễm khuẩn, tránh kết tủa mặt khoa học tự nhiên hình thành khói mù, hạn chế tối đa xuất mẫn cảm với bụi bẩn hóa chất, tối ưu hóa tiêu chí thẩm mỹ màu sắc mùi Nhiều vấn đề giải tốt cách tập trung “ Ngược dòng “ nhiều có thể, bao gồm việc lựa chọn nguyên vật liệu trình lên men trình phục hồi enzyme Thao tác thuận diafiltration, hấp phụ, sắc ký,tinh thể hóa, phương pháp triết sử dụng để loại bỏ tạp chất gây màu sắc, mùi, kết tủa [264] Nguy kết tủa mặt khoa học tự nhiên tối thiểu hoá việc xây dựng gần điểm đẳng điện enzyme với dung môi ưa nước chẳng hạn glycerol propylene glycol Để đạt hiệu thêm vào mức độ vừa phải solvating muối để tránh hai tình trạng muối “ đổi chiều muối vào “ Để ngăn chặn nhiễm độc vi sinh vật, người ta sử dụng kết hợp lọc, axit hóa giảm thiểu nước tự do; chất diệt khuẩn có hiệu quả, phạm vi hóa chất chấp nhận cho việc kiểm soát giết chết vi khuẩn ngày giới hạn quy định sức khỏe an toàn An toàn lao động yếu tố phát triển thành lập cơng thức enzyme dạng hạt khơ cho hình thành cơng thức bột giặt dạng bột dệt may Kể từ năm 1970, hạt enzyme ngày trở nên đề kháng với việc bị vỡ thể chất hình thành hạt bụi khơng khí sau xử lý Hai q trình sản xuất nhiều hạt chống hao hụt lực cắt hạt cao cấp phun lớp phủ tầng sơi Các q trình sử dụng chất kết dính khác nhau, lớp phủ, hình thái hạt để sản xuất hạt nonfriable mà bảo vệ q trình bảo quản men cho phép sẵn phóng thích phân tán chúng q trình ứng dụng 3.2.6 Sử lý chất thải : Vì nhìn chung nồng độ enzyme nguyên liệu ban đầu thấp , khối lượng nguyên liệu phải xử lý lớn tích lũy lượng đáng kể chất thải Các mơi trường q trình lên men chứa lượng lớn chất dinh dưỡng không sử dụng Tuy nhiên, tái chế nhìn chung khơng thể diện chất chuyển hóa mơi trường Vẫn phận rắn sợi nấm, sử dụng thức ăn gia súc, tách Sau phải đánh dấu cẩn thận chất chuyển hóa khơng mong muốn, ví dụ thuốc kháng sinh, trước làm thức ăn cho động vật Trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp, cần phải bảo trì ngăn chặn tuyệt đối mối quan ngại lớn Chất thải phải xử lý hóa học nhiệt bất hoạt trước lý, để đảm bảo khơng có sinh vật sống mơi trường 3.2 Tính cố định: Tổng hợp, phân hủy, chuyển đổi phần hợp chất khác hệ thống sinh học xúc tác enzym, protein hình cầu tan nước Các hoạt động xúc tác enzym tạo nên nhờ cấu trúc bậc ba bậc bốn (enzyme oligomeric) chúng Tất enzyme có trung tâm xúc tác, điểm liên kết chất nền, điểm điều tiết Đặc tính enzyme chất xúc tác : (1) enzyme tham gia phản ứng xúc tác nhiệt độ môi trường áp lực phạm vi pH trung tính (2) enzyme có chất khắt khe đặc trưng, stereospecificity, regiospecificity, phản ứng đặc hiệu Thực tế cho thấy trình tiết kiệm lượng, tiết kiệm tài nguyên, nhiễm thấp thiết kế cách sử dụng enzyme, trình hoạt động nhiệt độ tương đối thấp, áp suất khí với hình thành sản phẩm phụ Tuy nhiên, cấu trúc phân tử enzyme yếu tố cần thiết cho hoạt động xúc tác chúng có khả bị phá hủy điều kiện nhiệt độ cao, độ pH cao hay thấp, diện dung môi hữu cơ, chí điều kiện phù hợp cho xúc tác Việc thu hồi enzym hoạt động từ hỗn hợp phản ứng vấn đề enzym (nonimmobilized) tự sử dụng Cố định cách để loại bỏ số nhược điểm cố hữu enzym Do đó, cố định biocatalysts-khơng enzyme mà tế bào hạt quan, tế bào vi khuẩn, tế bào thực vật, động vật tế bào-đang thu hút ý toàn giới ứng dụng thực tế bioprocesses Nói chung, cố định biocatalysts ổn định dễ dàng để xử lý so với đối tác tự chúng Một tính quan trọng chúng sử dụng nhiều lần chuỗi dài hạn phản ứng batchwise liên tục hệ thống dòng chảy Hiện nay, ứng dụng cố định biocatalysts bao gồm: (1) sản xuất hợp chất hữu ích cách lập thể bioconversion regiospecific, (2) sản xuất lượng trình sinh học, (3) xử lý có chọn lọc chất nhiễm cụ thể để giải vấn đề môi trường, (4) phân tích liên tục hợp chất khác với độ nhạy cao độ đặc hiệu cao, (5) sử dụng y khoa loại thuốc để điều trị enzyme phận nhân tạo ... hoà tan thấp trình lên men, thể hình 14 Tối đa hóa q trình vận chuyển chủ yếu vấn đề thiết kế lên men thường thể tài liệu công nghệ sinh học [121], [123], [151], [152], [153] bể phản ứng khuấy... thiện hiệu suất giống phát triển (khoảng 2002) Chúng bao gồm xáo trộn gen thay đổi tiến hóa Hầu hết tài liệu liên quan đến kỹ thuật tập trung vào việc cải thiện đặc tính enzyme cụ thể (xem phần 4.2)... hoàn toàn phải hoạt động tất lần Vì vậy, điều kiện thuận tổng hợp enzyme có lợi cho tăng trưởng, đề xuất Hình 12 Việc tìm kiếm điều kiện tối ưu để tổng hợp enzyme sau giảm tới điều kiện ảnh hưởng