Chuyển gen bt2 vào một số dòng ngô trồng bằng sử dụng mô phân sinh và agrobacterium tumefaciens

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT  NGUYỄN THỊ THU CHUYỂN GEN BT2 VÀO MỘT SỐ DÕNG NGÔ TRỒNG BẰNG SỬ DỤNG MÔ PHÂN SINH VÀ AGROBACTERIUM TUMEFACIENS LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội, Tháng 11-2015 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT  NGUYỄN THỊ THU CHUYỂN GEN BT2 VÀO MỘT SỐ DÕNG NGÔ TRỒNG BẰNG SỬ DỤNG MÔ PHÂN SINH VÀ AGROBACTERIUM TUMEFACIENS NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM MÃ NGÀNH: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS Nguyễn Đức Thành Hà Nội, Tháng 11-2015 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chƣa đƣợc công bố Hà Nội, ngày tháng Tác giả Nguyễn Thị Thu Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn năm 2015 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Đức Thành tận tình hƣớng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đặc biệt đến TS Lê Thị Bích Thủy tập thể cán Phòng Di truyền tế bào thực vật giúp đỡ mặt tinh thần, nhƣ tạo điều kiện vật chất, phƣơng tiện kỹ thuật cho tơi suốt q trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô Ban Đào tạo Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành chƣơng trình đào tạo Cuối xin cảm ơn động viên, khích lệ gia đình, bạn bè đồng nghiệp suốt thời gian làm luận văn Tác giả Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT DNA : Deoxyribonucleic acid RNA : Ribonucleic acid bp : Cặp base (base pair) CTAB : Cetyltrimethyl amoniumbromide dNTP : Deoxynucleosid triphosphat EDTA : Ethylene diamin tetra acetate EtBr : Ethidium bromide kb : Kilo base PCR : Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase chain reaction) Rnase : Ribonuclease TBE : Tris base, Boric acid, EDTA TE : Tris EDTA MES : 2-morphlinoethanesulfonic acid PPT : L- Phosphinothricin AGPase : ADP-Glucose pyrophosphorylase MS : Murashige and Skoog Medium BSA : bovine serum albumin fraxtion BCIP/NBT : – Bromo – – Chloro – – idolyl phosphate, ptoluidine salt/Nitro Blue Tetrazolium SDS : sodium dodecyl sulfat Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Kết chọn lọc chuyển gen môi trƣờng chọn lọc 24 Bảng 2: Số dòng chuyển gen số gen chuyển thu đƣợc từ dịng ngơ 29 Bảng 3: Số lƣợng dòng chuyển gen theo khoảng thời gian gây nhiễm khác 30 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC HÌNH Hình 1: Một số enzyme quan trọng trình chuyển hóa sucrose thành tinh bột Hình 2: Cấu trúc chuyển gen pCambia2300-Ubi-Bt2; 15 Hình 3: Chuyển cấu trúc gen pCambia2300-Ubi-Bt2 vào mô phân sinh non số dịng ngơ………………………………………………………………23 Hình4: Kết tách DNA tổng số dịng ngơ sống sót sau chọn lọc chuyển gen………………… ……………………………………………… 25 Hình 5: Kết kiểm tra có mặt gen Bt2 số ngô chuyển gen PCR với mồi đặc hiệu 26 Hình 6: Kết kiểm tra có mặt gen Ubi số ngô chuyển gen PCR với mồi đặc hiệu 27 Hình 7: Kết kiểm tra Southern số dịng ngơ chuyển gen; 28 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu đề tài Nội dung nghiên cứu CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cƣơng ngô 1.2 Tinh bột gen điều khiển trình tổng hợp tinh bột 1.3 Các phƣơng pháp chuyển gen thƣờng sử dụng 1.3.1 Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens 1.3.2 Chuyển gen trực tiếp 10 1.4 Tình hình nghiên cứu chuyển gen ngô 11 1.4.1 Các nghiên cứu chuyển gen giới 11 1.4.2 Các nghiên cứu chuyển gen nƣớc 14 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Vật liệu hóa chất nghiên cứu 15 2.1.1 Vật liệu 15 2.1.2 Hóa chất 16 2.2.2 Đánh giá chuyển gen PCR 19 2.2.3 Đánh giá chuyển gen lai Southern 20 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 3.1 Chọn lọc dịng ngơ chuyển gen 23 3.2 Đánh giá chuyển gen PCR 25 3.3 Đánh giá chuyển gen lai Southern 28 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 4.1 Kết luận 32 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 4.2 Kiến nghị 32 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Ngô lƣơng thực đứng thứ hai giới sau lúa Nó đóng vai trị quan trọng đời sống ngƣời Không cung cấp lƣơng thực cho ngƣời, ngơ cịn đóng vai trị xóa đói giảm nghèo nhiều vùng kinh tế nƣớc ta Hiện dân số tăng cao dẫn đến áp lực lƣơng thực trở nên nóng hết Việc tăng suất trồng đặc biệt lƣơng thực nhƣ ngơ, lúa, lúa mì thách thức nhà chọn tạo giống trồng Hiện có hai phƣơng pháp chủ yếu để tăng suất trồng cải tiến phƣơng thức canh tác sử dụng giống dựa vào nỗ lực nhà chọn giống Cho đến nay, nhà chọn giống thƣờng nghiên cứu tạo giống theo hƣớng nhƣ: nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen, di truyền phân tử tính trạng quan tâm, chọn lọc nhờ thị phân tử công nghệ gen Cây ngô trồng thu hạt nên tăng suất chủ yếu phụ thuộc vào yếu tố nhƣ: chiều dài bắp, số lƣợng hạt, khối lƣợng hạt… Để ứng dụng công nghệ gen vào việc tăng suất ngô cần nghiên cứu trình liên quan suất ngơ nhƣ: q trình quang hợp, q trình tổng hợp tinh bột, hoạt động gen điều khiển trình tổng hợp sinh khối… Nhiều nghiên cứu hóa sinh phân tử làm sáng tỏ vai trò enzyme trình tổng hợp tinh bột Các nghiên cứu cho thấy ADPglucose pyrophosphorylase (AGPase) enzyme đóng vai trị chìa khóa q trình điều khiển tổng hợp tinh bột hạt ngũ cốc Enzyme AGPase có cấu trúc tứ phân gồm tiểu phần nhỏ đƣợc mã hóa gen Brittle (Bt2) tiểu phẩn lớn đƣợc mã hóa gen Shrunken (Sh2) Chuyển gen Sh2 Bt2 vào ngô hƣớng nghiên cứu nhằm tăng khả tổng hợp tinh bột, tăng suất trồng Ứng dụng công nghệ gen tiến hành nghiên cứu: Chuyển gen Bt2 vào số dịng ngơ trồng sử dụng mô phân sinh Agrobacterium tumefaciens Khi chuyển gen vào phôi ngô D’Halluin đồng tác giả [11] chọn đƣợc chuyển gen môi trƣờng chứa 200 mg/l kanamycin Kết tác giả cho thấy hầu hết tái sinh mang gen kháng kanamycin phát triển bình thƣờng mơi trƣờng chọn lọc chứa kanamycin, tái sinh không mang gen kháng kháng sinh chuyển sang màu trắng (bạch tạng) Đây sở cho chúng tơi chọn lựa mang gen chuyển nghiên cứu này, cấu trúc chuyển gen có chứa gen đích (Bt2) gen kháng kanamycin Sau 8-10 ngày nuôi cấy mơi trƣờng chọn lọc có chứa kháng sinh kanamycin, số sinh trƣởng phát triển bình thƣờng (Hình 3C), số thân chuyển từ màu xanh sang màu trắng (Hình 3D) Các có thân chuyển sang màu trắng kết luận không mang gen chuyển, ngƣợc lại sinh trƣởng phát triển bình thƣờng mơi trƣờng chọn lọc mang gen chuyển Bt2 Sau bình thƣờng rễ tốt, chúng đƣợc chuyển đất để tiếp tục chăm sóc (hình 3E) phân tích tiếp Các đƣợc xem nhƣ chuyển gen khởi đầu T0 Bảng 1: Kết chọn lọc chuyển gen mơi trường chọn lọc STT Dịng Số hạt Số Số Số Số Tỷ lệ phát ngơ thí hạt non phát triển bình bố nghiệm nảy gây mơi triển thƣờng (cây trƣờng bình chuyển gen) chọn thƣờng (%) mẹ mầm nhiễm lọc H95 500 495 490 490 37 7,55 H26 500 492 490 490 29 5,91 H240 500 494 490 490 12 2,44 H20 493 490 490 18 3,67 500 24 Chúng thu đƣợc chuyển gen T0 từ bốn dịng ngơ H20, H26, H95 H240 Kết bảng cho thấy tỷ lệ phát triển bình thƣờng (cây chuyển gen) môi trƣờng chọn lọc dao động từ 2,44 đến 7,55% Tỷ lệ cho chuyển gen cao 7,55% dịng ngơ H95, tỷ lệ thấp 2,44% dịng ngơ H240 Tỷ lệ thấp tỷ lệ 10% Li đồng tác giả (2010) thu đƣợc chọn lọc chuyển gen 0,1% glufosinate Sự khác kiểu gen ngô khác hai nghiên cứu 3.2 Đánh giá chuyển gen PCR 96 chuyển gen T0 chọn đƣợc môi trƣờng chứa 200 mg/l kanamycin đƣợc chuyển trồng nhà lƣới 82 sống sót (chiếm 85,42%) đƣợc tiến hành đánh số thứ tự từ dến 82 để thu mẫu tách chiết DNA tổng số Các DNA sau tách chiết đƣợc điện di gel agarose 1% M DNA tổng số Hình4: Kết tách DNA tổng số dịng ngơ sống sót sau chọn lọc chuyển gen.M: DNA marker kb 1-8: sống sót đƣợc đánh số từ đến 25 Các mẫu DNA sau tách chiết đƣợc điện di kiểm tra thu đƣợc băng vạch có kích thƣớc phù hợp, băng gọn, sử dụng để kiểm tra có mặt gen Bt2 PCR lai Southern DNA tổng số 82 T0 đƣợc PCR kiểm tra sử dụng cặp mồi đặc hiệu Bt2 DNA dòng T0 mang gen cho băng có kích thƣớc khoảng 1,5 kb sau điện di gel agarose 1% Hình kết điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu Bt2 dòng T0 Hình 5: Kết kiểm tra có mặt gen Bt2 số ngô chuyển gen PCR với mồi đặc hiệu M: DNA marker kb; 1: Đối chứng dƣơng (DNA plasmid); W: không chuyển gen; 3-14: ngô chuyển gen kiểm tra: 4, 5, 7, 10, 14 dịng chuyển gen có mang gen Bt2 từ H26 (4, 5), H95 (7, 10) H240 (14) Từ hình chúng tơi nhận thấy có số chuyển gen mang đoạn gen có kích thƣớc 1,5 kb phù hợp với kích thƣớc đoạn gen chuyển Sau đánh giá 82 chuyển gen đời T0 thu đƣợc 22 chuyển gen dƣơng tính Trong có 12 từ dòng H95, từ dòng H26, từ dịng H240 Khơng có từ dịng H20 cho kết dƣơng tính Qua chúng tơi nhận xét cho kết dƣơng tính sau kiểm tra PCR có mang gen Bt2 cần chuyển, cho kết âm tính khơng mang gen Bt2 Các dịng chọn lọc sinh trƣởng phát triển bình 26 thƣờng môi trƣờng chọn lọc nhƣng lại cho kết âm tính kiểm tra với cặp mồi đặc hiệu Bt2, Ubi Điều lý giải rằng: q trình chuyển gen vào mơ phân sinh, cấu trúc gen chuyển vào bị đứt gãy có đoạn gen kháng kháng sinh chọn lọc đƣợc chuyển vào cây, cịn đoạn gen đích khơng đƣợc chuyển vào Vì mà khơng mang gen mà có khả phát triển môi trƣờng chọn lọc DNA tổng số 82 T0 đƣợc tiếp tục kiểm tra có mặt gen Ubi PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu có trình tự nhƣ UbiF/UbiR promoter DNA dòng T0 mang gen sau PCR mồi đặc hiệu UbiF UbiR cho băng có kích thƣớc khồng kb sau điện di gel agarose 1% Hình kết điện di sản phẩm PCR DNA tổng số dòng T0 với cặp mồi đặc hiệu UbiF UbiR Hình 6: Kết kiểm tra có mặt gen Ubi số ngô chuyển gen PCR với mồi đặc hiệu M: DNA marker kb; 1: Đối chứng dƣơng (DNA plasmid); W: không chuyển gen; 3-14: ngô chuyển gen kiểm tra: 4, 5, 7, 10, 14 dịng chuyển gen có mang gen Bt2 từ H26 (4, 5), H95 (7, 10) H240 (14) Từ hình chúng tơi nhận thấy có số chuyển gen mang đoạn gen có kích thƣớc kb phù hợp với kích thƣớc đoạn gen chuyển Sau đánh giá 82 chuyển gen đời T0 thu đƣợc 22 chuyển gen 27 dƣơng tính So sánh kết đánh giá gen Bt2 Ubi, thấy 22 mang gen Bt2 mang gen Ubi Trong có 12 từ dịng H95, từ dòng H26, từ dòng H240 Khơng có từ dịng H20 cho kết dƣơng tính Qua chúng tơi nhận xét cho kết dƣơng tính sau kiểm tra PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu UbiF UbiR cho kết tƣơng đƣơng với sử dụng cặp mồi đặc hiệu Bt2F Bt2R Điều chứng tỏ có mặt vector chuyển gen gen đích chuyển gen T0 Các dƣơng tính nhận đƣợc sau kiểm tra gen Bt2 Ubi PCR đƣợc coi nhƣ dòng chuyển gen nghiên cứu 3.3 Đánh giá chuyển gen lai Southern 22 dịng T0 dƣơng tính sau kiểm tra gen Bt2 PCR đƣợc tiếp tục đánh giá lai Southern DNA tổng số dòng chuyển gen đƣợc cắt enzyme SacI, thấm truyền lên màng lai lai với đoạn gen Bt2 DNA tổng số đƣợc cắt enzyme SacI cho đoạn có kích thƣớc khác Đoạn DNA mang gen đƣợc nhận biết lai với đoạn gen Bt2 đƣợc gắn đầu dò phát màng lai Kết cho thấy dịng chuyển gen nghiên cứu có từ đến Hình kết lai Southern số dịng chuyển gen Trên hình thấy dịng số2 (từ H240) có sao, dịng số (từ H95) có dịng số (từ H26) có ba Hình 7: Kết kiểm tra Southern số dịng ngơ chuyển gen; Đối chứng âm (cây chƣa chuyển gen), – Các dòng chuyển gen từ H240 (2), H95 (3,4) H26 (5) 28 Từ 22 dịng T0 dƣơng tính sau phân tích gen Bt2 PCR, sau kiểm tra lai Southern nhận đƣợc 17 dòng chuyển gen từ dịng ngơ bố mẹ H26, H95 H240 mang gen Bt2 Số lƣợng chuyển gen số gen chuyển đƣợc trình bầy bảng Bảng 2: Số dòng chuyển gen số gen chuyển thu đƣợc từ dịng ngơ Số Số dịng mang gen Bt2 dịng ngơ bố mẹ gen H26 H95 H240 3 3 10 1,22 2,04 0,20 Tổng Hiệu suất chuyển gen (%)* *Hiệu suất chuyển gen tính tỷ lệ chuyển gen mang gen Bt2 nhận từ dòng sau kiểm tra Southern số non xử lý chuyển gen dịng Qua bảng thấy dịng chuyển gen có gen chuyển, dịng có dịng có Số dịng chuyển gen nhận đƣợc dao động từ đến 10 dòng H95 có 10 dịng mang gen chuyển chiếm 2,04%; dịng H26 có dịng mang gen chuyển chiếm 1,22%; dịng H240 có dịng mang gen chuyển chiếm 0,2% Kết nhận đƣợc cho thấy dịng ngơ H95 cho hiệu suất chuyển gen cao so với dòng ngô nghiên cứu khác So sánh hiệu suất chuyển gen nghiên cứu so với nghiên cứu khác giới nhận thấy kết nghiên cứu chƣa cao Với đối tƣợng nghiên cứu mô phân sinh: Li N cộng có hiệu suất chuyển gen 10% Đối tƣợng nghiên cứu phơi non: Ombori cộng có hiệu suất chuyển 29 gen 1.4%; Vega cộng sự: 12% - 18%; Ishida cộng sự: 50% A188, 15% A634, H99 W117 Kết đánh giá có mặt gen Bt2 dịng ngơ PCR lai Southern cho thấy thời gian gây nhiễm tốt cho chuyển gen vào dịng ngơ sử dụng mô phân sinh A tumefaciens 16 (Bảng 3) Ở thời gian gây nhiễm không nhận đƣợc chuyển gen Bảng 3: Số lƣợng dòng chuyển gen theo khoảng thời gian gây nhiễm khác STT Thời gian gây nhiễm (giờ) 16 Số mơ phân Dịng ngơ sinh xử lý (mơ) Số dịng mang gen Tỷ lệ (%) H26 166 0 H240 165 0 H95 165 0 H20 166 0 H26 166 1,2 H240 166 0 H95 165 1,82 H20 166 0 H26 166 2,41 H240 166 0,6 H95 165 4,24 H20 166 0 Từ kết nhận đƣợc thấy chuyển gen vào ngô sử dụng mô phân sinh vi khuẩn A tumefaciens hoàn toàn khả thi Thời gian tạo chuyển gen khoảng tháng tiến hành khơng phụ thuộc vào mùa vụ Trong cơng trình này, mơ phân sinh từ non – 30 ngày tuổi đƣợc sử dụng, chuyển gen đƣợc chọn lọc hai tuần: tuần đầu môi trƣờng chứa 100 mg/l kanamycin, tuần thứ hai mơi trƣờng có 200 mg/l kanamycin chọn hồn tồn bình thƣờng cho kết tốt Tuy nhiên, để có hiệu cao hơn, cần có nghiên cứu nhằm cải tiến phƣơng pháp với việc sử dụng chủng A tumefaciens kiểu gen ngô khác kết hợp với tối ƣu hóa thời gian đồng ni cấy, kích thƣớc mơ phân sinh việc chọn lọc ban đầu chuyển gen để tránh tƣợng khảm 31 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu chuyển gen đánh giá có mặt gen Bt2 dịng chuyển gen chúng tơi đƣa kết luận sau: Đã thu đƣợc dòng mang gen Bt2 chứng minh đƣợc có mặt gen Bt2 17 dịng ngơ chuyển gen, 10 dòng từ dòng H95, dòng từ dòng H26 dịng từ dịng H240 Các dịng ngơ chuyển gen có từ đến gen Dịng H95 cho hiệu suất chuyển gen cao Đã xác định đƣợc thời gian gây nhiễm mơ phân sinh dịng ngơ với A tumefaciens mang gen đích 16 Kết thu đƣợc nghiên cứu góp phần quan trọng nghiên cứu chuyển gen tổng hợp tinh bột vào dịng ngơ 4.2 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu để xây dựng đƣợc quy trình chuyển gen vào ngơ cho hiệu chuyển gen cao hơn, áp dụng đƣợc cho tất gen cần chuyển 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Văn Đồng, Phạm Thị Lý Thu, Lê Thị Mai Hƣơng, Phạm Thị Hƣơng, Lê Thị Lan, Nguyễn Chiến Hữu, Nguyễn Hữu Kiên, Trần Duy Hƣng, Lê Huy Hàm (2015) Nghiên cứu chuyển gien chịu hạn NF-YB2 vào số dòng ngô Việt Nam TC Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn 7: 25-30 Hồ Thị Hƣơng, Nguyễn Đức Thành (2014) Thiết kế vector chuyển gen mang gen Brittle (Bt2) mã hóa cho ADP-Glucose pyrophosphorylase – enzyme điều hịa q trình tổng hợp tinh bột Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 12(2):1-6 Phạm Lý Thu (2007) Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non xác định phƣơng pháp chuyển gen thích hợp ngơ Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, 2007 Đinh Văn Trình, Phạm Thị Lý Thu, Lê Thị Thu Về, Nguyễn, Văn Toàn, Nguyễn Văn Đồng (2009) Nghiên cứu chuyển gen nguyên ngô TC Công nghệ Sinh học 2: 221-227 Tiếng Anh Ahmadabadi M, Ruf S, & Bock R (2007) A leaf-based regeneration and transformation system for maize (Zea mays L) Trans Res 16(4): 437-448 Anami SE, Mgutu AJ, Taracha C, Coussens G, Karimi M, Hilson P, Lijsebettens M.V, Machuka J (2010) Somatic embryogenesis and plant regeneration of tropical maize genotypes, Plant Cell Tiss Organ 102:285-295 Bhave MR, Lawrence S, Barton C, and Hannah LC, (1990) Identification and molecular characterization of Shrunken-2 cDNA clones of maize Plant cell, (6): 581-588 Cobb BG, and Hannah LC, (1998) Shrunken-1 encoded sucrose synthase is not required for sucrose synthesis in the maize endosperm1 Plant Physiol., 88: 1219-1221 Denyer K, Dunlap F, Thorbjrnsen T, Keeling P, and Smith AM, (1996) The major form of ADP-Glucose pyrophosphorylase in maize endosperm 1s extra-plastidial Plant Physiol., 112 (2): 779-785 10 Dickinson DB, Preiss J, (1969) Presence of ADP-Glucose Pyrophosphorylase in Shrunken-2 and Brittle-2 Mutants of maize endosperm Plant Physiol 44 (7) 1058 – 1062 11 D’Halluin K, Bonne E, Bossut M, Beuckeleer MD, Leemans J (1992) Transgenic maize plants by tissue electroporation Plant Cell 4:14951505 12 Figueiredo DA, Sine LF, Chantereau B, Mestres J, Fliedel C, Rami G, Courtois JF (2010) Variability of grain quality in sorghum: association with polymorphism in Sh2, Bt2, SssI, Ae1, Wx and O2 Theo Appl Genet., 121, 1171-1185 13 Frame BR, Shou H, Chikwamba R, Zhang Z, Xiang C, Fonger T, Pegg SE, Li B, Nettleton D, Pei P, Wang K (2002) Agrobacterium-mediated transformation of maize embryos using a standard binary vector system Plant Physiol 129: 13-22 14 Frame BR, McMurray JM, Fonger TN, Main ML, Taylor KW, Torney FJ, Paz MM., Wang K (2006) Improved Agrobacterium-mediated transformation of three maize inbred lines using MS salts Plant Cell Rep 25(10):1024-1034 15 Giroux MJ, Hannah LC (1994) ADP-glucose pyrophosphorylase in shrunken-2 and brittle-2 mutants of maize Mol Gen Genet 243: 400–408 16 Gordon JW, Scangos GA, Plotkin DJ, Barbosa JA, Ruddle FH (1980) Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA Proc Natl Acad Sci USA 77(12):7380-4 17 Hannah LC, Shaw JR, Giroux MJ, Reyss A, Prioul JL, Bae JM, Lee JY (2001) Maize genes encoding the small subunit of ADP-glucose pyrophosphorylase Plant Physiol 127: 173–183 18 Hannah LC (2005) Starch synthesis in the maize endosperm Maydica 50: 497–506 19 Hannah LC, Futch B, Bing J, Shaw JR, Boehlein S, Stewart JD, Beiriger R, Georgelis N, and Greene T (2012) A shrunken-2 transgene increases maize yield by acting in maternal tissues to increase the frequency of Seed development Plant Cell 24 (6): 2352 – 63 20 Huang B, Chen J, Zhang J, Liu H, Tian M, Gu Y, Hu Y, Li Y, Liu Y and Huang Y (2011) Characterization of ADP-Glucose pyrophosphorylase encoding genes in source and sink organs of maize Plant Mol Biol Rep, 29:563 – 572 21 Ishida Y, Hiei Y, Komari T (2007) Agrobacteium-mediated transformation of maize Nature Protocol l.2 (7):1614-1621 22 James MG, Denyer K, and Myers AM, (2003) Starch synthesis in the cereal endosperm Plant Biol 6: 215–222 23 Joersbo M, Brunstedt J (1990) Direct gene transfer to plant protoplasts by mild sonication Plant Cell Rep 9: 207–210 24 Li N, Zhang S, Zhao Y, Li B, Zhang J (2011) Over-expression of AGPase genes enhances seed weight and starch content in transgenic maize Planta 233:241-250 25 Luo ZX, WuR (1989) A simple methods for the transformation of rice via the pollen-tubepathway Plant Mol boil Reporter 7: 69-77 26 Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with T0 bacco tissue cultures Plant Physiol 15: 473-479 27 Ombori O, Muoma JVO, Machuka J (2012) Agrobacterium- mediated genetic transformation of selected tropical inbred and hybrid maize (Zea mays L.) lines Plant Cell Tiss Org DOI 10.1007/s11240-012-0247-1 28 Prioul J Ll, Jeannette E, Reyss A, Grégory N, Giroux M, Hannah LC, and Causse M (1994) Expression of ADP-glucose pyrophosphorylase in maize (Zea mays L.) grain and source leaf during grain filling Plant Physiol 104 (1): 179 – 187 29 Russell DA, DeBoer DL, Stark DM, Preiss J, Fromm ME (1993) Plastid targeting of β-glucuronidase and ADP-glucose pyrophosphorylase in maize (Zea mays L.) cells Plant Cell Rep 13: 287–292 30 Saghai-Maroof MA, Soliman KM, Jorgensen RA, Allard RW (1984) Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics Proc Natl Acad Sci USA 81: 8014-8018 31 Sairam RV, Parani M, Franklin G, Lifeng Z, Smith B, MacDougall J, Wilber C, Sheikhi H, Kashikar N, Meeker K, Al-Abed D, Berry K, Vierling R, Goldman SL (2003) Shoot meristem: an ideal explant for Zea mays L transformation Genome 46:323–329 32 substances Sanford JC, Klein TM, Wolf ED, Allen N (1987) "Delivery of into cells and tissues using a particle bombardment process" Particulate Science and Technology (1): 27–37 33 Schell J; Montagu MV (1977) "The Ti-plasmid of Agrobacterium tumefaciens, a natural vector for the introduction of nif genes in plants?" Basic Life Sci 9: 159–79 34 Sidorov V, Gilbertson L, Addae P, Duncan D (2006) Agrobacterium-mediated transformation of seedling-derived maize callus Plant Cell Rep 25: 320-328 35 Takava S, Rahnama H, Rahimian H, and Kazemitabar K (2010) Agrobacterium-mediated transformation of maize (Zea mays L.) Journal of Sciences, Islamic Republic of Iran 21(1): 21-29 36 Tsai CY and Nelson OE (1966) Starch-deficient maize mutant lacking adenosine diphosphate glucose pyrophosphorylase activity Science 151: 341 – 343 37 Vega JM, Yu W, Kennon AR, Chen X, Zhang ZJ (2008) Improvement of Agrobacterium-mediated transformation in Hi-II maize (Zea mays L.) using standard binary vectors Plant Cell Rep 27: 297-305 38 Wang Z, Chen X, Wang J, Liu T, Liu Y, Zhao L, Wang G (2007) Inreasing maize seed weight by enhancing the cytoplasmic ADP-glucose pyrophosphorylase activity in transgenic maize plants Plant Cell Tiss Org 88: 83-92 39 Wang TT, Ji J, Wang G, Guan CF, Zhang L, Jin C (2012) Study on Agrobacterium-mediated transformation of psy gene into shoot meristem of maize China Biol 32(8): 36-40 CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN Nguyễn Đức Thành, Trần Thị Lƣơng, Nguyễn Thùy Ninh, Nguyễn Thị Thu, Hồ Thị Hƣơng, Vƣơng Huy Minh (2015) Tạo ngô (Zea mays L.) chuyển gen gia tăng hàm lƣợng tinh bột suất TC Sinh học học 37(4): 496-502 Nguyễn Thị Thu, Nguyễn Thùy Ninh, Trần Thị Lƣơng, Nguyễn Đức Thành (2014) chuyển gen Bt2 vào mơ phân sinh số dịng ngơ trồng thơng qua Agrobacterium tumefaciens Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 12(4): 691-698 Trần Thị Lƣơng, Nguyễn Thị Thu, Nguyễn Thùy Ninh, Nguyễn Đức Thành (2014) Chuyển gen Shrunken 2(Sh2) mã hóa enzyme ADP-Glucose pyrophosphorase vào số dịng ngơ phƣơng pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens Tạp chí Sinh học, 36(1): 99-109 Nguyễn Thị Thu, Lê Hồng Đức, Nguyễn Đức Thành (2013) Tách dịng gen Shrunken (Sh2) từ dịng ngơ H14 thiết kế vector chuyển gen pCambia 1301-Ubi-Sh2.Tạp chí sinh học 35 (3se): 122 – 128 ... HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT  NGUYỄN THỊ THU CHUYỂN GEN BT2 VÀO MỘT SỐ DÕNG NGÔ TRỒNG BẰNG SỬ DỤNG MÔ PHÂN SINH VÀ AGROBACTERIUM TUMEFACIENS NGÀNH: SINH. .. trồng Ứng dụng công nghệ gen tiến hành nghiên cứu: Chuyển gen Bt2 vào số dịng ngơ trồng sử dụng mơ phân sinh Agrobacterium tumefaciens Mục tiêu nghiên cứu đề tài Chuyển vector mang gen Bt2 vào dịng... trình chuyển gen vào mơ phân sinh, cấu trúc gen chuyển vào bị đứt gãy có đoạn gen kháng kháng sinh chọn lọc đƣợc chuyển vào cây, cịn đoạn gen đích khơng đƣợc chuyển vào Vì mà khơng mang gen mà