Các enzyme dùng trong dna tái tổ hợp

seminar Các enzyme dùng trong DNA tái tổ hợp: Enzyme cắt hạn chế, Enzyme gắn, Enzyme trùng hợp, Phương pháp cắt DNA bằng enzyme hạn chế A, Thành phần cho tổng thể tích 20

NGUYỄN HOÀNG LỘC SVTH:

Trịnh Thị Mỹ Uyên

Lê Bình Phương

Phan Thanh Bảo Phước

Các enzyme dùng trong tạo dòng phân tử

I Các enzyme hạn chế

Type I Type II Type III

+ Cắt trong trình tự nhận biết

+ Chỉ cần Đặc Hiệu

+ Vị trí cắt cách vị trí nhận biết lớn

( khoảng 20-30 Base)

+ Cần và ATP Không đặc Hiệu

2 Gắn các đầu tận cùng được cắt bởi enzyme hạn chế

+ terminal transferase

Enzyme này sẽ tạo ở đầu 3’ của DNA sợi đôi một homopolymer

3 Isochizomer

- MboI và Sau3AI cùng nhận biết trình tự:

- Trong khi đó BamHI nhận biết trình tự:

Nhận biết trình tự 4 nucleotide nằm trong trình tự 6

+ SalI cắt trình tự (G TCGAC)

+ XhoI cắt trình tự (C TCGAG)

4 Methyl hóa

+ dam (DNA adenine methylase)

+ dcm (DNA cystosine methylase)

5 Cắt DNA bằng enzyme hạn chế

5.1 Các loại đệm dùng trong phản ứng cắt DNA

Riêng SmaI sử dụng loại đệm riêng

5.2 Phương pháp cắt DNA bằng enzyme hạn chế

Ta bổ sung 0,5M EDTA ( pH 7,5) để đạt tới nồng độ cuối cùng là 10mM

+ Kiểm tra phản ứng cắt bằng phương pháp chạy điện di

+ Tinh sạch DNA sau khi cắt bằng phenol, Phenol : chloroform, chloroform và kết tủa DNA lại bằng 2 lần thể tích ethanol hoặc 1 lần thể tích của isopropanol

hạn chế hạn chế

hạn chế hạn chế

II Các enzyme trùng hợp

1 DNA polymerase (DNA-dependent DNA polymerase)

1.1 DNA polymerase I của E coli

1.2 Đoạn Klenow của DNA polymerase I của E

coli

1.3 DNA polymerase của bacteriophage T4

1.4 Taq DNA polymerase

1.1 DNA polymerase I của E coli

Hoạt tính polymerase 5’-3’

Hoạt tính exonuclease 3’-5’

Hoạt tính exonuclease 5’-3’

1.2 Đoạn Klenow của DNA polymerase I của E coli

Đánh dấu đầu 3’ được làm đầy

Đánh dấu DNA mang đầu lồi 3’

1.3 DNA polymerase của bacteriophage T4 ( Nó là sản phẩm của gen 43 của bacteriophage T4, và do đó thường được gọi là DNA Polymerase T4 gp43)+ Hoạt tính mạnh ( gấp 200 lần DNA polymerase I) Không cần mồi.

1.4 Taq DNA polymerase

vi khuẩn Thermus aquaticus

Ưu Điểm Nhược điểm

+ Sản xuất đoạn gen mang 2

đầu lồi A thích hợp cho tạo

dòng

+ Chịu nhiệt cao

+ Không có cơ chế đọc sửa

Tạo ra khoảng 16% sản phẩm lỗi

Một số enzyme có thể thay thế:

+ Pfu DNA polymerase (Pfu pol) được tách chiết từ Pyrococcus furiosus + Tth DNA polymerase (Tth pol), được tách chiết từ Thermus thermophilus

2 RNA polymerase (DNA-dependent RNA polymerase)

3 Enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase, RNA-dependent DNA polymerase)

Hoạt tính polymerase 5’-3’

Hoạt tính Rnase H

4 Terminal transferase

Ứng dụng

Ứng dụng

III, Các enzyme gắn.

4 Alkaline phosphatase

1 Bacteriophage T4 DNA ligase

2 Bacteriophage T4 RNA ligase

3 Bacteriophage T4 polynucleotide kinase

Ứng dụng

Đánh dấu đầu 5’ của DNA để phân tích trình tự ( Maxam

và Gilbert)

Phosphoryl hóa mồi và đoạn DNA không có nhóm 5’

phosphate ( chuẩn bị cho tạo dòng

4 Alkaline phosphatase

IV Các enzyme phân cắt

4 Ribonuclease (RNase A )

1 Deoxyribonuclease I (DNase I)- Tụy bò.

Tạo các dòng ngẫu nhiên

2 Nuclease S1

Ứng dụng:

Tạo cấu trúc sợi đơn trên 1 số vùng DNA ( làm cơ chất cho đoạn klenow)

Tạo các đột biến khuyết đoạn ( ở vị trí tận cùng của DNA sợi đôi mạch

thẳng)

4 Ribonuclease (RNase A)

V, Các Protein liên kết với protein sợi đơn.

Ứng dụng

Phát sinh đột biến điểm trược tiếp ( gồm D-loops)

Tăng chiều dài khuôn mẫu

Kích thích DNA polymerase đặc hiệu trong phân tích trình tự DNA