Nghiên cứu kỹ thuật chọn tạo giống chuối tiêu mới từ nguồn nhập nội

1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM VIỆN KHOA HỌC SỰ SỐNG BÁO CÁO KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG MÃ SỐ : T2013 – 26UT NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT CHỌN TẠO GIỐNG CHUỐI TIÊU MỚI TỪ NGUỒN NHẬP NỘI Chủ trì đề tài: ThS Đào Duy Hưng THÁI NGUYÊN, 2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM VIỆN KHOA HỌC SỰ SỐNG BÁO CÁO KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG MÃ SỐ : T2013 – 26UT NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT CHỌN TẠO GIỐNG CHUỐI TIÊU MỚI TỪ NGUỒN NHẬP NỘI Chủ trì đề tài : ThS Đào Duy Hưng Những người tham gia : ThS Lê Thị Hảo KS Nguyễn Hương Xiêm Thời gian thực : Từ tháng 01/2013 đến tháng 12/2013 Địa điểm nghiên cứu : Khu Công nghệ Tế bào Viện Khoa học Sự sống Đại học Nông Lâm Thái Nguyên THÁI NGUYÊN, 2013 TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ - Tên đề tài: “Nghiên cứu kỹ thuật chọn tạo giống chuối tiêu từ nguồn nhập nội” – Mã số: T2013 – 26UT – Chủ nhiệm đề tài: ThS Đào Duy Hưng – Tel.: 0978131645 E-mail: duyhungtn09@gmail.com – Cơ quan chủ trì đề tài: Đại học Nơng Lâm Thái Nguyên – Cơ quan cá nhân phối hợp thực hiện: – Thời gian thực hiện: Tháng 01/ 2013 đến tháng 12/2013 Mục tiêu: - Xây dựng thành cơng quy trình nhân giống chuối tiêu nhập nội công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật nước - Xây dựng vườn mẹ giống chuối tiêu làm nguồn vật liệu Nội dung chính: - Nội dung 1: Nghiên cứu kỹ thuật vào mẫu tái sinh chồi giống chuối tiêu từ chồi sinh trưởng tự nhiên - Nội dung 2: Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh cụm chồi giống chuối tiêu - Nội dung 3: Nghiên cứu kỹ thuật rễ cho chồi nuôi cấy để tạo chuối hồn chỉnh phòng thí nghiệm - Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng giá thể đến thích ứng chuối tiêu in vitro ngồi điều kiện tự nhiên - Nội dung 5: Xây dựng vườn mẹ giống chuối tiêu làm nguồn vật liệu Kết đạt (khoa học, ứng dụng, đào tạo, kinh tế – xã hội, v.v…) 3.1 Kết nghiên cứu Khử trùng mẫu HgCl2 nồng độ 0,1% thời gian 15 phút hiệu cho mục đích tạo vật liệu khởi đầu chuối tiêu nuôi cấy mô Môi trường MS có bổ sung saccharose 30g/l; inositol 100 mg/l; agar 6,8 g/l BAP mg/l; pH = 5,8 thích hợp cho mục đích tái sinh chồi chuối tiêu in vitro Mơi trường MS có bổ sung saccharose 30g/l; inositol 100 mg/l; agar 6,8 g/l; BAP mg/l IAA 0,3 mg/l; pH = 5,8 thích hợp cho nhân nhanh chồi chuối tiêu in vitro Môi trường 1/2MS có bổ sung saccharose 30g/l; inositol 100 mg/l; agar 6,8 g/l NAA 0,6 mg/l; pH= 5,8 thích hợp cho tạo hoàn chỉnh chồi chuối tiêu in vitro Giá thể: đất phù sa + trấu hun (4:1) giá thể thích hợp cho chuối tiêu nuôi cấy mô sinh trưởng phát triển ngồi vườn ươm Đã xây dựng thành cơng vườn đầu dòng chuối tiêu 3.2 Kết khoa học - 01 báo khoa học 3.3 Kết ứng dụng - 01 quy trình nhân giống chuối tiêu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào - 2000 chuối tiêu nhân phương pháp nuôi mô tế bào - Vườn đầu dòng cho giống chuối tiêu gồm 500 gốc Viện Khoa học Sự sống SUMMARY - Research Project Title: Technical study of selection a new aromatic banana from imported source - Code number: T2013 – 26UT - Coordinator: Dao Duy Hung (MSC) - Implementing Institution: Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry - Cooperating Institution(s): - Duration: from 01/2013 to 12/2013 Objectives: - The study Success propagation techniques by tissue culture - Construction mom anewly imported banana plantations as a source of material Main contents: - Content 1: Research aseptic technique and shoot regeneration from banana bud growth targets in the wild - Content 2: Study techniques breeding anewly introduced banana pepper buds - Content 3: Research techniques for rooting shoots cultured banana plants to complete in the lab - Content 4: Research affect of growing medium adaptation to in vitro anewly imported banana tree outside natural conditions - Content 5: Construction mom anewly imported banana plantations as a source of material Results obtained: 3.1 Results research The sterylity of culture samples with HgCl2(0,1%) in 15 minutes is the most effective material for the purpose of starting a new plant tissue culture banana Culture medium MS being suitable for bulb formation was basis medium (saccharose 30g/l; inositol 100 mg/l; agar 6,8 g/l; pH =5,8) added BAP (4 mg/l) is appropriate bud of anewly imported banana in vitro Culture medium MS being suitable for bulb formation was basis medium (saccharose 30g/l; inositol 100 mg/l; agar 6,8 g/l; pH =5,8) added BAP (4mg/l) and IAA (0,3 mg/l) is appropriate breeding plant tissue culture banana in vitro Culture medium 1/2MS added : 30g/l; inositol 100 mg/l; agar 6,8 g/l; pH= 5,8 and NAA 0,6 mg/l is appropriate for rooting shoots cultured banana to complete in vitro Growing medium: alluvial soil + rice husk smoked mixed rate( 4: 1) is appropriate for growth of anewly imported banana in vitro in nursery Has successfully built mother garden anewly imported bananas 3.2 Results science - 01 article science 3.3 Results to apply - 01 process plant propagation techniques anewly imported banana by tissue culture - 2000 trees anewly imported banana by tissue culture - Gardens mom anewly imported banana to source of material include 500 trees in Institute of Life Scienes MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung chuối 1.1.1 Nguồn gốc phân loại chuối 1.1.1.1 Nguồn gốc 1.1.1.2 Phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật học 1.1.2.1 Rễ 1.1.2.2 Thân thật .5 1.1.2.3 Thân giả 1.1.2.4 Hoa chuối 1.1.3 Giá trị dinh dưỡng .6 1.1.3.1 Bộ phận dùng tiêu chuẩn chất lượng 10 1.1.3.2 Giá trị 11 1.2 Tình hình nghiên cứu chuối .7 1.2.1 Tình hình nghiên cứu biện pháp kỹ thuật nhân giống chuối giới 1.2.2 Tình hình nghiên cứu biện pháp kỹ thuật nhân giống chuối Việt Nam 1.2 Khái quát nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.1 Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.2 Tầm quan trọng nuôi cấy mô tế bào thực vật .11 1.2.3 Cơ sở khoa học phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 12 1.2.4 Các yếu tôt ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật 13 1.2.4.1 Lựa chọn mẫu cấy 13 1.2.4.2 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy 14 1.2.4.3 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy .18 CHƯƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .20 2.1 Vật liệu, địa điểm thời gian nghiên cứu 20 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 20 2.1.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu .20 2.2 Nội dung phương pháp nghiên cứu .20 2.2.1 Nội dung nghiên cứu 20 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.2.1 Nội dung 1: Nghiên cứu kỹ thuật vào mẫu tái sinh chồi giống chuối tiêu từ chồi sinh trưởng tự nhiên 21 2.2.2.2 Nội dung 2: Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh cụm chồi giống chuối tiêu 24 2.2.2.3 Nội dung 3: Nghiên cứu kỹ thuật rễ cho chồi nuôi cấy để tạo chuối hồn chỉnh phòng thí nghiệm 26 2.2.2.4 Nội dung 4: Nghiên cứu kỹ thuật luyện cây, cấy bầu chăm sóc vườn ươm trước xuất vườn 28 2.2.2.5 Nội dung 5: Xây dựng vườn đầu dòng giống chuối tiêu .29 2.2.3 Xử lý số liệu .29 2.2.4 Điều kiện thí nghiệm 29 2.2.4.1 Thí nghiệm in vitro .29 2.2.4.2 Thí nghiệm thích ứng in vitro điều kiện tự nhiên 30 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Kết nghiên cứu vào mẫu tái sinh chồi giống chuối tiêu từ chồi sinh trưởng tự nhiên .31 3.1.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng H202 20% đến khả vô trùng mẫu 31 3.1.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng HgCl2 0,1% đến khả vô trùng mẫu 32 3.1.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh chồi 33 3.1.4 Kết nghiên cứu ảnh hưởng Kinetin đến khả tái sinh chồi 34 3.2 Kết nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh cụm chồi giống chuối tiêu .35 3.2.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng BAP đến hiệu nhân chồi 35 3.2.2 Kết nghiên cứu cứu ảnh hưởng kết hợp BAP IAA đến hiệu nhân chồi .36 3.2.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp BAP IBA đến hiệu nhân chồi 37 3.3 Kết nghiên cứu kỹ thuật rễ cho chồi nuôi cấy để tạo chuối hồn chỉnh phòng thí nghiệm 38 3.3.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng NAA đến hiệu rễ chồi chuối tiêu 38 3.3.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng IBA đến hiệu rễ chồi chuối tiêu 39 3.4 Kết nghiên cứu kỹ thuật luyện cây, cấy bầu chăm sóc vườn ươm trước xuất vườn .40 3.5 Kết xây dựng vườn đầu dòng giống chuối tiêu .41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 10 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT BAP 6-benzylaminopurine CT Công thức ĐC Đối chứng Kinetin furfurylaminopurine MS Murashinge and Skoog, 1962 NAA Naphlene acetic acid TN Thí nghiệm IBA Indole – – butyric acid IAA Indole-3-acetic acid GA3 Gibberellin 69 ẢNH HƯỞNG CỦA IBA ĐẾN HIỆU QUẢ RA RỄ CHỒI CHUỐI TIÊU MỚI IN VITRO BALANCED ANOVA FOR VARIATE SRTB/C FILE RR 1/11/** 15:26 PAGE VARIATE V003 SRTB/C LN SOURCE OF VARIATION DF LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= T 86.0190 17.2038 ****** 0.000 R 103333 516666E-01 5.01 0.031 * RESIDUAL 10 103137 103137E-01 * TOTAL (CORRECTED) 17 86.2254 5.07209 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLCRR FILE RR 1/11/** 15:26 PAGE VARIATE V004 TLCRR SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= T 10567.5 2113.50 89.66 0.000 R 8.64321 4.32160 0.18 0.836 * RESIDUAL 10 235.734 23.5734 * TOTAL (CORRECTED) 17 10811.9 635.992 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE RR 1/11/** 15:26 PAGE MEANS FOR EFFECT T T NOS 3 3 3 SRTB/C 0.500000 2.25667 3.30000 5.25667 6.41333 6.34333 TLCRR 32.2233 75.5567 87.7767 100.000 100.000 100.000 SE(N= 3) 0.586337E-01 2.80318 5%LSD 10DF 0.184757 8.83291 MEANS FOR EFFECT R R NOS 6 SRTB/C 3.91167 4.02833 4.09500 TLCRR 82.7783 83.3333 81.6667 SE(N= 6) 0.414603E-01 1.98215 5%LSD 10DF 0.130643 6.24581 -ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE RR 1/11/** 15:26 PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE SRTB/C TLCRR ‘ GRAND MEAN (N= 18) NO OBS 18 4.0117 18 82.593 STANDARD DEVIATION C OF V |T SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 2.2521 0.10156 2.5 0.0000 25.219 4.8552 5.9 0.0000 |R | | | 0.0309 0.8360 | | | | 70 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC LOẠI GIÁ THỂ ĐẾN KHẢ NĂNG THÍCH NGHI CỦA CÂY CHUỐI MỚI TRONG ĐIỀU KIỆN VƯỜN ƯƠM BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLCS FILE RR 1/11/** 15:32 PAGE VARIATE V003 TLCS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= T 179.167 59.7222 4.47 0.057 R 28.1250 14.0625 1.05 0.407 * RESIDUAL 80.2083 13.3681 * TOTAL (CORRECTED) 11 287.500 26.1364 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CCTBC FILE RR 1/11/** 15:32 PAGE VARIATE V004 CCTBC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= T 8.16909 2.72303 125.50 0.000 R 325500E-01 162750E-01 0.75 0.515 * RESIDUAL 130182 216971E-01 * TOTAL (CORRECTED) 11 8.33183 757439 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE RR 1/11/** 15:32 PAGE MEANS FOR EFFECT T T NOS 3 3 TLCS 80.8333 81.6667 90.0000 87.5000 CCTBC 4.27000 6.55000 5.38333 5.80667 SE(N= 3) 2.11093 0.850433E-01 5%LSD 6DF 7.30204 0.294178 MEANS FOR EFFECT R R NOS 4 TLCS 83.1250 85.0000 86.8750 CCTBC 5.56750 5.50000 5.44000 SE(N= 4) 1.82812 0.736496E-01 5%LSD 6DF 6.32375 0.254766 -ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE RR 1/11/** 15:32 PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TLCS CCTBC GRAND MEAN (N= 12) NO OBS 12 85.000 12 5.5025 STANDARD DEVIATION C OF V |T SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 5.1124 3.6562 4.3 0.0571 0.87031 0.14730 2.7 0.0001 |R | | | 0.4075 0.5148 | | | | 71 VIỆN KHOA HỌC SỰ SỐNG Bộ môn Công nghệ tế bào ĐÀO DUY HƯNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG CÂY CHUỐI TIÊU NHẬP NỘI BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THÁI NGUYÊN, THÁNG 12- 2013 72 QUY TRÌNH KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG CÂY CHUỐI TIÊU NHẬP NỘI BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO Người biên soạn: Đào Duy Hưng SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY CHUỐI TIÊU NHẬP NỘI BẰNG PHƯƠNG PHÁP NI CẤY MƠ Dòng tuyển chọn ↓ Chọn bố mẹ có suất cao, chất lượng tốt Dẫn dòng ↓ Cắt, tách chồi đỉnh, mầm ngủ Khử trùng mẫu ↓ Hóa chất dạng dung dịch HgCl2 H2O2 Tạo chồi ban đầu ↓ Xác định mơi trường tái sinh thích hợp Nhân nhanh chồi ↓ Xác định môi trường nhân nhanh cho hệ số nhân cao Tạo rễ ↓ Xác định môi trường phương pháp rễ hiệu Vườn ươm 73 Phạm vi áp dụng Quy trình áp dụng cho sở nuôi cấy mô tế bào thực vật, ứng dụng Bộ môn Công nghệ Tế bào - Viện Khoa Học Sự Sống – Đại học Thái Nguyên Dùng để nhân nhanh giống chuối tiêu nhập nội bệnh với số lượng lớn thời gian ngắn nhằm cung cấp chuối tiêu nhập nội giống chất lượng cao với số lượng theo yêu cầu Tài liệu viện dẫn 2.1 Tiếng Việt Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, Nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật-Nghiên cứu ứng dụng, Nhà xuất Nông Ngiệp, Hà Nội Vũ Văn Vụ (1999), Sinh lý thực vật ứng dụng, Nhà xuất Giáo Dục, Hà Nội Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tuấn (1999), Sinh lý thực vật, Nhà xuất Giáo Dục, Hà Nội 2.2 Tiếng Anh Murashige T and Skoog F (1962), “A resied medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures”, Physiol Plant (15), pp 473495 George, E.F.(1993) Plant Propagation by Tissue Culture, 2nd Ed Exegetics Limited, pp 441 Haiyan Yu (2002), Reserch on ABT and GGR International Application and Cooperation, China Forestry Publishing House, Beijing Overbeek J van et al (1944) Coconut Milk used for growth and development of very young Datura embryos, Science, 94, pp 350-351 Định nghĩa Nhân giống in vitro phương pháp sử dụng tế bào, mô quan tế bào thực vật nuôi mơi trường dinh dưỡng thích hợp điều kiện vơ trùng phòng thí nghiệm để tái tạo thể thực vật với số lượng lớn thời gian ngắn từ thể bố mẹ Nguyên tắc 4.1 Tính tồn tế bào thực vật Theo Haberlandt (1902) tính tồn tế bào thực vật nghĩa tế bào thể sinh vật mang tồn lượng thơng tin di truyền 74 cần thiết đủ sinh vật đó, gặp điều kiện thích hợp tế bào phát triển thành thể hồn chỉnh [2] Sự phân hố tế bào chuyển tế bào phôi sinh thành tế bào mơ chuyển hố, đảm nhận chức khác thể Ví dụ: Mơ dậu làm nhiệm vụ quang hợp, mơ bì làm nhiệm vụ bảo vệ, nhu mô làm nhiệm vụ dự trữ, mô dẫn làm nhiệm vụ vận chuyển nước chất dinh dưỡng Q trình phân hố tế bào biểu diễn sơ đồ sau: Tế bào phôi sinh Tế bào giãn Tế bào chun hố Sơ đồ 1: Q trình phân hóa tế bào Mặc dù tế bào chuyển hố thành mơ chức chúng khơng khả phân chia Trong điều kiện thích hợp, tế bào lại trở dạng tế bào phôi sinh phân chia mạnh mẽ Q trình gọi phản phân hố tế bào (ngược lại với q trình phân hố tế bào) Sơ đồ hoá sau: Phân hoá tế bào Tế bào phôi sinh Tế bào giãn Tế bào chuyên hoá Phản phân hoá tế bào Sơ đồ 2: Q trình phản phân hóa tế bào Về chất phân hoá phản phân hoá trình hoạt hố, phân hố gen Tại thời điểm q trình phát triển cá thể, có số gen hoạt hoá (mà trước bị ức chế) biểu trạng thái mới, số gen khác lại bị đình hoạt động Điều xảy theo chương trình mã hoá cấu trúc phân tử ADN tế bào Mặt khác, tế bào nằm khối mô thể thường bị ức chế tế bào xung quanh Khi tách riêng tế bào tạo điều kiện thuận lợi cho gen hoạt hoá Quá trình phân hố xảy theo chương trình định sẵn [4] Hóa chất vật liệu 5.1 Hóa chất dùng cho ni cấy mơ tế bào thực vật 75 Mơi trường ni cấy mơ tế bào có thành phần thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại tế bào, mô quan nuôi cấy Đối với loại mơ, quan mục đích nuôi không giống nhau, môi trường sử dụng khác Mơi trường ni cấy thay đổi theo giai đoạn sinh trưởng phát triển mẫu ni cấy [4] * Các muối khống đa lượng vi lượng Đối với trồng, chất khống đa vi lượng đóng vai trò quan trọng Ví dụ, magiê phần phân tử diệp lục, canxi cấu tạo màng tế bào, nitơ thành phần quan trọng vitamin, amino axit protein Ngoài ra, nguyên tố vi lượng Fe, Zn, Mo, Mn thành phần số enzim cần thiết cho hoạt động sống tế bào Muối khoáng thành phần thiếu môi trường nuôi cấy tế bào thực vật, làm vật liệu cho tổng hợp chất hữu cơ, enzym Các ion muối hòa tan giúp ổn định áp suất thẩm thấu mơi trường tế bào, trì điện hóa thực vật Ví dụ: K, Ca quan trọng điều hòa tính thấm lọc tế bào - Các nguyên tố khoáng đa lượng: Bao gồm nguyên tố khoáng sử dụng nồng độ 30 ppm, tức 30mg/l Những nguyên tố là: N, S, P, K, Mg Ca Riêng Na Cl sử dụng vài mơi trường, chưa rõ vai trò chúng + Nitơ (N): Được sử dụng hai dạng NO3- NH4+ riêng rẽ phối hợp với Hầu hết thực vật có khả khử nitrat thành ammonium thông qua hệ thống nitrat reductase (NR) Ammonium tế bào thực vật đồng hóa trực tiếp để sinh tổng hợp nên chất đạm hữu amino acid Điều đáng lưu ý dùng ammonium (khơng có nitrat) sinh trưởng tế bào giảm, chí ngừng hồn tồn Ngun nhân trình trao đổi ion tế bào xảy lệch dẫn đến tình trạng thay đổi độ pH mơi trường Vì vậy, hầu hết loại mơi trường dùng nitrat ammonium dạng phối hợp, tùy theo đặc tính hấp thu nitow lồi mà phối hợp theo tỷ lệ thích hợp + Lưu huỳnh (S): Chủ yếu tốt muối SO4-2 Các dạng ion khác SO3 SO2 thường tác dụng, chí độc 76 + Phospho (P): Mô tế bào thực vật nuôi cấy có nhu cầu phospho cao Phospho thành phần cấu trúc phân tử acid nucleic Ngoài phospho dạng H2PO4- HPO4-2 có tác dụng hệ thống đệm (buffer) làm ổn định pH mơi trường q trình nuôi cấy - Các nguyên tố vi lượng: Là nguyên tố sử dụng nông độ thấp 30 ppm Đó Fe, B, Mn, I, Mo, Cu, Zn, Ni, Co + Sắt (Fe): Thiếu sắt, tế bào khả phân chia Fe thường tạo phức hợp với thành phần khác pH môi trường thay đổi, phức hợp thường khả giải phóng Fe cho nhu cầu trao đổi chất tế bào Tốt nên sử dụng Fe dạng phức chelat với citrat với ETDA (Ethylen Diamin Tetraacetic Acid) Từ phức chất Fe giải phóng phạm vi pH rộng + Mangan (Mn): Thiếu Mn làm cho hàm lượng amino acid tự DNA tăng lên, lượng RNA sinh tổng hợp protein giảm dẫn đến phân bào + Bo (B): Thiếu B môi trường gây lên biểu thừa auxin thực chất B làm cho chất ức chế auxin oxydase tế bào giảm Mơ ni cấy có biểu mơ sẹo hóa mạnh, thường mơ sẹo xốp, mọng nước, tái sinh [1] * Nguồn cacbon Đường thành phần dinh dưỡng quan trọng thiếu mơi trường dinh dưỡng Nó sử dụng làm nguồn cacbon cung cấp lượng nuôi cấy, đồng thời đóng vai trò trì áp suất thẩm thấu môi trường [3] Loại đường sử dụng phổ biến saccarozơ với hàm lượng từ 26% (W/v) Những loại đường khác như: fructozơ, glucozơ, maltozơ, rafinozơ dùng trường hợp cá biệt Trong nuôi cấy chồi dâu tằm (mulberry bud), mơi trường có fructozơ cho kết tốt loại đường khác [4] * Các vitamin axit amin 77 Ảnh hưởng vitamin đến phát triển tế bào ni cấy in vitro lồi khác khác Hầu hết tế bào nuôi cấy có khả tổng hợp tất loại vitamin với số lượng mức u cầu Để mơ sinh trưởng, tốt phải bổ sung thêm vào môi trường hay nhiều loại vitamin amino axít Trong loại vitamin, B1 xem vitamin quan trọng cho phát triển thực vật Axit nicotinic (B3) pyridoxune (B6) bổ sung vào mơi trường ni cấy nhằm tăng cường sức sống cho mô * Các chất bổ sung Nước dừa: Công bố sử dụng nước dừa nuôi cấy mô thuộc Van Overbeek cộng (Van Overbeek cs, 1944) [8] Sau đó, tác dụng tích cực nước dừa môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật nhiều tác giả ghi nhận Nước dừa xác định giàu hợp chất hữu cơ, chất khống chất kích thích sinh trưởng (George, 1993) [6] Nước dừa sử dụng để kích thích phân hóa nhân nhanh chồi nhiều loại Nước dừa thường lấy từ dừa để sử dụng tươi sau bảo quản Thông thường nước dừa thường xử lý để loại trừ protein, sau lọc qua màng lọc để khử trùng trước bảo quản lạnh Tồn dư protein nước dừa không gây ảnh hưởng đến sinh trưởng mô tế bào nuôi cấy, dẫn đến kết tủa dung dịch bảo quản lạnh Chất cặn lọc để lắng bình gạn bỏ phần cặn Nước dừa thường sử dụng với nồng độ - 20% thể tích mơi trường, kích thích phân hóa nhân nhanh chồi Dịch chiết nấm men: Có tác dụng kích thích sinh trưởng phát triển mô tế bào Dịch chiết nấm men chế phẩm thường dùng nuôi cấy vi sinh vật, mơ tế bào động vật với nồng độ thích hợp Ngồi ra, sử dụng dịch thủy phân casein hydrolyase (0,1 - 1%) bột chuối với hàm lượng 40g bột khô 100g/l (xanh) nhằm tăng cường phát triển mô sẹo hay quan nuôi cấy Agar: Trong môi trường nuôi cấy đặc, người ta thường sử dụng agar để làm rắn hố mơi trường Nồng độ agar sử dụng thường 0,6 - 1%, loại 78 tinh bột đặc chế từ rong biển để tránh tượng mơ chìm mơi trường bị chết thiếu O2 ni mơi trường lỏng tĩnh [1] * Các chất điều tiết sinh trưởng Các chất điều hồ sinh trưởng khơng thể thiếu q trình ni cấy mơ thực vật chất thuộc hai nhóm auxin cytokinin Auxin có tác dụng sinh lý nhiều mặt lên trình sinh trưởng tế bào, hoạt động tầng phát sinh, hình thành rễ, tượng ưu [4] Các chất thuộc nhóm auxin thường sử dụng là: NAA, IAA 2,4D Trong đó, IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào điều khiển hình thành rễ NAA có tác dụng làm tăng hơ hấp tế bào mơ ni cấy, tăng hoạt tính enzym ảnh hưởng mạnh đến trao đổi chất nitơ [2] Tuy nhiên, nồng độ cao axin kìm hãm phát triển rễ Mặt khác, số lồi đậu, cà chua, có khả tạo rễ mơi trường khơng có auxin Còn 2,4D sử dụng có hiệu với mục đích tạo mô sẹo thực vật không dùng môi trường tái sinh quan [3],[7] Cytokinin chất điều hồ sinh trưởng có tác dụng làm tăng phân chia tế bào, biệt hố chồi có tác dụng rõ rệt phát triển chồi từ mô sẹo nuôi cấy Các cytokinin thường gặp kinetin BAP, hai có tác dụng kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động tế bào phân sinh làm hạn chế hố già tế bào Ngồi chất có tác dụng lên q trình trao đổi chất, q trình tổng hợp ADN, tổng hợp protein làm tăng cường hoạt tính số enzym [3] Tác động phối hợp auxin cytokinin có tác dụng định đến phát triển phát sinh hình thái tế bào mô Những nghiên cứu Skoog cho thấy, tỷ lệ auxin/cytokinin cao thích hợp cho hình thành rễ, thấp kích thích q trình phát sinh chồi mức cân thuận lợi cho phát triển mơ sẹo [3] Ngồi auxin cytokinin, nuôi cấy mô, tế bào thực vật người ta sử dụng chất điều hồ sinh trưởng khác : gibberillin (thông dụng GA3), Abscisic acid (ABA) Sự có mặt GA3 ni cấy tăng cường trình vươn thân chồi tạo hoàn chỉnh số loài thực vật ABA sử dụng ni cấy nhằm kìm hãm sinh trưởng chồi, tham gia bảo quản lương thực quỹ gen in vitro [4] 79 5.2 - Vật liệu khởi đầu Vật liệu khởi đầu chuối tiêu nhập nội có chiều cao từ 1,5 – m, đường kính củ 10-15 cm Cây không sâu bệnh, sinh trưởng phát triển tốt tách từ chuối bố mẹ cho quả, to, nhiều Dụng cụ thiết bị ST T Tên thiết bị/dụng cụ Số lượng Bàn thao tác pha chế môi trường (1,2m x 2m) 01- 02 Máy khuấy từ gia nhiệt 01 máy Cân phân tích cân điện tử độ xác từ 10-2 đến 10-4 Máy đo Ph Micropipet (200-1000 µl) 01 10 11 12 13 16 17 18 Tủ lạnh 250 lít Máy cất nước 1-2 lần Bồn rửa dụng cụ Nồi hấp vơ trùng (85-105 lít) Tủ cấy vô trùng (02 chỗ ngồi) Tủ sấy ngăn Điều hòa Bộ pipet thủy tinh (200 µl, 1ml, 10ml, 20ml, 50ml) Đèn cồn chịu nhiệt đèn cồn Inox Bộ que cấy mẫu Inox (panh, dao, kéo, đũa cấy, đĩa cấy hình hạt đậu, ống nghiệm, khăn lau box) Găng tay Đĩa Petri (10cm) Thuổng, dao phay 19 Bình trụ 500 ml 20 21 22 Bộ bếp ga Dàn nuôi cấy (4 tấng) Đĩa inox hạt đậu 14 15 01 01 Bộ 01 01 01 01 01 01 02 01 Ghi Mặt bàn phủ nhựa cứng, kính để chống phá hủy hóa chất Pha chế hóa chất dạng dung dịch mẹ Cân hóa chất Hút chất kích thích sinh trưởng Bảo quản hóa chất 02 đèn 02 04 10 đĩa Mỗi loại 2000 bình 01 5-10 dàn 30 Để đánh Nấu môi trường 80 Các bước tiến hành Bước 1: Thu thập vật liệu Chọn chuối tiêu đời bố mẹ có suất cao, chất lượng tốt bệnh Chọn có chiều cao 1,5 m tách từ mẹ cho Đem rửa sạch, vùi vào cát ngày tiến hành vào mẫu Bước 2: Khử trùng nuôi cấy khởi động - Không rửa đem cắt bỏ lấy phần bẹ củ, cắt bỏ rễ, gọt vỏ sau rửa xà phòng tráng xà phòng vòi nước chảy - Xịt cồn 700 hết toàn mẫu chuối đưa vào box cấy - Dùng dao cắt bỏ bẹ lá, khoét lấy phần chồi đỉnh mẫu - Cho mẫu vào lắc cồn 700 khoảng 30 giây, tráng lại lần nước khử trùng - Lắc mẫu dung dịch HgCl2 0,1% thời gian 15 phút - Tráng nước khử trùng từ – lần - Cắt bỏ hai đầu mẫu cấy tiếp xúc với HgCl2 0,1% - Cấy vào môi trường tạo chồi - Tỷ lệ mẫu thu đạt 70% Mơi trường tạo chồi có thành phần sau: Sử dụng môi trường (MS Murashige T and Skoog F, 1962)[5] STT Thành phần Nồng độ Thành phần Nồng độ Đa lượng 50 ml/l Đường 30 g/l Vi lượng ml/l Agar 6,8 g/l Vitamin ml/l Myo Inositol 0,1 g/l Sắt 10 ml/l BAP mg/l Bước 3: Nhân nhanh cụm chồi ống nghiệm Ta tiến hành tách chồi tạo từ bước để cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh cụm chồi Môi trường nhân nhanh sử dụng có thành phần sau: 81 Sử dụng mơi trường MS Thành phần STT Nồng độ Thành phần Nồng độ Đa lượng 50 ml/l Đường 30 g/l Vi lượng ml/l Agar 6,8 g/l Vitamin ml/l Myo Inositol 0,1 g/l Sắt 10 ml/l IAA 0,2 mg/l BAP mg/l Hệ số nhân chồi đạt 5,06 lần Thường giai đoạn thường cấy chuyển lần liên tiếp lại phải vào mẫu lại để cải thiện chất lượng Bước 4: Ra rễ ống nghiệm, tạo hoàn chỉnh Trong bước này, chọn chồi đủ tiêu chuẩn cao từ – cm, có từ – cặp thân mập để cấy chuyển sang môi trường rễ Mơi trường rễ chuối tiêu nhập nội có thành phần sau: Sử dụng môi trường 1/2MS STT Thành phần Nồng độ Thành phần Nồng độ Đa lượng 25 ml/l Đường 30 g/l Vi lượng 2,5 ml/l Agar 6,8 g/l Vitamin 2,5 ml/l Myo Inositol 0,1 g/l Sắt ml/l NAA 0,6 mg/l Tỷ lệ chồi rễ đạt 100% Bước 5: Ra vườn ươm Chọn chồi có chiều cao – cm, xanh, thân mập có nhiều rễ đem huấn luyện vườn ươm có mái che cản quang thời gian ngày Cây chuối trồng vào cát – tuần đem trồng vào bầu đất; trộn đất, chấu hun phân chuồng hoai mục theo tỷ lệ (4: 1:1) Sau trồng khoảng khoảng – 2,5 tháng sinh trưởng tốt có từ 4-7 lá, cao vút 15-20 cm xuất trồng sản xuất Tỷ lệ sống đạt 86,67% 82 Báo cáo kết Cây thu sau trình nhân giống cần đảm bảo độ đồng đều, chất lượng tốt, sinh trưởng mạnh, không sâu bệnh đạt chiều cao 1520cm Đảm bảo tiêu chuẩn tiến hành xuất bán 83 MỘT SỐ HÌNH ẢNH MINH HỌA QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY CHUỐI TIÊU NHẬP NỘI Hình 1: Mẫu chuối tiêu nhập nội vào mẫu thành công (làm vật liệu khởi đầu, sau 30 ngày nuôi cấy) Hình 3: Mẫu chuối tiêu nhập nội giai đoạn tạo rễ in vitro (Sau 20 ngày ni cấy) Hình 2: Mẫu chuối tiêu nhập nội giai đoạn nhân nhanh ( sau 30 ngày ni cấy) Hình 4: Cấy chuối tiêu nhập nội in vitro trồng vào bầu đất nuôi vườn ươm (Sau 60 ngày trồng) ... 1: Nghiên cứu kỹ thuật vào mẫu tái sinh chồi giống chuối tiêu từ chồi sinh trưởng tự nhiên - Nội dung 2: Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh cụm chồi giống chuối tiêu - Nội dung 3: Nghiên cứu kỹ thuật. .. nghiên cứu để nhân nhanh giống chuối tiêu góp phần nhanh chóng vào chương trình chọn tạo thành cơng giống chuối tiêu Từ lý đó, chúng tơi tiến hành đề tài Nghiên cứu kỹ thuật chọn tạo giống chuối tiêu. .. nghiên cứu - Nội dung 1: Nghiên cứu kỹ thuật vào mẫu tái sinh chồi giống chuối tiêu từ chồi sinh trưởng tự nhiên - Nội dung 2: Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh cụm chồi giống chuối tiêu - Nội dung