Quy trình chiết xuất một số alcaloid từ lá dừa cạn

Danh mục các bảng Danh mục các hình ĐẶT VÁN ĐỀ.......................................................................................................1 PHẢN 1. TỔNGQUAN........................................................................................ 31.1 Vài nét về cây Dừa cạn.................................................................................... 31.1.1 Đặc điểm thực vật......................................................................................... 31.1.2 Tác dụng dược lý của cây Dừa cạn.............................................................. 51.2. Các alcaloid - thành phần hóa học quan trọng nhất từ Dừa cạn................. 71.3. Một số phương pháp chiết tách đã được sử dụng.................................. 111.3.1 Trên thế giới ............................................................................................... 111.3.2. Tình hình nghiên cứu và triển khai trong nước....................................... 14 PHÀN 2. ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP..................................................... 172.1 Đối tượng nghiên cứu và dụng cụ thiết b ị................................................... 172.1.1 Đối tượng nghiên cứu................................................................................. 172.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất.......................................................................... 172.2 Nội dung nghiên cứu.................................................................................... 202.3 Phương pháp thực nghiệm............................................................................. 20 PHẦN 3. THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN............................... 223.1 Thực nghiệm và kết quả.............................................................................. 22 Trang 3 3.1.1 Độ ẩm của dược liệu.................................................................................. 23.1.2 Quá trình chiết “alcaloid toàn phần” ........................................................ 22a) Chiết theo phương pháp ngấm kiệt................................................................ 23b) Loại bỏ các chất béo và chất m àu................................................................. 24c) Chiết phân bố.................................................................................................. 24d) Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố trong quá trình chiết...................... 253.1.3 Sơ bộ đánh giá thành phần “alcaloid toàn phần” bằng HPLC - MS..... 293.1.4 Phân tách các alkaloid Dừa cạn từ “alcaloid toàn phần” bằng phươngpháp sắc ký lỏng trung áp................................................................................... 30a) Giai đoạn tách thô bằng Sephadex................................................................. 30b) Giai đoạn làm giàu và tách chất..................................................................... 32c) Tinh chế lại bằng sắc ký cột nhanh................................................................ 343.1.5 Kết tinh làm sạch và xác định cấu trúc của các chất phân lập được..... 353.1.6 Phản ứng tạo muối Catharanthine sulphat............................................ . 40a) Khảo sát một số phương pháp sulfat hóa Catharanthine base...................... 40b) Tạo nguyên liệu Catharanthine sulfat............................................................ 433.2 Bàn luận...................................................................................................

B ộ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI • • • • soEQca TRẦN THỊ HƯƠNG GIANG NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT MỘT SỐ ALCALOID TỪ LÁ DỪA CẠN ((Catharanthus roseus) LÀM NGUYÊN LIỆU TỔNG HỢP THUỐC CHỮA UNG THƯ KHÓA LUẬN TỚT NGHIỆP DƯỢC SỸ ĐẠI HỌC • • • • • KHÓA 2005 - 2010 Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Nhị Hà Nơi thực hiện: Trung tâm Hóa Dược Viện Hóa Công Nghiệp Việt Nam Hà n ộ i, 2010 LỜI CẢM ƠN Với ỉòng kính trọng biết ơn sâu sắc xin bày tỏ cảm ơn chân thành tới Th.s Nguyễn Nhị Hà —Bộ môn Hóa Vô Cơ người thầy trực tiếp hướng dân giúp đỡ hoàn thành khóa ỉuận Tiếp theo tỏi xin gửi lời cảm 07ĩ chân thành tới TSNguyễn Thế Hùng —Bộ môn Dược c ổ Truyền TS Trần Bạch Dương —Trung tâm Hóa Dược, Viện Hóa Công Nghiệp Việt Nam Là người dành nhiều thời gian, tận tình giúp đỡ trình thực đề tài Trung tâm Hóa Dược, Viện Hóa Công Nghiệp, Việt Nam Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tất cán nhân viên Trung tâm Hóa Dược, Viện Hỏa Công Nghiệp, Việt Nam thầy cô môn Dược Cổ Truyền tạo điều kiện thuận lợi để tỏi hoàn thành tốt khóa luận Cuối cùng, tói xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè quan tâm động viên, giúp đỡ suốt trình học tập thời gian thực khóa luận Hà Nội ngày 17 tháng năm 2010 Sinh viên Trần Thị Hương Giang MỤC LỤC Nội dung Trang Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình ĐẶT VÁN Đ Ề PHẢN TỔNG QUAN 1.1 Vài nét Dừa cạn 1.1.1 Đặc điểm thực vật .3 1.1.2 Tác dụng dược lý Dừa cạn 1.2 Các alcaloid - thành phần hóa học quan trọng từ Dừa cạn 1.3 Một số phương pháp chiết tách sử dụng 11 1.3.1 Trên giới .11 1.3.2 Tình hình nghiên cứu triển khai nước 14 PHÀN ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP 17 2.1 Đối tượng nghiên cứu dụng cụ thiết b ị 17 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 17 2.2 Nội dung nghiên cứu 20 2.3 Phương pháp thực nghiệm 20 PHẦN THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LU Ậ N .22 3.1 Thực nghiệm kết 22 3.1.1 Độ ẩm dược liệu 22 3.1.2 Quá trình chiết “alcaloid toàn phần” 22 a) Chiết theo phương pháp ngấm kiệt 23 b) Loại bỏ chất béo chất m àu 24 c) Chiết phân bố 24 d) Khảo sát ảnh hưởng số yếu tố trình chiết 25 3.1.3 Sơ đánh giá thành phần “alcaloid toàn phần” HPLC - MS 29 3.1.4 Phân tách alkaloid Dừa cạn từ “alcaloid toàn phần” phương pháp sắc ký lỏng trung áp 30 a) Giai đoạn tách thô Sephadex .30 b) Giai đoạn làm giàu tách chất 32 c) Tinh chế lại sắc ký cột nhanh 34 3.1.5 Kết tinh làm xác định cấu trúc chất phân lập 35 3.1.6 Phản ứng tạo muối Catharanthine sulphat .40 a) Khảo sát số phương pháp sulfat hóa Catharanthine base 40 b) Tạo nguyên liệu Catharanthine sulfat 43 3.2 Bàn luận 44 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ X UẤT 45 4.1 Kết luận 46 4.2 Đề xuất 47 Danh mục chữ viêt tăt DL: Dược liệu SKLM: Sắc ký lớp mỏng Vind : Vindoline Cath : Catharanthine VLB: Vinblastine VCR: Vincristine RPLC: Reversed Phase Liquid Chromatography Sắc ký lỏng pha đảo IELC: lon - Exchange Liquid Chromatography Sắc ký trao đổi ion NPLC: Normal Phase Liquid Chromatography Sắc ký lỏng pha thuận GPLC: Gas Pressure Liquid Chromatography Sắc ký khí lỏng MPLC: Medium Pressure Liquid Chromatography Sắc ký lỏng trung áp FC: Fast Chromatography Sắc ký cột nhanh HPLC-MS: High - Pressure Liquid Chromatography Mass Spectroscopy Sắc ký lỏng cao áp kết nối phổ khối TLC: Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng HMQC: Heteronuclear Multiple Quantum Coherence HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Connectivity NMR : Nuclear Magnetic Resonance Danh muc hình Hình 1.1: Cây Dừa cạn Hình 1.2: Nguyên liệu Dừa cạn Hình 1.3: cấu trúc phân tử Vindoline Hình 1.5: cấu trúc phân tử Vinblastine Vincristine Hình 1.6 : Công thức hóa học Vindesine,Vinorelbine, Vinflunine Anhydrovinblastine Hình 1.7: Sơ đồ tóm tắt quy trình tách chiết phân lập acaloid 12 Hình 2.1: Thiết bị MPLC 18 Hình 2.2: Thiết bị TC 19 Hình 3.1: Quy trình chiết tách Vinca alcaloid từ Dừa cạn 23 Hình 3.2 : Tỷ lệ acid acetic/ethanol tỷ lệ alcaloid thu 26 Hình 3.3 : Lượng alcaloid thu nhận sau đợt chiết 28 Hình 3.4: Sơ đồ tách alcaloid phương pháp sắc ký 30 Hình 3.5: Công thức phân tử VI1+V21 - Vindoline 38 Hình 3.6: Công thức phân tử V22 - Catharanthine 40 Hình 3.7: Catharanthine sulfat thử (T) chuẩn (C) 43 9cm dài - 3,5cm rộng, xanh bóng, không lông, với gân nhạt màu cuống ngắn (dài - l, em); mọc thành cặp đối Hoa có màu từ trắng tới hồng sẫm với phần tâm có màu đỏ hơn, ống tràng dài 2,5 - 3cm tràng hoa đường kính - 5cm có thùy tương tự cánh hoa Quả cặp đại dài - 4cm, rộng 3mm chứa - hạt nhỏ màu nâu nhạt, hình trứng [38] Hình 1.1: Cây Dừa cạn Hình 1.2: Nguyên liệu Dừa cạn Trồng cấy thu hải Ở Việt Nam, Dừa cạn mọc tự nhiên suốt từ Bắc vào Nam trồng cho hoa đẹp Đây giống có khả chịu hạn cao có thời gian canh tác ngắn Các kết thử nghiệm Trung tâm nghiên cứu giống chế biến thuốc Đà Lạt cho thấy Dừa cạn Catharanthus roseus phát triển tốt đất cát khô hạn, sau tháng trưởng thành tích luỹ đủ hàm lượng alcaloid đạt tiêu chuẩn xuất Công ty Vimedimex II kết hợp với Trung tâm Nghiên cứu giống chế biến thuốc Đà Lạt thử nghiệm canh tác Dừa cạn vùng đất cát ven biển tỉnh miền Trung để thu hoạch rễ ỉá phục vụ xuất với sản lượng hàng trăm năm [2 ] 1.1.2 Tác dụng dược ỉý Dừa cạn Tác dunz dân gian Trong dân gian, người ta thường sử dụng nước sắc Catharanthus roseus với tác dụng lợi tiểu, hạ đường huyết, chữa bệnh lỵ, bệnh xuất huyết chữa vết thương hở Ở Châu Âu, Bắc Phi Trung Phi, nước sắc Dừa cạn sử dụng làm thuốc lợi tiểu, giảm xung huyết phổi, chữa viêm họng Ở Mỹ, Dừa cạn dùng dạng thuốc đắp để cầm máu Người Ấn Độ sử dụng trường hợp bị côn trùng cắn Ngoài Dừa cạn dùng làm thuốc chống viêm mắt Caribe thuốc chữa ho Trung Quốc [6 ] Hiện nay, Dừa cạn nhiều nhà khoa học giới nghiên cứu tìm hiểu Nhiều thử, nghiệm lâm sàng thực nhằm chứng minh tác dụng chống ung thư alcaloid từ Dừa cạn Tác dung chốn2 ung thư alcaỉoid từ Dừa can [5-11,14,16,22,26] Đầu năm 1950, Noble phòng thí nghiệm Collipv - Đại học Western Ontario - Canada nghiên cứu Dừa cạn với mục đích tìm hiểu tác dụng lượng đường huyết thể Thay hoạt tính trên, ông nhận thấy Dừa cạn có chất tác dụng mạnh đến tế bào bạch cầu tủy xương Từ đó, theo hướng nghiên cứu chất gây độc tế bào ức chế phân bào bạch cầu ác tính, với nhà khoa học khác Beer Cutts, Noble chiết chất có hoạt tính chống ung thư đặt tên Vincaleukoblastine vào năm 1958, sau đổi tên thành Vinblastine [16] Cũng đồng thời khoảng thời gian đó, nhóm nhà khoa học khác bao gồm Svoboda, Johnson, Neuss Gorman phòng thí nghiệm Lilly nghiên cứu chứng minh phân đoạn alcaloid từ Dừa cạn có tác dụng kéo dài khả sinh sản tế bào DBA chuột cấy tế bào lympho ung thư cấp tính (bệnh bạch cầu P-1534).[16] Phát hoạt tính chống lại bạch cầu P-1534 Dừa cạn có ý nghĩa quan trọng Trong nghiên cứu chuyên sâu Leurosine, Svoboda tìm alcaloid cấu trúc đôi phân tử (dimeric alcaloid) có cấu trúc tương tự Vinblastine Tác dụng chống tế bào bạch cầu P-1534 tất aicaioid ỉần chứng minh phòng thí nghiệm Lilly [16] Ke từ sau thử nghiệm lâm sàng vào thập niên 1960, alcaloid từ Dừa cạn Vinblastine (biệt dược Velban ® Velbe ®) Vincristine (biệt dược OncoVin ®), sử dụng rộng rãi hóa trị liệu cho nhiều loại ung thư khác nhau: ung thư máu, ung thư mô bạch huyết, ung thư tinh hoàn ung thư vú [ ] Có thể nói, việc phát Vinblastine cột mốc quan trọng phát triển hóa trị liệu ung thư Nó mở nhiều đường nghiên cứu khác hóa học, sinh học, lâm sàng nhằm phát chứng minh hoạt tính chống ung thư alcaloid từ Dừa cạn Cơ chế chống uns thư Dừa can r8,13,16,24-26,361 Ngay sau phát đặc tính kháng ung thư in vivo alcaloid từ Dừa cạn, có nhiều thí nghiệm nghiên cứu tập trung vào giải thích chế tác dụng chúng Vinblastine liên kết đặc hiệu với tubulin protein heterodimeric phổ biến tất tế bào nhân thật Tubulin dạng polymer microtubules có vai trò quan trọng việc trì hình thái tế bào, vận chuyển nội bào xây dựng thoi phân bào trình phân chia tế bào Các alcaloid ức chế kết hợp tubulin vào microtubules ngăn chặn trình phân chia tế bào Chúng liên kết với p-tubulin vị trí khác (được gọi miền Vinca tubulin - miền chưa xác định xác vị trí) Vì vậy, hoạt tính chống tăng sinh alcaloid Dừa cạn cho kết tương tác chúng với thoi phân bào [8,13,36] Trong nghiên cứu in vỉữo, tác dụng Vinca alcaloid tubulin phụ thuộc vào nồng độ Ở nồng độ thấp (submicromolar), chúng ức chế chức hình thành microtubules từ tubulin Ở nồng độ cao diệt tế bào.[25] Gần đây, Knossow cộng công bố tìm vị trí gắn kết xác alcaloid Dừa cạn tubulin Họ đồng thời công bố hình ảnh thu nhiễu xạ tia X cho thấy vị trí gắn kết bị xen phủ phần với vị trí gắn kết phomopsin A, peptit mạch vòng phân lập từ loài nấm Phomopsỉn leptostromỉ/omỉs có tác dụng ức chế trùng hợp tubulin [24,25] 1.2 Các alcaloid —thành phần hóa học quan trọng từ Dừa cạn Phần mặt đất chứa 0,2 - 1% alcaloid Đã có khoảng 150 alcaloid phân lập từ Catharanthus Nhờ phát triển việc nghiên cứu tế bào phương pháp phân tích sắc ký lỏng cao áp mà số lượng chất phát ngày nhiều [7] Xét mặt cấu trúc, alcaloid chứa loài Catharanthus tồn hai dạng monomer dimer Theo I.s Johnson cộng xếp alcaloid vào nhóm lớn:[3] Các alcaloid monomer ( Vindoline, Catharanthine ) Nhóm alcaloid dimer indole - dihydroindole (loại Vinblastine) Các alcaloid dimer loại Vinblastine 25 r r Bảng 3.1: Kêt giai đoạn chiêt Dừa cạn I Giai đoạn chiết ngấm kiệt Lượng nguyên liệu dùng Thành phân dung môi chiêt Lượng dung môi làm âm 10 lít Lượng dung môi /1 lân chiêt 10 lít Thời gian ngâm chiêt 12 Sô lượt chiêt lân Lượng ethanol thu hôi 35 lít Lượng dịch cô thu thu lít II 5kg CH3COOH/C2H5OH(90%)=055:10(v/v) Giai đoan loai chât béo & chât màu • Lượng n-hexan cân dùng Màng lọc ly tâm Lượng n-hexan thu hôi Tôc độ văt ly tâm Pha nước acid chứa alcaloid III • llít giây lọc dâu dày 1,5- 3mm ,8 1200 lít vòng/phút lít Giai đoạn chiêíphân bô Lượng CH2Cl2/llân chiêt 2 Sô lượt chiêt lân Lượng chloroform thu hôi 4,5 lít Lượng alc tông sô thu 49g lít d) Khảo sát ảnh hưởng số yếu tố trình chiết Khảo sát ảnh hưởng tỷ lề acid acetic/ethanol đến suất thu nhân aỉcaỉoỉd: Tiến hành chiết nguyên liệu Dừa cạn theo quy trình 3.1.2.a) Tỷ lệ dung môi chiết acid acetic/ethanol 90% khảo sát từ 0,01 đến 0,1 30 3.1.4 Phân tách alkaloid Dừa cạn từ “alcaloid toàn phần” phương pháp sắc ký lỏng trung áp Quá trình tách sắc ký alcaloid từ alcaloid toàn phần Dừa cạn mô tả sơ đồ sau: Cột Sephadex MeOH MeOH Phân đoạn V2 Cột Silica gel gradient Cột Silica gel CH2Ch/MeOH 99:1 (v/v) CH2Cb/MeOH 0-1% MeOH MeOH CH2Ch/MeOH l-3%MeOH MeOH CH2Ch/MeOH 3-4%MeOH MeOH Hình 3.4: Sơ đồ tách aỉcaloỉd phương pháp sắc ký a) Giai đoạn tách thô Sephadex Điều kiện thực nghiệm: - Kỹ thuật: Sắc ký lỏng trung áp (MPLC); - Cột tách: Id X L = 50 X 330mm nạp 500g Sephadex LH 20; - Pha động: CH3OH; - Tốc độ dòng: 60 mL/phút; 35 thể màu Von’s Dựa vào thể thành phần mỏng ta tách riêng phân đoạn Tiến hành cô phân đoạn thu Thực tương tự với lượng mẫu lại Cô kiệt xác định lượng cân thu hồi dung môi Bảng 3.8: Kết trình tinh chế chất phân lập Phân đoạn đem tinh chê V11+V21 V22 V23 Khôi lượng môi phân đoạn đem tách 4,6g 0,65g ,6 g Tỷ lệ dung môi pha động (CH2Cl2/MeOH) 99:1 49:1 29:1 Lượng dung môi đâu loại bỏ/lân tách lOOmL 180mL 50mL Thê tích phân đoạn săc ký thu lOOmL 150mL 60mL 3,8g 0,58g 0,55g được/lần tách Lượng alcaloid thu Chấm kiểm tra lại phân đoạn sắc ký ta nhận thấy chất thu tương đối Có thể đem kết tinh làm giai đoạn 3.1.5 Kết tinh làm xác định cấu trúc chất phân lập V11+V21, V22, V23 sau kết tinh từ phân đoạn sắc ký tương ứng dung môi methanol Kết sau: 3.1.5.1 V11+V21: V 11+V21: 3g phân lập dạng tinh thề màu trắng ngà, nhiệt độ nóng chảy: 153 - 155°c 36 Bảng 3.9: số liệu phổ , 3C-NMR V11+V21 Vi trí c ỏc (ppm) [14] ôc (ppm) (báo cáo) 83,5 83.35 79,7 79,61 76,5 76,35 43,1 42,94 130,7 130,52 124,0 124,01 51,2 51,09 10 52,1 52,00 11 44,2 44,00 12 52,9 52,79 13 125,2 125,04 14 122,7 122,67 15 104,9 104,65 16 161,4 161,20 17 96,0 95,87 18 153,9 153,74 19 67,3 67,16 20 30,9 30,81 21 7,8 7,63 • 37 23 170,5 170,76 24 171,9 171,91 25 ,0 ,0 26 52,1 52,29 27 55,1 55,36 Bảng 3.10: số liệu phổ ^ -N M R V11+V21 ỏc (ppm)(báo cáo) ỏc (ppm) [30] 0,48 (3H, t, J=6,5, CH2CH3) 0,49 (3H, t, J=7, 5Hz, CH 2CH 3) 1,14 (1H, dd, J=15Hz; J=7,5Hz, CH 2CH3) 1,35 (2H,q,J=6,5, CH2CH3) 1,65 (1H, dd, J=15Hz; J=7,5Hz, CH 2CH3) 2,67 (3H, s, NCH 3) 2,65 (3H, s, NCH3) 2,68 (3H, s, COCH3) 3,78 (1H, s, CH3O) 3,80 (6 H, s, 2xOCH3) 3,79 (1H, s, CH3O) 5,23 (1H, d, J=5,55, CH) 5,24 (1H, IĨ1, CH) 5,88 (1H, dd, J=3,5; J=10,3,CH) 5,85 (1H, IĨ1, CH) 6,08(1 H,d,J=2Hz, acromatical protons) 6,08-6,91 (3H,m, acromatical protons) 6,30(lH,m, acromatical protons) 6,89(1 H,d,J=8 Hz, acromatical protons) Phổ ^-N M R 13C-NMR V11+V21 xuất tín hiệu đặc trưng alcaloid có khung bis-indole Chúng so sánh phổ V1+V21 với phổ Vindoline [14] thấy hoàn toàn có tương đồng Vì khẳng định VI1+V21 Vindoline 40 bis-indole) Chúng so sánh phổ V22 với phổ Catharanthine [30,14] thấy hoàn toàn có tương đồng Vì khẳng định V22 Vindoline 14 17 18 19 Hình 3.6: Công thức phân tử V22 - Catharanthine 3.I.5.3 V23 V23: 500 mg phân lập dạng tinh thể màu vàng nhạt Chúng tiến hành đo phổ xác định tính chất vật lý V23 (chất X) 3.1.6 Phản ứng tạo muối Catharanthine sulphat Catharanthine dạng base không bền, dễ bị oxi hóa nhiệt độ thường môi trường không khí gây khó khăn bảo quản sử dụng Ở dạng base Catharanthine tan nước nên khả tiếp xúc vói Vindoline môi trường hạn chế Đây cho nguyên nhân làm phản ứng bán tổng hợp dimer alcaloid môi trường H20 không thực Với mục đích khắc phục hạn chế trên, tiến hành phản ứng hóa muối sulfat Catharanthine base a) Khảo sát số phương pháp sulfat hóa Catharanthỉne base [34,35] Dụng cụ: 42 - Tiến hành: Lấy 0,0336g (~ O,lmmol) Catharanthine base, 4mL CH2C12, 4mL H 2SO 0,1N cho vào bình cầu phản ứng Khuấy hỗn hợp phản ứng máy khuấy từ 30 phút Chạy SKLM hỗn họp phản ứng với hệ dung môi khai triển CH2Cl2/MeOH = 25:1, chạy song song so sánh với Catharanthine sulfat chuẩn Soi đèn tử ngoại nhận thấy phản ứng chưa xảy sản phẩm chưa tạo thành, c Phương pháp 3: Sau phương pháp đầu chưa thành công, tiếp tục tiến hành phản ứng theo sơ đồ sau: Catharanthin Catharanthin sulfat - Tiến hành: Lấy 0,0336g (~ 0,lmmol) Catharanthine base, 3mL aceton 0,3mL nước cất cho vào bình cầu phản ứng Nhúng bình phản ứng nước đá nhỏ từ từ 0,01 mL (~ 0,1 mmol) H 2SO 98% Khuấy phản ứng máy khuấy từ 30 phút đến phản ứng kết thúc Loại bớt dung môi acetone phương pháp cất quay chân không, thêm vào hỗn hợp phản ứng lượng nhỏ NaCl khan, lắc để chuyển sản phẩm Catharanthine sulfat từ pha nước sang pha hữu Chiết sản phẩm thu mL CH2CI2, loại nước Na 2SƠ4 khan 45 - Lượng “alcaloid toàn phần” thu nhận đạt 0,98% so với nguyên liệu khô Đã xây dựng quy trình phân tách sắc ký trung áp Vindoline, Catharanthine từ Dừa cạn: - Tách thô cột Sephadex LH 20 (50x330mm) pha động methanol ta thu phân đoạn sắc ký V I, V2 - - Tiến hành tách VI, V2 cột Silica gel pha động hệ dung môi diclomethane/methanol gradient ta thu phân đoạn V I 1, V21, V22, V23 - Tinh chế lại phân đoạn sắc ký cột nhanh dung môi pha động methanol/dicloromethane - Kết tinh làm dung dịch methanol ta thu V11+V21, V22, V23 Xác định lại cấu trúc phân tử V11+V21, V22 phổ !H-NMR, 13C-NMR Chuyển hóa Catharanthine base sang Catharanthine sulfat theo phương pháp thích họp: cho phản ứng với H 2S 98% acetone/H20 (10/1), chiết lại CH2C12 46 PHÀN KỂT LUẬN VÀ ĐÈ XUẤT 4.1 Kết luận Trong trình thực khóa luận thu số kết sau: mặt ỉỷ thuyết: - \ T A *-* y a i l r? T !r» rr U -U iig , " Ó o L 'C lL / f I r ị f ị > Ị Ị > n iv iC U L i iiiu t s /ệ õ lic i U r tr > ilv / U •> /ệ ô v o x r \ iv ^ A w jr r\ m rr U -U iig , X ro V & r f ì â n i-iw ii Ịiò f> V \ i i a i i i l rỵn rV y i c m P ir n v u i i đề tài, làm quen với máy móc thiết bị phòng thí nghiệm, từ thực tế để hiểu rõ lý thuyết học - Nâng cao khả tìm kiếm đọc tài liệu mặt thực nghiệm: - Bổ sung kỹ thực nghiệm cần thiết - Xây dựng quy trình chiết hỗn hợp alcaloid Dừa cạn phương pháp chiết ngấm kiệt chiết phân bố khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết - Xây dựng quy trình tách alcaloid Dừa cạn sắc ký lỏng trung áp - Hạn chế số nhược điểm quy trình trước là: o Hạn chế sử dụng dung môi độc hại benzen hay chloroform o Thay acid sulfuric 10% dung môi acid acetic/ethanol 90% hạn chế tình trạng muối alcaloidsulfat không hoàn nguyên trở lại alcaloid hoàn toàn kiềm hoá dịch acid Hỗn hợp “alcaloid toàn phần” chiết từ dung môi chiết có mặt muối không phân ly 29.Renault, J.H et al (1999), “Isolation of indole alkaloids from Catharanthus roseus by centrifugal partition chromatography in the pH-zone refining mode J” Chromatogr A, 849,421 30.Sundberg R.J et al, (1992), “Mechanistic Aspecta of the Formation of Anhydrovinbalastine by Potier-Polonovski oxidative coupling of Vindoline and Catharanthine Spectroscopic Oservation and Chemical reactions of*the Intern iiviatc , T£tra hẽổỈrGỉĩ, -48, p !2Pi7-2fy\j 31.Svoboda, G.H (1961), “Alkaloids of Vinca rosea Linn (Catharanthus roseus) IX: Extraction and characterization of leurosidine and leurocristine”, Lilyodia, 24, p 173 32.Svoboda, G H et al (1962), “Curent status of reaserch on the alkaloids of Vinca rosea Linn (Catharanthus roseus G don.y\ J pharm Sci., 51,707-720 33.Svoboda G.H et al (1975), “The phytochemistry and pharmacol Of Catharanthus roseus(L.) G Don., in the Catharanthus roseus alcaloids”, Tayler I.W., Farnsworth N.R eds., Marcel Dekker, Newyork 34.Mai Ngoc Tam et al (1998), The Ninth ASIAN Symposium on Medicina Spices and other Natural product plants, M05A,127,PC8,257, Ha Noi,Viet Nam 35.Tatsuya, s et al (2006), “Stereoselective Conversion of Anhydrovinblastine into Vinblastine Utilizing an Anti-vinblastine Monoclonal Antibody as a Chiral Mould”, Chem pharm Bull.,54, p.665-668 36.Vucovic, J et al (1988), “Production of 3',4'-anhydrovinblastine: a unique chemical synthesis”, Tetrahedron, 44, p.325 D U O N G — V 12 +V 1 — C D C — H VO (N (T S C O u*i in o:» CO [-* |> rj «H ư*) Lft VD vc; *^o UT' ko vx> «3 C No «5 o o IT SC O !> ID V) r - vr* VD l õ IO T ro m f J CN3 rj o C OC O00 Oj co cr) 0ŨIX) ơ> "!T •“»■ > CM r-1 CM CM CM f\] CN o ir> i n in u"> Ui in ư‘j võ VC* VO *T r l *T r l I^i o m o \D U i ỉ ló »r n r~ V j ĩ— I in u‘j r 'i U ) i n t il V c*5p J C u rre n t NAME ÌÍXPN0 J’ROCNO F2 - A c q u i s i t i o n P a rn e ti r;a te _ 2010040b T im e INSTRUM av500 r>R0BHD 3CII M u l t i n u c l zq PULPROG TD 65536 SOLVENT C DC13 US 16 DS 3WH 0 0 0 F ID R E S 5 AQ 0 1 b RG 0 0 DK I3E 0 3 IE 0 0 0 0 i Cl 0 0 0 0 1C R EST 1CWRK 0 0 0 : 1 CHANNEL f l IJUC1 !?1 PL1 :iF l IT2 aI sr new sss LB IỈB PC l| V 6.9 II aAìl ii 6.8 6.7 6.6 6.5 II' 1L TTmTrT 6.4 6.3 L_ V— ry rrrrrrrrrp 6.2 6.1 6.0 5.9 5.8 JI j T ^-IT T T -ÌT m T ỊrT T T T rT T IỴ rm T T -rnỴ T 5.7 D a ta P a r a n ie t e r s CU0NG_V12*V11 1 5.6 5.5 5.4 5.3 ppm Ị \ I 1H -3 0 ( 0 3 0 : P r o c e s s in g p a r a :n e te : 32766 0 0 : EM 0 1 0 D U O N G - V 1— C D C - H p lv i COm CO CO cn CD T rr rH o CO C\J r l o Ch CD CO O) (O r « I rn f»i CO r o f»i (N f\’ (\ H c>ỉ CN f CN CN r j *o o 'X' m rH o o ƯS CO CO H ri H H H o CVJ O J C J C N o j fv c u> CD CO o r- r* r- '.N r j (N (N r j H o VJC- «—I 00 u? U-, o o o rH C u rre n t IJA.ME EXPNO PROCNO r -i r -i r -i «H D a ta P a r a m e t e r s DU0NG_V21 1 F2 - A c q u i s i t i o n P a z n e ti U a te ^ 20100412 rim e :n s tr u m av500 PROBHD :rcn M u l t i i m c l t’ULPROG zg30 TD 65536 SOLVENT CDC13 US 16 DS SWH F ID R E S AQ RG CK 0 0 0 0 5 8 0 1 0 0 6.00 HE :iC R £ s r 1CWRK 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 CHANNEL f l PI PL1 SF01 1-2 31 3F WDK :3SB LB GB PC 2.5 2.4 2.3 2.2 2.1 ý 2.0 1.9 1.8 k ; 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 ^ 1.0 J ppm — -3 0 0 3 0 P ro o e a a in y p a m e te 32768 0 0 EM 0 0 0 I I .180 DUONG-V21-CDC13-1H r*; CD r*!«*» C Or»- O NkD o «HC O1-4 Oj C Oa) C T I o o rH r*“ op ko Is* Lí' ro ro r- C Op- w o vo LOTT r-1 o ơ> (30 o.*>t> V C *L T ) rr rv»C Mr'l o O Nu> TT to !"» ■ »rj (N Híò C Mt-HrHo r- r - r - r * i n LTj LD m LO LO i n *7 CO CO CO Iv i m m »v i CO (N f J CN r-j f J CN ì ơ> t CA o.:i 0Ũ CO o:« cr; CO O j CO r * r* r* r - C O CllO ro I'*')ro r^j C OC Orõ C Orõ cõ C Orõ co co C Orỏ fõ ro r*>C OC Or*i oi C Of J C Mc-j (N C N('-Õ(Nrj C OC Nr j C NC N JC O(Nc-j C u r r a n t D a ta P a r a m e t e r s NAME DUONG_V21 IỈXPNO PROCNO K2 - A c q u is itio n P arap et! C a te _ rim e INSTRUM PROBHD PULPROG 20100412 av 0 ncti M u l t i i m c l ay 65536 C DC13 16 IB SOLVENT IIS DS 01 0 0 0 SW H FIDRES AQ RC- cv; CE FO R EST MCWRK 5U8 0 1 0 0 6.00 1.00000000 0 0 0 0 0 0 0 I 1 I : ! i CHANNEL f l IJUC1 P i PL1 1JF01 l'Z 1H I -3 0 ( 0 3 0 : P ro c e s s in g p a :n e te : 3276b 0 0 : EM 0I 0 1.00 TT 4.2 Ị J T4.1 4.0 3.9 3.8 3.7 \ J 3.6 3.5 k A 3.4 3.3 3.2 3.1 3.0 2.9 2.8 2.7 A o; / r- ppm D U O N G —V — C D C — 1H I" rH Ơ Ì vx> *Mo nr rg o C DU *J (N CO w o