SỔ TAY XÉT NGHIỆM BỆNH TRUYỀN NHIỄM

BỘ Y TẾ CỤC Y TẾ DỰ PHÒNG SỔ TAY XÉT NGHIỆM BỆNH TRUYỀN NHIỄM Tập I (Ban hành kèm theo Quyết định số 217 /QĐ-DP ngày 02 tháng 12 năm 2016 Cục trưởng Cục Y tế dự phòng) Hà Nội, 2016 Chủ biên: ThS Nguyễn Minh Hằng Ban soạn thảo: TS Nguyễn Xuân Tùng ThS Trần Thị Thu Hương ThS Phạm Thị Thu Hằng PGS.TS Vũ Thị Quế Hương ThS Nguyễn Ngọc Hưng ThS Nguyễn Bảo Triệu TS Nguyễn Thu Hương TS Nguyễn Thị Hương Bình TS Đào Tuyết Trinh ThS Võ Minh Hiển ThS Hà Thị Cẩm Vân TS Phan Thị Thu Hương Tổ biên tập: TS Trịnh Xuân Tùng ThS Nguyễn Thị Phương Chi BS Nguyễn Thị Phương Thảo CN Đỗ Thị Thu MỤC LỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT F BỆNH CÚM I Mô tả chung II Yêu cầu chung 1 Nhân Cơ sở vật chất, trang thiết bị Bảo đảm chất lượng xét nghiệm Đọc đánh giá kết Thực xác nhận lại giá trị sử dụng phương pháp xét nghiệm III Phương pháp xét nghiệm cúm Phạm vi áp dụng Nguyên lý phương pháp xét nghiệm An toàn sinh học Thực xét nghiệm Phiên giải kết xét nghiệm 15 IV Tài liệu tham khảo 16 BỆNH RUBELLA 17 I Mô tả chung 17 II Yêu cầu chung 17 Nhân sự: 17 Cơ sở vật chất, trang thiết bị 18 Đảm bảo chất lượng xét nghiệm 19 Đọc đánh giá kết quả: 20 Thực xác nhận lại giá trị sử dụng phương pháp xét nghiệm 21 III Phương pháp xét nghiệm 21 Xét nghiệm huyết học phát kháng thể IgM đặc hiệu vi rút Rubella kỹ thuật ELISA 21 Phương pháp xét nghiệm RT-PCR phát ARN vi rút Rubella 24 A IV Tài liệu tham khảo 28 BỆNH SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE 29 I Mô tả chung 29 II Yêu cầu chung 29 Nhân 29 Cơ sở vật chất, trang thiết bị 29 Bảo đảm chất lượng xét nghiệm 30 Đọc đánh giá kết 32 Thực xác nhận lại giá trị sử dụng phương pháp xét nghiệm 32 III Phương pháp xét nghiệm 33 Phương pháp xét nghiệm nhanh phát kháng nguyên vi rút Dengue (NS1) 34 Phương pháp xét nghiệm nhanh phát kháng thể kháng vi rút Dengue (IgM, IgG) 35 Phương pháp xét nghiệm ELISA phát kháng nguyên vi rút Dengue (NS1) 39 Phương pháp xét nghiệm ELISA phát kháng thể IgM/ IgG virút Dengue 43 Phương pháp xét nghiệm bán lồng RT-PCR (semi-nested RTPCR) chẩn đoán định týp vi rút Dengue 46 Phương pháp xét nghiệm đa mồi realtime RT-PCR (Mutiplex realtime RT-PCR) chẩn đoán định týp vi rút Dengue 54 IV Tài liệu tham khảo 58 BỆNH SỞI 61 I Mô tả chung 61 II Yêu cầu chung 61 Nhân sự: 61 Cơ sở vật chất, trang thiết bị 61 Đảm bảo chất lượng xét nghiệm 62 Đọc đánh giá kết quả: 64 Thực xác nhận lại giá trị sử dụng phương pháp xét nghiệm 64 B III Phương pháp xét nghiệm 65 Xét nghiệm huyết học phát kháng thể IgM đặc hiệu vi rút sởi kỹ thuật ELISA 65 Phương pháp xét nghiệm RT-PCR phát ARN vi rút Sởi 68 IV Tài liệu tham khảo 72 BỆNH TAY CHÂN MIỆNG 73 I Mô tả chung 73 II Yêu cầu chung 73 Nhân 73 Bảo đảm chất lượng xét nghiệm 74 Đọc đánh giá kết 76 Thực xác nhận lại giá trị sử dụng phương pháp xét nghiệm 76 III Phương pháp xét nghiệm tay-chân-miệng phương pháp chẩn đoán RT-PCR 76 Phạm vi áp dụng 77 Nguyên lý 77 An toàn sinh học 77 Thực xét nghiệm 77 Phiên giải kết xét nghiệm 81 IV Tài liệu tham khảo 82 BỆNH DO VI RÚT ZIKA 83 I Mô tả chung 83 II Yêu cầu chung 83 Nhân 83 Cơ sở vật chất, trang thiết bị 83 Bảo đảm chất lượng xét nghiệm 84 Đọc đánh giá kết 86 Thực xác nhận lại giá trị sử dụng phương pháp xét nghiệm 86 III Phương pháp xét nghiệm xác định vi rút Zika RT-PCR realtime RT-PCR 87 Phạm vi áp dụng 87 C Nguyên lý 87 An toàn sinh học 87 Thực xét nghiệm 88 Phiên giải kết xét nghiệm 93 IV Tài liệu tham khảo 94 BỆNH SỐT RÉT 96 I Mô tả chung 96 II Yêu cầu chung 96 Nhân 96 Cơ sở vật chất, trang thiết bị 96 Bảo đảm chất lượng xét nghiệm 98 Đọc đánh giá kết 100 Thực xác nhận lại giá trị sử dụng phương pháp xét nghiệm 100 III Phương pháp xét nghiệm 100 Phương pháp xét nghiệm lam máu nhuộm giêm sa soi kính hiển vi quang học 101 Kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán nhanh phát sốt rét (Rapid diagnostic Test - RDTs) 110 Phương pháp xét nghiệm xác định loài ký sinh trùng sốt rét P falciparum, P vivax, P malariae, P ovale gây bệnh cho người mẫu máu kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase đa mồi bán lồng (Seminested Multiplex PCR) 114 Phương pháp xác định loài ký sinh trùng sốt rét P.falciparum, P.vivax, P malariae, P.ovale gây bệnh người kỹ thuật PCR lồng (Nested PCR) 123 Phương pháp xét nghiệm xác định loài ký sinh trùng sốt rét P falciparum, P vivax, P malariae, P ovale gây bệnh cho người mẫu máu kỹ thuật realtime PCR 129 IV Tài liệu tham khảo 135 BỆNH VIÊM MÀNG NÃO DO NÃO MÔ CẦU 137 I Mô tả chung 137 D II Yêu cầu chung: 137 Nhân 137 Cơ sở vật chất, trang thiết bị 138 Bảo đảm chất lượng xét nghiệm 139 Đọc đánh giá kết 140 Thực xác nhận lại giá trị sử dụng phương pháp xét nghiệm: 140 III Phương pháp xét nghiệm 140 Phương pháp chẩn đoán nhanh (RDT): 141 Phương pháp nhuộm Gram soi kính hiển vi 144 Phương pháp nuôi cấy 146 Phương pháp cấy máy tự động (ví dụ máy BATEC) 148 Phương pháp định danh vi khuẩn N meningitidis dựa vào tính chất sinh vật hóa học 150 Định danh vi khuẩn N meningitidis máy định danh tự động (ví dụ máy Malditof) 154 Định danh vi khuẩn N meningitidis máy định danh tự động (ví dụ Vitek Compac) 156 Xét nghiệm realtime PCR 158 IV Tài liệu tham khảo 161 E NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT µl Micro lít AND Axít Deroxyribonucleic ATSH An toàn sinh học Base Pair – bp Cặp nucleic Centers for Disease Control and Trung tâm kiểm soát phòng ngừa dịch Prevention – CDC bệnh Hoa Kỳ Complementary DNA – cADN ADN bổ sung từ khuôn ARN nhờ enzyme phiên mã ngược dATP Deoxyadenosine triphosphate / nucleicA dCTP Deoxycytidine triphosphate / nucleic C dd Dung dịch dGTP Deoxyguanosine triphosphate / nucleic G dNTP Là tên chung Deroxyribonucleic triphosphate ngồm dATP, dCTP, dGTP, dTTP dTTP Deoxythymidine triphosphate / nucleic T KST Ký sinh trùng; KSTSR Ký sinh trùng sốt rét; Mock Chứng âm chiết tách Negative Control – NC Chứng âm phản ứng PXN Phòng xét nghiệm Polymerase Chain Reaction - PCR Phản ứng chuỗi polymerase Positive Control – PC Chứng dương Reverse Transcription Polymerase Phản ứng phiên mã ngược-khuếch đại Chain Reaction - RT-PCR chuỗi RNA Axít ribonucleic SHPT Sinh học phân tử Standard Operating Proceduce - SOP Quy trình kỹ thuật chuẩn TCM Bệnh tay-chân-miệng Victorian Infectious Diseases Phòng thí nghiệm tham chiếu bệnh Reference Laboratory - VIDRL truyền nhiễm Victoria, Melbourne –Úc VRĐR Vi rút đường ruột World Health Organization - WHO Tổ Chức Y tế giới F BỆNH CÚM (Influenza) Bệnh truyền nhiễm thuộc nhóm B Luật Phòng, chống bệnh truyền nhiễm I Mô tả chung Cúm bệnh truyền nhiễm cấp tính lây theo đường hô hấp, vi rút cúm A,B,C gây nên Bệnh khởi phát đột ngột hội chứng nhiễm trùng nhiễm độc, hội chứng viêm long đường hô hấp Bệnh hay gây biến chứng đường hô hấp dễ phát thành dịch Tại Việt Nam, hội chứng cúm xảy quanh năm, có tỷ lệ mắc đứng đầu 10 bệnh truyền nhiễm cấp tính Vi rút cúm thuộc họ Orthomyxoviride, gồm năm chi: vi rút cúm A, vi rút cúm B, vi rút cúm C, vi rút Isa vi rút Thogoto Vi rút cúm có hình cầu, hình sợi, kích thước khoảng 80 - 100 nm, dễ bị diệt nhiệt độ thông thường, chịu đựng tốt nhiệt độ thấp Các vi rút cúm có loại kháng nguyên: Kháng nguyên S (Soluble), Kháng nguyên H (Hemagglutinin), Kháng nguyên N (Neuraminidase) Cấu trúc gen vi rút cúm ARN sợi đơn bao bọc Glycoprotein, kháng nguyên H N thành phần vỏ vi rút cúm Hai kháng nguyên H N định đến khả gây bệnh virus cúm mang tính đặc hiệu týp Tuy nhiên, cấu trúc H N lại thay đổi thành H N Hiện phát 18 cấu trúc kháng nguyên H, ký hiệu từ H1 đến H18 cấu trúc kháng nguyên N ký hiệu từ N1 đến N9 II Yêu cầu chung Nhân - Có 02 cán có chuyên môn phù hợp đào tạo kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán cúm - Tất nhân viên kỹ thuật xét nghiệm cần đào tạo sử dụng trang thiết bị, đào tạo thực hành an toàn sinh học (ATSH) thực hành vi sinh chuẩn, đào tạo đảm bảo chất lượng xét nghiệm Nhân viên phòng xét nghiệm đào tạo nội dung đánh giá lực định kỳ - Nhân viên sau đánh giá có kết đạt tiếp tục giám sát - tháng trước thức thực xét nghiệm độc lập - Người nhận định phê duyệt kết xét nghiệm: cán có trình độ đại học sau đại học, có kinh nghiệm công tác lĩnh vực xét nghiệm từ năm trở lên - Thực tiêm chủng cúm định kỳ cho nhân viên phòng xét nghiệm Cơ sở vật chất, trang thiết bị 2.1 Cơ sở vật chất: - Phòng xét nghiệm cần đáp ứng điều kiện an toàn sinh học, hệ thống quản lý chất lượng phòng xét nghiệm (PXN) theo quy định hành 3.5.3 Ghi chép báo cáo - Hoàn thành biểu mẫu kết chẩn đoán viêm màng não mô cầu phương pháp nuôi cấy truyền thống - Nhập kết xét nghiệm vào sổ theo dõi - Nhập kết vào máy tính chuyển vào hồ sơ tổng hợp - Người kiểm tra kiểm tra lại kết trước báo cáo người phụ trách PXN Phương pháp cấy máy tự động (ví dụ máy BATEC) 4.1 Phạm vi áp dụng : Xét nghiệm từ máu, dịch não tủy nuôi cấy máy tự động 4.2 Nguyên lý : Trong chai cấy máu Bactec có môi trường tối ưu hóa cho mầm bệnh tương ứng phát triển Khi vi khuẩn tăng sinh thực trình trao đổi chất, thải khí Carbonic (CO2) vào môi trường Lượng CO2 phản ứng với chất nhuộm huỳnh quang có sẵn chai huỳnh quang phát hấp thu phận cảm biến ánh sáng (Photo Detector) Tính hiệu nhận truyền tới máy tính để phân tích Mức phát quang tương ứng với hàm lượng CO2 vi sinh vật thải môi trường Khi đạt đến hàm lượng CO2 định (theo thông số mẫu dương tính cài trước), máy báo dương Nếu vi sinh vật phát triển, máy không phát tăng nồng độ CO2 chai cấy máu báo âm tính sau thời gian định (đã cài đặt trước) 4.3 An toàn sinh học Thực theo yêu cầu mục 3.3, Phần III, nhóm bệnh 4.4 Thực xét nghiệm 4.4.1 Mẫu bệnh phẩm - Máu tĩnh mạch: 8ml đến 10ml (trong trường hợp đặc biệt lấy - 10 ml máu) - Dịch não tủy: từ 3ml đến 5ml a Chuẩn bị mẫu máu: - Lấy máu vòng 15 phút sau có giấy xét nghiệm tới Kỹ thuật lấy máu sau: + Chọn vị trí lấy máu: chọn tĩnh mạch rõ nhất, thông thường lấy tĩnh mạch nếp gấp khuỷu tay, mu bàn tay cổ tay + Buộc dây ga rô để xác định vị trí lấy máu, tháo dây ga rô, sát khuẩn lại tay dung dịch sát khuẩn tay nhanh + Dùng kẹp lấy thấm cồn - iod sát khuẩn da nơi lấy máu theo hình xoáy ốc từ ngoài, tạo vùng có đường kính khoảng cm Thời gian sát khuẩn phải từ 30 giây đến phút Để khô tự nhiên - phút + Không chạm lại vào vùng sát khuẩn + Bật nắp bảo vệ chai máu, sát khuẩn nút chai cồn 70%, để khô (không sử dụng iod để sát khuẩn nút chai) + Đeo găng tay y tế, lấy bơm tiêm vô trùng đâm nhanh mũi kim vào tĩnh mạch, hút đủ lượng máu cần: - 10 ml 148 + Tháo dây ga rô, căng da, rút nhanh kim Cầm máu vết chích - Thay đầu kim lấy thuốc với kích thước 18, bơm máu vào chai PLUS Aerobic/F Culture Vial, lắc nhẹ chai cho máu khỏi đông - Ghi tên, tuổi, khoa phòng, số giường, ngày cấy lên chai cấy máu b Chuẩn bị bệnh phẩm dịch não tủy - Khi tiếp nhận bệnh phẩm, lắc bệnh phẩm - Dùng bơm tiêm hút 3ml - ml bơm vào chai cấy, lắc nhẹ chai cho bệnh phẩm trộn môi trường - Ghi tên, tuổi, khoa phòng, số giường, ngày cấy lên chai cấy c Vận chuyển bảo quản bệnh phẩm cấy máu, dịch não tủy - Chuyển chai cấy khoa xét nghiệm - Ghi tên, tuổi, khoa phòng, số giường, chẩn đoán, mã bệnh phẩm, ngày cấy vào sổ cấy Ghi mã bệnh phẩm lên chai cấy 4.4.2 Hóa chất, vật tư tiêu hao - Dụng cụ lấy bệnh phẩm máu: bơm tiêm, kim tiêm, vô khuẩn, cồn sát khuẩn, dây ga rô - Găng tay - Bút viết đánh dấu - Chai cấy máu BactecTM Plus Aerobic/F Culture Vial 4.4.3 Các bước tiến hành - Cho chai vào máy theo hướng dẫn nhà sản xuất - Nếu thời gian chờ đợi trước cho chai vào máy cấy tiếng, bảo quản 20h 35oC 48h 20 – 25oC Không bảo quản tủ lạnh - Sau thời gian định máy báo dương âm hình hiển thị dấu “+” “–” vị trí chai máu tương ứng tối đa ngày không kể ngày cấy Với chai báo dương: + Lấy chai báo dương, quét mã vạch, nhấn “OK”, lấy chai máu khỏi máy cấy máu + Cấy đĩa thạch máu chocolate bơm tiêm 1ml vô trùng phết lam nhuộm Gram soi thấy cầu khuẩn Gram âm + Tiệt trùng que cấy lửa đèn cồn, để nguội cấy phân vùng (4 vùng) + Tiệt trùng que cấy + Cho đĩa thạch vào tủ ấm 37oC, CO2 % (một số vi khuẩn không cần CO2 5% cần dựa vào kết nhuộm Gram cặn để định hướng), 18 - 24h sau nhận định vi khuẩn (nếu có) theo dõi từ 24h - 48h 4.5 Phiên giải kết xét nghiệm 4.5.1 Đọc kết xét nghiệm Sau ngày nuôi cấy máy báo âm tính, trả kết quả: “Không có vi khuẩn gây bệnh” Nếu máy báo dương tính, thực nhận định kết bên để khẳng định hình thể khuẩn lạc 149 4.5.2 Nhận định kết xét nghiệm Thực nuôi cấy mẫu máy báo dương tính đĩa thạch nhuộm Gram: - Nhận định khuẩn lạc dạng S, tròn , nhẵn, kích thước khoảng 0,5 – 1,0 mm, không màu xám nhạt - Nhận định hình thể, cách xếp vi khuẩn, tính chất bắt màu Từ đó, để định hướng cho định danh làm kháng sinh đồ vi khuẩn 4.5.3 Ghi chép báo cáo - Hoàn thành biểu mẫu kết chẩn đoán viêm màng não mô cầu phương pháp nuôi cấy tự động - Nhập kết xét nghiệm vào sổ theo dõi - Nhập kết vào máy tính chuyển vào hồ sơ tổng hợp - Người kiểm tra kiểm tra lại kết trước báo cáo người phụ trách PXN Phương pháp định danh vi khuẩn N meningitidis dựa vào tính chất sinh vật hóa học Đây phương pháp đinh danh dựa vào tính chất sinh vật hóa học API NH tương đương 5.1 Phạm vi áp dụng Xét nghiệm nhằm định danh vi khuẩn N meningitidis API NH dựa vào tính chất sinh vật hóa học (SVHH) từ khuẩn lạc môi trường nuôi cấy 5.2 Nguyên lý: Thanh API NH gồm có 10 ống nhỏ chứa môi trường đông khô, ống nhỏ có khả làm 12 test định danh (các phản ứng enzym hay lên men đường) phát penicillinase Trong trình ủ, chất chuyển hoá tạo thay đổi màu cách tự động biểu thêm thuốc thử 5.3 An toàn sinh học Thực theo yêu cầu mục 3.3, Phần III, nhóm bệnh 5.4 Thực xét nghiệm 5.4.1 Mẫu - Khuẩn lạc nuôi cấy từ 18 đến 24 giờ, có dạng S, tròn , nhẵn, kích thước khoảng 0,5 – 1,0 mm, không màu xám nhạt Yêu cầu: Khuẩn lạc nhất, không bị nhiễm nhiều loại khuẩn lạc Khuẩn lạc không đạt yêu cầu không - Chuẩn bị vi khuẩn Trước sử dụng API NH, chuẩn bị hỗn dịch tương đương 4McFarland việc cần thiết để thực nuôi cấy Sử dụng môi trường điều kiện giàu CO2 từ 18 – 24 36oC ± 2oC (để enzym vi khuẩn biểu tốt API NH) để nuôi cấy 5.4.2 Hóa chất, vật tư tiêu hao - Thuốc thử + Độ đục chuẩn Mcfarland 150 + Dầu parafin - Môi trường API NaCl 0.85% (2ml) + ống chất thử JAMES + ống chất thử ZYM B + Thanh định danh API NH 5.4.3 Các bước tiến hành - Chuẩn bị API NH + Chuẩn bị hộp ủ ( khay nắp) + Ghi số bệnh phẩm vành có hình thon dài khay (Không ghi số nắp bị xoá suốt trình tiến hành xét nghiệm) + Lấy khỏi bao gói riêng + Đặt vào tủ ủ + Loại bỏ chất làm khô + Mở ống môi trường API NaCl 0.85% ( 2ml) - Dùng tăm-bông, lấy vài khuẩn lạc nuôi cấy chuẩn bị hỗn hợp dịch với độ đục tương đương McFarland, đảm bảo hỗn dịch trộn kỹ Yêu cầu sử dụng khuẩn lạc cấy (trước 18 – 24 giờ) Hỗn hợp dịch phải sử dụng sau pha chế - Đưa hỗn hợp dịch pha chủng vi khuẩn - Đưa hỗn dịch vi khuẩn vào tuýp, tránh tạo bọt khí - Cho hỗn dịch vào giếng giếng (từ test PEN đến test URE): khoảng 50l, - Cho vào giếng phần hình chén giếng cuốiLIP/ProA, PAL/GGT, GAL/IND : khoảng 150 l tránh làm mặt khum chất lỏng bị lồi - Phủ test (từ PEN đến URE) với dầu parafine (những test gạch chân) Lưu ý: Chất lượng lần cho vào quan trọng: Các tuýp đầy tràn hay không đủ gây kết dương tính giả âm tính giả - Đóng hộp ủ; Ủ vòng – 2.5 nhiệt độ 36oC ± 2oC môi trường hiếu khí 5.5 Phiên giải kết xét nghiệm 5.5.1 Đọc kết xét nghiệm a) Việc đọc kết thực theo hướng dẫn nhà sản xuất: - Sau giai đoạn ủ, đọc kết dựa vào Bảng đọc Bản hướng dẫn + Đọc phản ứng tự phát ghi kết dương tính (+) âm tính (–) bảng kết Cảnh báo: giếng cuối có chức thực phản ứng giếng: - Giếng (phản ứng tự phát)/ (phản ứng sau thêm thuốc thử) 151 - Giếng (phản ứng tự phát)/ (phản ứng sau thêm thuốc thử) - Giếng 10 (phản ứng tự phát)/ (phản ứng sau thêm thuốc thử) + Các kết phản ứng , phải ghi trước thêm thuốc thử + Thêm giọt thuốc thử ZYM B vào giếng 9:LIP/ProA, PAL/GGT, - Thêm giọt thuốc thử JAMES vào giếng 10: GAL/IND b) Đọc tất phản ứng - Đọc vòng phút theo bảng đọc kết bảng hướng dẫn ghi kết vào bảng kết - Trước định danh ô định danh có màu tương ứng cột “Âm tính”, kết dương tính cho màu tương ứng giống cột “Dương tính” bảng bên Bảng Bảng đọc kết Xét nghiệm Thành phần Số lượng Phản ứng/ Enzym Kết Dương Âm tính tính Xanh da Màu vàng, trời vàng xanh, (không có (có penicillina penicilliase se) ) đỏ đỏ – vàng Vàng da cam 1/36 PENcilliase 1) PEN Potassium benzylpenc illin 2) GLU 3) FRU 4) MAL 5) SAC D-glucose D-fructose D-maltose Dsaccharose (sucrose) 0.5 0.1 0.1 0.5 L-orithine 0.552 axít hóa (GLUcose) axít hóa (FRUtose) axít hóa (MALtose) axíthóa(SAC charose) Orithine vàng – Decarboxyla xanh se lam xám UREase Vàng LIPase không màu xám nhạt ALkaline không Phosphatase màu 6) ODC 7) URE 8a) 9a) Ure 0.41 5-bromo-3- 0.033 indoxylcaprate 40.038 nitrophenyl 152 xanh da trời vàng – tím xanh da trời (+ kết tủa) vàng Xét nghiệm 10a) 8b) 9b) 10b) Thành phần Số lượng -phosphate 2CHA 40.04 nitrophenyl -βDgalactopyra noside proline-40.056 methoxylβnaphylamid e -glutamyl- 0.049 4methoxylβnaphylamid e Ltrytophane 0.036 Phản ứng/ Enzym Kết Dương Âm tính tính xám nhạt βDgalactosidas e không màu Proline Arylamidase LIP dương tính, ProA âm tính Gamma Glutamyl Transferase ZYM B/ vàng phút vàng nhạt (nâu Da cam LIP +) INDole vàng vàng nhạt (vàng-da cam PAL +) không màu Vàng ZYM B/ phút da cam ZYM B/ phút hồng - Nếu phản ứng dương tính (màu xanh), phản ứng âm tính dù thuốc thử ZYM B thêm vào không - Nếu vòng ủ, số phản ứng (lên men, pencillinase) nghi ngờ, ủ lại thêm đọc lại kết phản ứng (xét nghiệm enzym không cần đọc lại trường hợp này) 5.5.2 Nhận định kết xét nghiệm - Phân tích kết Việc định danh thực việc mô tả tóm lược số sau: Trên giếng kết quả, test chia làm nhóm có giếng, giá trị 1,2 đưa cho giếng Bằng việc cộng giá trị tương ứng với giếng cho phản ứng dương tính nhóm, ta có dãy số gồm số Cảnh báo: không tập hợp test (Pencillinase) Nhóm chứa test GLU – FRU – MAL - Kết xác nhận sau nhập mã nhận dạng vào Với phần mềm định danh apiwebTM, thiết bị ATBTM mini API - Đánh vào số tìm bàn phím hình 153 5.5.3 Ghi chép báo cáo - Hoàn thành biểu mẫu kết định danh viêm màng não mô cầu phương pháp sinh vật hóa học - Nhập kết xét nghiệm vào sổ theo dõi - Nhập kết vào máy tính chuyển vào hồ sơ tổng hợp - Người kiểm tra kiểm tra lại kết trước báo cáo người phụ trách PXN Định danh vi khuẩn N meningitidis máy định danh tự động (ví dụ máy Malditof) 6.1 Phạm vi áp dụng : Xét nghiệm nhằm định danh vi khuẩn N meningitidis máy định danh tự động Malditof từ khuẩn lạc môi trường nuôi cấy 6.2 Nguyên lý : Mỗi loài sinh vật có thành phần protein ribosome đặc trưng cho riêng loài đó, gọi dấu ấn phân tử (molecula fingerprint) loài Máy MALDI Biotyper sử dụng công nghệ MALDI-TOF MS để gây ion hóa thu nhận protein / peptide từ mẫu cần định danh, sau biểu diễn chúng dạng phổ khối lượng (hay gọi khối phổ - mass spectrum) Bằng cách so sánh khối phổ thu với phổ tham chiếu có sẵn thư viện liệu, máy MALDI Biotyper cho kết định danh xác loài vi sinh vật 6.3 An toàn sinh học Thực theo yêu cầu mục 3.3, Phần III, nhóm bệnh 6.4 Thực xét nghiệm 6.4.1 Mẫu - Khuẩn lạc nuôi cấy từ 18 đến 24 giờ, có dạng S, tròn , nhẵn, kích thước khoảng 0,5 – 1,0 mm, không màu xám nhạt - Yêu cầu: Khuẩn lạc thuần, riêng rẽ, không bị nhiễm nhiều loại khuẩn lạc Khuẩn lạc không đạt yêu cầu không riêng rẽ bị nhiễm từ đến loại khuẩn lạc - Chuẩn bị mẫu: Mẫu khuẩn lạc nên mẫu tươi 6.4.2 Thuốc thử, hóa chất, vật tư tiêu hao - Bruker HCCA matrix portioned - Bruker Bacterial Test Standard (BTS) - Axit formic tinh khiết 99-100% - Acetonitrile tinh khiết 99-100% - Axit trifluoroacetic (TFA) tinh khiết 99-100% - Ethanol tinh khiết 99-100% - Nước siêu tinh khiết Chuẩn bị hóa chất - “Stock Solution” – Dung môi dùng cho HCCA Matrix Bruker Test Standard (BTS) + Lấy tuýp Eppendorf cho vào 475 μL nước siêu tinh khiết, 500 μL Acetonitrile (ACN) 100% 25 μL Trifluoracetic acid 100% (TFA) 154 + Trộn vortex Như ta có ml hỗn hợp, gọi “stock solution” Stock solution bảo quản nhiệt độ phòng - HCCA Matrix + Lấy tuýp HCCA Matrix, cho vào 250 μL stock solution + Vortex nhiệt độ phòng thu dung dịch suốt (tất tinh thể HCCA hòa tan, nồng độ cuối 10 mg HCCA/ml) - Bruker Test Standard (BTS) + Lấy tuýp BTS, cho vào 50 μL stock solution Thực pipetting 20 lần nhiệt độ phòng, tránh tạo bọt + Để nhiệt độ phòng phút, sau lại pipetting 20 lần, tránh tạo bọt + Nếu dung dịch đục, thực quay ly tâm phút với tốc độ 13000 rpm nhiệt độ phòng + Dung dịch BTS sau pha xong chia nhỏ làm nhiều tuýp (chẳng hạn chia làm 10 tuýp, tuýp μL) bảo quản nhiệt độ -18oC Nếu thao tác chuẩn bị tốt, dung dịch BTS bền tháng điều kiện bảo quản nêu 6.4.3 Các bước tiến hành - Bước 1: Phết khuẩn lạc lên vị trí (spot) đĩa MALDI target Lưu ý phết lượng nhỏ khuẩn lạc (vừa đủ nhìn thấy), sử dụng tăm tiệt trùng (toothpicks) để phết Để mẫu khô nhiệt độ phòng - Bước 2: Cho μL dung dịch HCCA Matrix lên vị trí mẫu để khô nhiệt độ phòng, sau đưa đĩa MALDI Target vào máy MALDI Biotyper để thực định danh 6.5 Phiên giải kết xét nghiệm 6.5.1 Đọc kết xét nghiệm Bảng Phiên giải kết Giá trị Phiên giải 2.000 … 3.000 Độ tin cậy cao 1.700… 1.999 Độ tin cậy trung bình 0.000…1.699 Không tin cậy - Kết mức xanh lục ứng với giá trị ≥2: Độ tin cậy cao, xác đến cấp độ loài (species) - Kết mức vàng ứng với giá trị ≥1.7 ≤1.999 : Độ tin cậy trung bình, có kết xác cấp độ chi (genus) - Kết mức đỏ ứng với giá trị < 1.7 : Không có kết định danh kết không tin cậy 6.5.2 Nhận định kết xét nghiệm Dựa vào phần mềm máy Malditof để xác nhận kết 6.5.3 Ghi chép báo cáo - Hoàn thành biểu mẫu kết định danh vi khuẩn viêm màng não mô cầu phương pháp định danh tự động - Nhập kết xét nghiệm vào sổ theo dõi 155 - Nhập kết vào máy tính chuyển vào hồ sơ tổng hợp - Người kiểm tra kiểm tra lại kết trước báo cáo người phụ trách PXN Định danh vi khuẩn N meningitidis máy định danh tự động (ví dụ Vitek Compac) 7.1 Phạm vi áp dụng: Xét nghiệm nhằm hướng đến định danh vi khuẩn N meningitidis máy định danh tự động Vitek Compac từ khuẩn lạc môi trường nuôi cấy 7.2 Nguyên lý : Dùng phương pháp đo màu để nhận biết tính chất sinh vật hoá học vi sinh vật thông qua thay đổi màu giếng môi trường có sẵn cạc định danh Máy giám sát phát triển hoạt tính vi sinh vật bên giếng thẻ xét nghiệm Bộ phận quang học sử dụng ánh sáng nhìn thấy để đánh giá trực tiếp phát triển vi sinh vật Bộ phận quang học dựa đọc ánh sáng ban đầu giếng trước bắt đầu có phát triển Máy đọc 15 phút/ lần để đo phát triển vi khuẩn giếng Phần mềm so sánh kết thu với sở liệu để đưa kết 7.3 An toàn sinh học Thực theo yêu cầu mục 3.3, phần III, nhóm bệnh 7.4 Thực xét nghiệm 7.4.1 Mẫu - Khuẩn lạc nuôi cấy từ 18 đến 24 giờ, có dạng S, tròn , nhẵn, kích thước khoảng 0,5 – 1,0 mm, không màu xám nhạt - Yêu cầu: Khuẩn lạc riêng rẽ, không bị nhiễm nhiều loại khuẩn lạc Khuẩn lạc không đạt yêu cầu không riêng rẽ bị nhiễm từ đến loại khuẩn lạc 7.4.2 Hóa chất, vật tư tiêu hao - Cạc định danh NH (Nesseria/Haemophilus) - Nước muối vô trùng 0,45% 7.4.3 Các bước tiến hành Quy trình định danh máy VITEK - compact theo hướng dẫn nhà sản xuất gồm bước sau: - Chuẩn bị Worksheet cho cassette (ghi thông tin cần biết bệnh nhân tên, tuổi, lab ID…): Vào “Enter casette manager” - chọn “Setup tests post entry” - chọn Print - chọn “Blank cassette worksheet” - nhấn OK để in - Chuẩn bị cạc: Lấy cạc khỏi tủ lạnh để nhiệt độ phòng khoảng 15 phút - Chuẩn bị ống làm định danh: Lấy ml nước muối 0,45 % từ Dispenser pha mẫu: Dùng que cấy lấy chủng cần định danh từ khuẩn lạc nhất, pha vào ống định danh Kiểm tra độ đục vi khuẩn máy 156 đo độ đục từ 2,7 đến 3,3 Mac Farland (McF) Ống cắm thứ tự vào casette Đầu hút card định danh cắm vào ống tương ứng - Nếu máy sẵn sàng (màn hình Start Fill OK): Mở cửa buồng hút, cho cassette vào đóng cửa buồng hút nhấn Start Fill - Khi đèn báo nhấp nháy (sau khoảng phút), hình báo “Transfer”, mở cửa buồng hút lấy cassette mở buồng vận hành cho cassette chứa cạc vào (bước không 10 phút) Đóng hai cửa Chú ý: không mở cửa trước mở buồng hút để tránh làm hỏng tất card chạy máy - Nhập thông tin cassette: Nếu bệnh phẩm làm định danh bôi đen hàng (GN), vào Define Isolate để nhập thông tin: ID lab, số vi khuẩn Vào Bench name để chọn tên người thực Nhấn Save cassette data để xác nhận; - Nhập thông tin bệnh nhân: Vào “View and Maintain Patient Information” (Biểu tượng hình người) Vào Add patient để thêm bệnh nhân Nhập thông tin có dấu * đỏ (bắt buộc) Nhấn Save để xác nhận 7.5 Phiên giải kết xét nghiệm 7.5.1 Đọc kết xét nghiệm Dữ liệu tự động ghi vào phần mềm máy tính Phần mềm phân tích kết xác định vi sinh vật dựa phản ứng sinh hóa Mức độ tin cậy Xuất sắc Rất tốt Tốt Chấp nhận Thấp Không xác định Bảng Kết định danh Các lựa chọn Xác suất Khuyến cáo 96 % – 99% 93% – 95% 89 % – 82% 85% – 88% Tổng phần loài có trăm = 100 sở giống Phân biệt test phụ 7.5.2 Nhận định kết xét nghiệm Nhận định phần mềm máy định danh tự động Vitek Compact để xác nhận kết 7.5.3 Ghi chép báo cáo - Hoàn thành biểu mẫu kết định danh viêm màng não mô cầu phương pháp định danh tự động - Nhập kết xét nghiệm vào sổ theo dõi - Nhập kết vào máy tính chuyển vào hồ sơ tổng hợp - Người kiểm tra kiểm tra lại kết trước báo cáo người phụ trách PXN 157 Xét nghiệm realtime PCR 8.1 Phạm vi áp dụng: Xét nghiệm xác định chẩn đoán viêm não mô cầu cách phát ADN vi khuẩn N meningitidis từ mẫu bệnh phẩm 8.2 Nguyên lý: Trong kỹ thuật gen (DNA) vi khuẩn Neisseria meningitidis khuyếch đại dựa trình tự DNA khuôn mẫu vi khuẩn Neisseria meningitidis diện bệnh phẩm qua lặp lại tiến trình gồm giai đoạn: biến tính (denaturation), gắn mồi (annealing) tổng hợp kéo dài (extension) với trợ giúp DNA polymerase chịu nhiệt, primers deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) Mẫu dò đoạn oliognucleotit (vd: Taqman probe) gắn với chất nhuộm phát tín hiệu huỳnh quang đầu 5’ (R), đầu gắn với thuốc nhuộm dập tắt huỳnh quang (Q) Khi mẫu dò nguyên vẹn, Q có vai trò nhận lượng phát từ R (hiệu ứng chuyển lượng huỳnh quang) Nếu có trình tự đích, mẫu dò mồi gắn vào khuôn, trình tổng hợp bắt đầu Trong trình tổng hợp, enzym Taq DNA polymerase với hoạt tính exonuclease cắt nucleotid mẫu dò từ đầu 5’, giải phóng R khỏi Q, làm tăng tín hiệu huỳnh quang R Càng nhiều sản phẩm tạo thành nhiều mẫu dò bị phân cắt tín hiệu R phát nhiều Mắt đọc tín hiệu huỳnh quang máy thu tín hiệu R, xử lý phần mềm đưa kết cuối 8.3 An toàn sinh học Thực theo yêu cầu mục 3.3, phần III, nhóm bệnh 8.4 Thực xét nghiệm 8.4.1 Mẫu bệnh phẩm Bệnh phẩm dịch não tủy, dịch ngoáy họng khuẩn lạc nuôi cấy từ bệnh phẩm bệnh nhân viêm não mô cầu a Tách chiết DNA từ mẫu Chứng âm nước cất hai lần (NFW) Tiến hành tách chứng âm đồng thời với bệnh phẩm khác - Bước 1: Hút 200 µl dung dịch lysis AL vào ống eppendorf 1,5 ml có sẵn 20 µl carrier ARN 20 µl proteinase K - Bước 2: Cho 200 µl bệnh phẩm vào ống eppendorf có chứa hỗn hợp Buffer AL - carrier RNA - proteinase K Trộn cách votex 15 giâyChú ý: Để đảm bảo cho trình ly giải đạt hiệu tối đa, trình votex phải làm cẩn thận - Bước 3: Ủ nhiệt độ 56oC 10 phút - Bước 4: Ly tâm nhẹ để đẩy dung dịch bám nắp ống xuống phía - Bước 5: Bổ sung thêm 200 µl ethanol (96 – 100%), trộn votex 15 giây Sau trộn, ly tâm nhẹ để đẩy lượng dung dịch nhỏ bám nắp ống xuống phía 158 - Bước 6: Cẩn thận chuyển toàn dung dịch bước lên cột lọc (đã có ống hứng loại ml dưới) Đóng nắp ly tâm 8000 vòng/phút phút Loại bỏ ống hứng có chứa dịch, chuyển cột lọc sang ống hứng - Bước 7: Mở nắp cột lọc cẩn thận, rửa 500 µl Wash buffer AW1 Đóng nắp ly tâm 8000 vòng/phút phút Loại bỏ ống hứng có chứa dịch, chuyển cột lọc sang ống hứng - Bước 8: Mở nắp cột lọc cẩn thận, rửa lại 500 µl Wash buffer AW2 Đóng nắp ly tâm 14000 vòng/phút phút Loại bỏ ống hứng có chứa dịch, chuyển cột lọc sang ống hứng - Bước 9: Đặt cột lọc vào ống hứng mới, ly tâm 14000 vòng/phút phút - Bước 10: Đặt cột lọc vào ống eppendorf 1,5 ml loại bỏ ống hứng có chứa dịch Mở nắp cột lọc cẩn thận cho 50 µl Elution buffer AE Đóng nắp ủ nhiệt độ phòng phút Ly tâm 8000 vòng/ phút phút 8.4.2 Sinh phẩm, hóa chất, vật tư tiêu hao a Sinh phẩm hóa chất - Vật tư + Bút đánh dấu + Ống eppendorf loại 1.5-2ml khử trùng không chứa RNase + Đầu côn loại 2-50ul, 20- 200 μl 1000 μl có màng lọc + Ống tuýp định danh loại ml; + Tube Eppendorf ; + Khăn lau Kimwipes; Tăm tiệt trùng; + Găng (không bôt), trang, mũ dùng lần - Kit tách chiết DNA Qiagene (hoặc tương đương) - Một số loại hóa chất dùng xét nghiệm: + dNTPs 10µM + MgCL2 25µM + 10µM PCR buffer (Dung dịch đệm) + HotStart Taq DNA polymerase b Tiến hành pha - Số lượng ống PCR cần cho đợt chạy realtime-PCR theo công thức sau: Số lượng ống = Số bệnh phẩm +2 - Làm tan đá ống PCR master mix, hút 12,5 µl cho phản ứng PCR vào ống eppendorf 1,5 ml Sau trộn thành phần realtime PCR theo bảng sau: 159 Bảng Thành phần pha sinh phẩm Nồng độ (µM) Thành phần phản ứng Thể tích (µl) PCR Master Mix 10 12,5 MgCl2 25 DMSO 10 Mồi xuôi 10 Mồi ngược 10 Mẫu dò 10 0,25 H2O 2,25 Tổng 20 - Đặt ống PCR chứa Mix vào dụng cụ làm lạnh để dụng cụ điều kiện - 4oC lúc tiến hành tách chiết DNA - Đóng chặt nắp ống PCR c Chuẩn bị cặp mồi realtime RT-PCR Bảng 6: Bộ mồi cho phản ứng RT-PCR Tên Trình tự ( 5’-3’ ) Mồi xuôi GCTGCGGTAGGTGGTTAA Mồi ngược TTGTCGCGGATTTGCAACTA Mẫu dò FAM-CATTGCCACGTGTCAGCTGCACAT-TAMRA 8.4.3 Tiến hành chạy phản ứng realtime PCR Mỗi lần chạy PCR cần tiến hành đồng thời loại chứng bao gồm: Chứng dương để đảm bảo sinh phẩm phản ứng PCR đảm bảo chất lượng; Chứng âm để kiểm soát trình tách chiết DNA không bị nhiễm - Chuyển µl sản phẩm tách chiết DNA chứng âm chứng dương vào ống PCR tương ứng - Ly tâm nhanh ống PCR có chứa Mix sản phẩm DNA tách chiết - Chuyển ống PCR vào máy luân nhiệt cài theo chu trình nhiệt sau: Bảng Đặt chương trình phản ứng PCR Chương trình Biến tính Khuếch đại Nhiệt độ [oC] Thời gian [hh:mm:ss] 95 95 60 72 00:15:00 00:00:30 00:00:30 00:00:30 160 Chu kỳ 45 8.5 Phiên giải kết xét nghiệm 8.5.1 Đọc kết xét nghiệm - Kết đọc khi: + Chứng âm: tín hiệu huỳnh quang + Chứng âm tách chiết: tín hiệu huỳnh quang + Chứng dương: tín hiệu huỳnh quang thu nhận nhỏ chu kỳ thứ 40 phản ứng + Mẫu dương tính: tín hiệu huỳnh quang thu nhận nhỏ chu kỳ thứ 40 phản ứng - Nếu trường hợp phương pháp realtime RT - PCR cho kết không rõ mẫu bệnh phẩm lặp lại từ bước tách chiết mẫu chạy song song hai phương pháp RT-PCR realtime PCR; phòng xét nghiệm yêu cầu lấy lại bệnh phẩm xét nghiệm theo thường quy phòng từ bước nhận bệnh phẩm 8.5.2 Nhận định kết xét nghiệm Phát đoạn DNA đặc hiệu vi khuẩn Neisseria meningitidis Kết chấp nhận khi: - Chứng dương: tín hiệu huỳnh quang thu nhận - Chứng âm: tín hiệu huỳnh quang - Dương tính: sản phẩm PCR đặc hiệu có kích thước kích thước chứng dương - Âm tính: xuất sản phẩm PCR vị trí không đặc hiệu diện sản phẩm PCR 8.5.3 Ghi chép báo cáo - Hoàn thành biểu mẫu kết chẩn đoán viêm màng não mô cầu phương pháp rPCR - Nhập kết xét nghiệm vào sổ theo dõi - Nhập kết vào máy tính chuyển vào hồ sơ tổng hợp - Người kiểm tra kiểm tra lại kết trước báo cáo người phụ trách PXN IV Tài liệu tham khảo Bộ môn Vi sinh, Đại học Y Hà Nội (2007), Giáo trình thực tập Vi sinh y học Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Vi sinh học, 2013, Quyết định 26/QĐ-BYT Hướng dẫn sử dụng máy định danh làm kháng sinh đồ tự động Vitek – compact, 2007 Hướng dẫn sử dụng máy định danh Malditof, 2014 Hướng dẫn sử dụng kít Qiagene Kỹ thuật xét nghiệm Vi sinh lâm sàng, 2006, Nhà xuất Y học Tài liệu tham khảo lấy bệnh phẩm an toàn Sinh học WHO, CDC Bộ Y Tế Vi sinh Y học, 2011, Nhà xuất Quân đội nhân dân 161 Vi sinh vật Y học, 2007, Nhà xuất Y học Bactec Model 9050/9120 operation manual text book 10 Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 9th Edition, William & Wilkins 11 Diagnostic Microbiology, 4th Edition, Washington, Philadelphia WHO, Laboratory for the Diagnosis of Meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumonae anh Haemophilus influenza, WHO manual, 2rd edition 12 Manual of Clinical Microbiology, 8th Edition, Washington DC – Patrick Murray 13 Nadine G Rouphael and David S Stephens (2012), Neisseria meningitidis: Biology, Microbiology, and Epidemiology, Methods Molecular Biology; pp 799: 1–20 14 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty - Second Informational Supplement (2012), Clinical and Laboratory Standards Institute antimicrobial susceptibility testing standards M02 - A11 and M07 - A9 15 VITEK® Systems Product Information 410791 (09/2010), bioMérieux; 16 WellcogenTM N meningitidis ACY W135 manual 162