Nghiên cứu tối ưu chiết xuất cho hàm lượng polyphenol cao từ lá trà hoa vàng

Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quy trình chiết xuất cao lá Trà hoa vàng Camellia chrysantha Hu Tuyama cho hàm lượng polyphenol cao bằng phương pháp chiết xuất có hỗ trợ siê

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HÀ NỘI – 2017

LỜI CẢM ƠN LỜI CẢM ƠN

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

Bộ môn Thực Vật

HÀ NỘI - 2017

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn và kính trọng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến TS Hoàng Quỳnh

Hoa và DS Phạm Thị Linh Giang - Bộ môn Thực Vật, Trường Đại học Dược Hà Nội

– những người đã trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt tôi từ những ngày đầu nghiên cứu, giúp tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới:

PGS.TS Trần Văn Ơn, ThS Nghiêm Đức Trọng và DS Lê Thiên Kim – Bộ

môn Thực Vật, những người thầy luôn sẵn sàng giúp đỡ, giải đáp thắc mắc, khó khăn

mà tôi gặp phải

Ban Giám Hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo, các cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy bảo tôi nhiều kiến thức trong suốt 5 năm học tại đây Các bộ môn Dược Liệu, bộ môn Hóa Phân Tích, bộ môn Vật Lý- Hóa Lý

đã tạo điều kiện cho tôi sử dụng cân phân tích độ ẩm và máy đo quang phổ UV- VIS trong quá trình làm thực nghiệm

Các chị kỹ thuật viên bộ môn Thực Vật đã luôn nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực nghiệm Các bạn cùng làm khóa luận khóa 67 và các em trong nhóm nghiên cứu của bộ môn Thực Vật, tất cả

đã cùng động viên, hỗ trợ nhau rất nhiều

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn bè

đã luôn khích lệ, giúp đỡ và cổ vũ tôi trong suốt thời gian qua

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 02 tháng 5 năm 2017 Sinh viên

Trần Xuân Nhật

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về loài Camellia chrysantha (Hu) Tuyama 2

1.1.1 Đặc điểm thực vật, phân bố 2

1.1.2 Thành phần hóa học 4

1.1.3 Tác dụng sinh học 4

1.1.3.1 Tác dụng chống ung thư 4

1.1.3.2 Tác dụng chống oxy hóa 4

1.1.3.3 Một số tác dụng khác 5

1.2 Nhóm chất polyphenol 5

1.2.1 Định nghĩa, phân loại 5

1.2.2 Các phương pháp định lượng polyphenol 8

1.3 Các phương pháp chiết xuất polyphenol 8

1.3.1 Khái niệm và những yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chiết xuất dược liệu 8

1.3.2 Phân loại các phương pháp chiết xuất 9

1.3.3 Phương pháp chiết xuất có hỗ trợ siêu âm 9

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 14

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 14

2.1.2 Thiết bị, hóa chất nghiên cứu 14

2.1.2.1 Thiết bị máy móc, dụng cụ thí nghiệm 14

2.1.2.2 Hóa chất 15

2.2 Nội dung nghiên cứu 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 15

2.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quy trình chiết xuất cao lá Trà hoa vàng ( Camellia chrysantha (Hu) Tuyama ) cho hàm lượng polyphenol cao bằng phương pháp chiết xuất có hỗ trợ siêu âm 15

2.3.1.1 Lựa chọn các biến số (nồng độ EtOH, nhiệt độ, thời gian) và xây dựng

mô hình thí nghiệm 15

2.3.1.2 Định lượng hàm lượng polyphenol tổng bằng phương pháp đo màu, sử dụng thuốc thử Folin- Ciocalteu 18

2.3.2 Nghiên cứu xử lý số liệu thống kê bằng phương pháp đáp ứng bề mặt 20

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU, BÀN LUẬN 23

3.1 Thực nghiệm và kết quả nghiên cứu 23

3.1.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quy trình chiết xuất lá Trà hoa vàng (Camellia chrysantha (Hu) Tuyama ) cho hàm lượng Polyphenol cao bằng phương pháp chiết xuất có hỗ trợ siêu âm 23

3.1.1.1 Xây dựng đường chuẩn acid gallic 23

3.1.1.2 Kết quả định lượng polyphenol trong các mẫu nghiên cứu 24

3.1.1.3 Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình chiết xuất polyphenol 26

3.1.2 Kết quả điều kiện chiết xuất tối ưu cho hàm lượng polyphenol cao 29

3.2 Bàn luận 30

3.2.1 Xu hướng ảnh hưởng của các yếu tố dung môi, nhiệt độ và thời gian chiết xuất đến hàm lượng polyphenol toàn phần (hình 3.6) 30

3.2.2 Sự tối ưu hóa qua các thông số 31

3.2.3 Phương pháp xử lý số liệu và phương trình hồi quy đa biến 32

KẾT LUẬN 34

ĐỀ XUẤT 35

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU GAE/g DW Gallic Acid Equivalent/g Dry Weight - mg đương lượng acid

gallic/g chất khô

ANOVA Analysis of Variance – Phân tích phương sai

DPPH 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl

EGCG Epigalo catechin gallat

GC Gas Chromatography - Sắc ký khí

HPLC High Performance Liquid Chromatography - Sắc ký lỏng hiệu

năng cao

HPTLC High Performance Thin Layer Chromatography - Sắc ký lớp

mỏng hiệu năng cao

OD Optical Density - Mật độ quang

RD Standard deviation – Độ lệch chuẩn

RSD Relative Standard Deviation - Độ lệch chuẩn tương đối

RSM Response Surface Methodology - Phương pháp đáp ứng bề mặt

UAE Ultrasound assisted extraction – Chiết xuất có hỗ trợ siêu âm

DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ HÌNH VẼ

1.1 So sánh phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm (UAE) so với các

phương pháp chiết xuất thông thường

11

1.2 Một số nghiên cứu trên thế giới sử dụng phương pháp chiết có hỗ

trợ siêu âm để chiết các hợp chất nhóm polyphenol

12

2.1 Danh sách mã hóa mẫu thực nghiệm theo điều kiện chiết xuất 18

2.3 Đổi biến thực thành biến mã hóa theo mô hình trung tâm trong

RSM

22

3.2 Mật độ quang trung bình và mg đương lượng acid gallic/g chất

khô của 27 mẫu nghiên cứu

25

1.1 Đặc điểm hình thái mẫu C.chrysantha (Hu) Tuyama 3

2.1 Sơ đồ các bước tiến hành định lượng polyphenol toàn phần 20

3.1 Đường biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào 23 3.2 Câu lệnh và kết quả các hệ số của phương trình hồi quy đa biến 27 3.3 So sánh hàm lượng polyphenol toàn phần từ thực nghiệm (Conc) và

từ mô hình (Conc1) được xây dựng

28

3.4 Xu hướng ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng polyphenol 30

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trà hoa vàng (Camellia spp.) hay còn gọi là Kim hoa trà – là loại trà có hoa màu

vàng thuộc chi Camellia L Những năm trở lại đây, Trà hoa vàng được biết đến với

nhiều tác dụng sinh học quý, mang lại lợi ích tốt cho sức khỏe Nghiên cứu của Lixia

Song cùng cộng sự trên 6 loại Trà hoa vàng C chrysantha, C impressinervis,

C euphlebia, C microcarpa, C nitidissima và C tunghinensis cho thấy tác dụng

chống oxi hóa mạnh từ nhóm chất polyphenol trong trà [44] Cùng với đó, một số

nghiên cứu khác chứng minh Trà hoa vàng có tác dụng hạ huyết áp, hạ cholesterol

máu, giảm đường huyết, chống u bướu, tăng cường hệ miễn dịch và kéo dài tuổi thọ

[17], [27]

Ở Việt Nam, cho đến nay ghi nhận sự xuất hiện của 27 loài Trà hoa vàng [12]

Trong đó, sự đa dạng tập trung chủ yếu ở các khu vực Tam Đảo (Vĩnh Phúc), Ba Chẽ

(Quảng Ninh) Nghiên cứu của Ngô Thị Thảo trên các mẫu Trà ở Ba Chẽ đã khẳng

định sự có mặt của polyphenol, bước đầu định lượng được hàm lượng polyphenol tổng,

đồng thời chỉ ra tác dụng chống oxy hóa và ức chế dòng tế bào ung thư in-vitro từ dịch

chiết lá Trà hoa vàng tại đây [8] Rõ ràng với những tác dụng sinh học quý và tiềm

năng phát triển, việc nghiên cứu phát triển các sản phẩm thuốc hay thực phẩm chức

năng từ Trà hoa vàng là nhu cầu tất yếu và quan trọng Trong đó, bán thành phẩm dạng

cao được xem như bán thành phẩm khi đi từ dược liệu thô đến các sản phẩm hoàn thiện

khác như trà túi lọc, bột cốm, viên nang, viên nén

Từ thực tế và nhu cầu trên, đề tài “Nghiên cứu tối ƣu chiết xuất cho hàm

lƣợng polyphenol cao từ lá Trà hoa vàng” được thực hiện với các mục tiêu sau:

- Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố (dung môi, nhiệt độ, thời gian) trong quá

trình chiết siêu âm

- Chọn điều kiện chiết xuất tối ưu cho hàm lượng polyphenol cao từ lá cây Trà

hoa vàng

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về loài Camellia chrysantha (Hu) Tuyama

1.1.1 Đặc điểm thực vật, phân bố

Theo hệ thống phân loại của Takhtajan công bố năm 2009, chi Trà (Camellia L)

có vị trí phân loại như sau [15]:

Trên thế giới, chi Camellia L có khoảng 280 loài, phân bố chủ yếu ở các nước

nhiệt đới và á nhiệt đới như Ấn Độ, Trung Quốc, Việt Nam, Thổ Nhĩ Kì, Kenya,

Uganda, Brazil, Australia…[12] Tại Việt Nam, chi Camellia L có tới gần 60 loài,

trong đó có 27 loài có hoa màu vàng, thường được gọi chung là Trà hoa vàng, tập trung nhiều ở khu vực phía Bắc (Thái Nguyên, Vĩnh Phúc, Quảng Ninh…) và rải rác ở phía Nam tại một số tỉnh như Lâm Đồng, Đồng Nai…[21]

Camellia chrysantha (Hu) Tuyama là một loại Trà hoa vàng, được trồng phổ

biến ở huyện Ba Chẽ (Quảng Ninh) Đây là loài có thân gỗ nhỏ, chồi và cành non có lông mịn thưa; cành già màu nâu, nhẵn Lá bao chồi 5-9, thường là 6, hình elip, lớn dần

từ dưới lên; mặt ngoài màu hồng nhạt; mặt trong màu hồng nhạt hơn, nhẵn, mép nguyên Lá đơn, mọc so le, không có lá kèm Cuống lá tương đối ngắn, dài khoảng 0,6-0,7cm, lõm ở mặt trên Phiến lá (bánh tẻ) hình elip, cứng, dày và dai, dài 11 cm, rộng 5cm; mặt trên màu xanh thẫm, nhẵn bóng, mặt dưới màu xanh nhạt, nhẵn, thường có nhiều điểm tuyến màu đen; gốc lá hình nêm; mép lá có khía răng cưa, khía răng nông,

nhỏ, phía gốc lá gần như không có khía, mật độ khía răng cưa tăng dần về phía ngọn lá, chỗ rộng nhất khía răng cưa cách nhau 8mm; ngọn lá nhọn có mũi dài 0,4-0,5cm gân giữa lộ rõ, lõm sâu ở mặt trên, nổi rõ ở mặt dưới, có 10-12 cặp gân bên Hoa đều, lưỡng tính, mọc đơn độc ở đầu cành hoặc nách lá, màu vàng, đường kính khi nở khoảng 3cm Cuống hoa rất ngắn, gần như không thấy Lá bắc 6-10, có dạng hình móng, xếp thành hai dãy, phủ lên nhau, lớn dần từ dưới lên trên, kích thước từ 0,3-1,4

cm, mặt ngoài và mặt trong có lông trắng, mịn Cánh hoa 10-20, các cánh phía trong dính với nhau và dính vào vòng nhị ngoài.Bộ nhị nhiều, dính với nhau ở gốc chỉ nhị Các chỉ nhị ở vòng ngoài của bộ nhị dài khoảng 2,4 cm, không có lông; chỉ nhị màu vàng, mang bao phấn 2 ô Bộ nhụy gồm 3 lá noãn dính nhau tạo thành bầu trên 3 ô, có dạng hình cầu, màu xanh nhạt, nhẵn; vòi nhụy 3, rời, màu vàng [6], [8], [11]

Hình 1.1: Đặc điểm hình thái mẫu C.chrysantha (Hu) Tuyama

1 Toàn cây; 2,3 Cành mang lá; 4 Lá; 5 Hoa; 6 Lá bắc;

7 Tràng; 8 Bộ nhị; 9 Bộ nhụy; 10 Bầu cắt ngang

1.1.2 Thành phần hóa học

Ở Việt Nam, cho đến nay mới có một số loài ở Tam Đảo, Quảng Ninh, Thái

Nguyên được nghiên cứu sơ bộ về thành phần hóa học như Camellia costata Hung T Chang, Camellia chrysanthoides Hung T Chang, Camellia chrysantha (Hu) Tuyama,

trong đó các nghiên cứu đa phần mới chỉ tiến hành định tính hóa học, định lượng polyphenol tổng và EGCG trong lá các loài được nghiên cứu [6], [8], [12] Kết quả nghiên cứu của Hà Ly và Ngô Thị Thảo chỉ ra sự có mặt của các nhóm chất Trà hoa vàng bao gồm: tanin, flavonoid, saponin, đường khử, sterol, chất béo và các acid amin, trong đó các chất thuộc nhóm polyphenol có hàm lượng cao với những tác dụng sinh học cần được quan tâm [6], [8]

1.1.3 Tác dụng sinh học

1.1.3.1 Tác dụng chống ung thư

Các nghiên cứu thực nghiệm trên động vật và người đã chứng minh rằng các polyphenol có tác dụng kìm hãm sự hình thành, phát triển và di căn của khối u, giúp phòng ngừa bệnh ung thư và các bệnh tim mạch khi dùng hàng ngày với lượng vừa đủ Tác dụng này chủ yếu là do hiệu quả chống oxy hóa cao và chống tăng sinh khối u của các hợp chất polyphenol trong trà [20], [31], [34], [36], [41], [42] Nghiên cứu của Ngô Thị Thảo chỉ ra tại nồng độ 100 (g/ml), mẫu nghiên cứu của các loài C chrysantha,

C chrysanthoides, Camellia sp1, Camellia sp2 đều có khả năng ức chế trên 50% sự

phát triển của 5 dòng tế bào ung thư: MDA-BA-231(ung thư vú), Hep-G2 ( ung thư gan), SW480 (ung thư đại tràng), SK-Mel2 (ung thư da), LU-1 (ung thư phổi) [8]

1.1.3.2 Tác dụng chống oxy hóa

Nhiều nghiên cứu đã khẳng định khả năng chống oxy hóa của trà là do hoạt tính của các hợp chất nhóm polyphenol [16], [19], [26], [28], [29], [44] Theo nghiên cứu của Xiao Min cùng cộng sự [16], hàm lượng polyphenol tổng chiết xuất từ lá Trà hoa

vàng Camellia chrysantha (Hu) Tuyama cao hơn tới 36,71% so với các loại trà khác,

dẫn tác dụng chống oxy hóa mạnh, thể hiện qua khả năng trung hòa gốc tự do Các chất

được xác định trong lá của loài Camellia chrysantha (Hu) Tuyama có tác dụng trung

hòa gốc tự do là: vitexin, quercetin-7-O-β-D-glucopyranoside, kaempferol, epicatechin (EC), epicatechin gallat (ECG), epigallocatechin gallat (EGCG) [26], [29]

1.1.3.3 Một số tác dụng khác

Theo cuốn “Từ điển cây thuốc Việt Nam” của Võ Văn Chi, lá cây Trà hoa vàng được sử dụng để chữa bệnh lỵ, các bệnh chốc lở [13] Ngoài ra, các hoạt chất trong lá

và hoa Trà hoa vàng cũng có những tác dụng sinh học cao như: tác dụng hạ huyết áp,

hạ cholesterol máu, giảm tiểu đường, chống u bướu, tăng cường hệ miễn dịch và kéo dài tuổi thọ [17], [27]

1.2 Nhóm chất polyphenol

1.2.1 Định nghĩa, phân loại

Hợp chất phenol là nhóm các hợp chất hóa học mà trong công thức hóa học có chứa nhóm chức hydroxyl (-OH) gắn với vòng hydrocarbon thơm Các hợp chất này rất phổ biến trong giới thực vật Tùy thuộc vào số lượng và vị trí tương hỗ của các nhóm này mà các tính chất hóa lí và hoạt tính sinh học thay đổi [5], [14]

Thành phần polyphenol của lá Trà đa dạng, bao gồm chủ yếu là các flavonoid

và tanin [7], [8] Các polyphenol này chiếm từ 20 - 35 % trọng lượng trà khô [7]

 Flavonoid [5], [14], [25]

Flavonoid thường là những sắc tố, phần lớn có màu vàng (flavon, flavonol, chancol), không màu (izoflavon, catechin) hoặc có màu đỏ và màu vàng (anthocyane) Trong cây, flavonoid thường tồn tại dưới 2 dạng là dạng tự do (aglycon) và dạng liên kết (glycoside) Dạng aglycon tan nhiều trong các dung môi hữu cơ như ether, ethanol, acetone,…và hầu như không tan trong nước Dạng glycoside liên kết với đường tan nhiều trong nước và hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ

Bộ khung carbon của flavonoid là C6-C3-C6 , gồm 15 nguyên tử carbon, 2 vòng benzene A và B nối với nhau qua vòng pyren C, trong đó A kết hợp với C tạo thành khung chroman

9

10 8

4

1' 5' 6'

4'

3' 2'

B

Hình 1.2: Khung cacbon của Flavonoids

Tuỳ theo mức độ oxy hoá của mạch 3 carbon, sự có mặt hay không có mặt của nối đôi giữa C2, C3 và nhóm cacbonyl ở C4 mà flavonoids có thể được chia thành nhiều phân nhóm phụ khác nhau

Flavonoid có thể tham gia vào nhiều phản ứng hoá học khác nhau như phản ứng

của nhóm hydroxyl (OH), phản ứng của vòng thơm (diazo hoá), phản ứng của nhóm

cacbonyl (phản ứng shinoza) và phản ứng tạo phức với kim loại Hiện nay đã có hơn

4500 các loại flavonoid khác nhau tồn tại trong thực vật đã được nhận dạng Trong y

học, flavonoid được sử dụng làm thuốc để chữa trị nhiều loại bệnh khác nhau như:

thuốc làm bền thành mạch, thuốc chống oxy hoá, thuốc kháng viêm, chống nấm, chống

dị ứng, chống ung thư,…

 Tannin [5], [18]

Tannin là những hợp chất phenolic có trọng lượng phân tử cao, có chứa các

nhóm hydroxyl và các nhóm chức khác (như cacboxyl), có khả năng tạo phức với

protein và các phân tử lớn khác trong điều kiện môi trường đặc biệt

Tannin được cấu tạo dựa trên acid tannic và acid gallic Tannin thường là các

hợp chất vô định hình, có màu trắng, màu vàng nhạt hoặc gần như không màu, có hoạt

tính quang học, có vị chát, dễ bị oxy hoá khi đun nóng và khi để ngoài ánh sáng

Tannin tan nhiều trong nước (tốt nhất là trong nước nóng), tan trong các dung môi hữu

cơ như ethanol, hoà tan một phần trong axetone, ethylaxetat và hầu như không tan

trong các dung môi kém phân cực như chloroform, benzene,…

Acid gallic Procyanidin

Tannin tạo phức màu đặc trưng với các kim loại nặng, tạo phức với protein,

tinh bột, cellulose và muối khoáng Trong y học, tannin được sử dụng làm thuốc cầm máu, thuốc chữa đi ngoài, chữa ngộ độc kim loại nặng, , điều trị cao huyết áp và chứng

đột quỵ,…

1.2.2 Các phương pháp định lượng polyphenol

Hàm lượng polyphenol toàn phần có thể xác định bằng nhiều kỹ thuật khác nhau: quang phổ hồng ngoại, sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC), sắc ký lỏng kết hợp với khối phổ (LC-MS), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [19] Các kỹ thuật này cho độ chính xác và đặc hiệu cao nhưng lại yêu cầu về máy móc trang thiết bị đắt tiền, tốn kém

Năm 2013, Bộ khoa học và công nghệ Việt Nam đã đưa ra tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9745-1:2013 (ISO 14502-1:2005), quy định phương pháp xác định hàm lượng polyphenol toàn phần trong Trà xanh và Trà đen Đó là phương pháp đo màu sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteu [1] Mặt khác, luận văn của Ngô Thị Thảo [8] cũng như khóa luận của Hà Ly [6] đã sử dụng phương pháp này để định lượng polyphenol toàn phần trên lá cây Trà hoa vàng Phương pháp đã được thẩm định lại, cho độ đặc hiệu, tuyến tính và lặp lại cao, đáp ứng yêu cầu phân tích định lượng polyphenol trong các mẫu Trà hoa vàng Chính vì vậy, đề tài quyết định sử dụng phương pháp đo màu với thuốc thử Folin-Ciocalteu để tiến hành định lượng hàm lượng polyphenol trong mẫu nghiên cứu

1.3 Các phương pháp chiết xuất polyphenol

1.3.1 Khái niệm và những yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chiết xuất dược liệu

Chiết xuất là quá trình dùng dung môi thích hợp để hòa tan các chất tan có trong dược liệu, chủ yếu là các hoạt chất có tác dụng điều trị, sau đó tách chúng ra khỏi phần không tan trong dược liệu [3] Sản phẩm thu được của quá trình chiết xuất là một dung dịch của các chất hòa tan trong dung môi, được gọi là dịch chiết [9] 3 nhóm yếu tố ảnh hưởng bao gồm [3], [9]:

 Những yếu tố thuộc về thành phần, cấu tạo dược liệu: Màng tế bào dược liệu, chất nguyên sinh, một số tạp chất trong dược liệu như pectin, gôm, chất nhày, tinh bột, chất béo, dầu mỡ, sáp, nhựa, enzyme,…

 Những yếu tố thuộc về dung môi: Độ phân cực, độ nhớt, sức căng bề mặt của dung môi

 Những yếu tố thuộc về kĩ thuật: Nhiệt độ, thời gian chiết xuất, mức độ chia nhỏ (hay độ mịn) dược liệu, khuấy trộn, pH môi trường,…

1.3.2 Phân loại các phương pháp chiết xuất

Các phương pháp chiết xuất được phân loại dựa vào nhiều yếu tố [2], [3]:

 Dựa vào nhiệt độ có phương pháp chiết nóng (như chiết hồi lưu), chiết nguội

 Dựa vào chế độ làm việc có phương pháp chiết gián đoạn (ngâm và ngấm kiệt); bán liên tục và liên tục

 Dựa vào chiều chuyển động tương hỗ giữa hai pha, có các phương pháp: ngược dòng, xuôi dòng, chéo dòng

 Dựa vào áp suất làm việc có các phương pháp: áp suất thường, áp suất giảm (áp suất chân không), áp suất cao (chiết có áp lực)

 Dựa vào những biện pháp kỹ thuật đặc biệt, có các phương pháp: phương pháp chiết có hỗ trợ sóng siêu âm, phương pháp chiết hỗ trợ sóng viba, phương pháp tạo dòng xoáy,

1.3.3 Phương pháp chiết xuất có hỗ trợ siêu âm

Các chiết xuất thông thường như chiết ngấm kiệt, ngâm lạnh, ngâm nóng, chiết soxhlet đã được sử dụng để chiết xuất các hợp chất polyphenol Tuy nhiên, những phương pháp chiết xuất này đòi hỏi một lượng lớn dung môi; thời gian kéo dài, ảnh hưởng đến một số hợp chất polyphenol và hạn chế khi ứng dụng trong công nghiệp [20], [35] Gần đây, nhiều kỹ thuật chiết xuất mới đã được phát triển để chiết xuất các hợp chất polyphenol từ thực vật, bao gồm chiết xuất có hỗ trợ siêu âm (Ultrasound

assisted extraction - UAE), có hỗ trợ vi sóng (MAE), chiết xuất chất lỏng siêu tới hạn

(SFE), trích xuất pha rắn (SPE), chiết xuất chất lỏng áp suất (PLE) [20], [22], [30], [32], [35], [37], [45] Trong số các phương pháp này, phương pháp chiết xuất có hỗ trợ siêu âm là một lựa chọn thay thế ít tốn kém và phổ biến

Trong nghiên cứu của Khan cùng cộng sự [41], lượng polyphenol toàn phần thu được bằng chiết có hỗ trợ siêu âm (UAE) cao hơn đáng kể so với chiết bằng phương pháp thông thường không có hỗ trợ siêu âm Kết quả nghiên cứu được thể hiện qua bảng 1.1

Bảng 1.1: So sánh phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm (UAE) so với các phương

pháp chiết xuất thông thường

Citrus unshiu Phenolic Acid Thời gian chiết UAE =10-40 phút,

lượng Phenolic Acid thu được tương đương với 8h ngấm kiệt

[38]

Citrus unshiu Phenolic Acid

và Flavanone glycosides

So với phương pháp ngấm kiệt, UAE tăng lượng polyphenol toàn phần thu được và cả về hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết

[39]

C reticulata Hesperidin So với chiết Soxhlet, lượng hesperidin

thu được gần nhau nhưng hesperidin thu được ít bị biến tính hơn khi chiết UAE

[40]

Folium

eucommiae

Flavonoids UAE hiệu quả hơn chiết nhiệt, vi sóng,

và chiết xuất với sự hỗ trợ của enzyme

[24]

Triticum

aestivum

Nhóm Phenolic giàu

heteroxylans

Giảm thời gian chiết từ 60 phút (phương pháp thông thường) xuống còn 5 phút (UAE)

[46]

Ngoài ra, nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước đã sử dụng phương pháp chiết

có hỗ trợ siêu âm để chiết các hợp chất nhóm polyphenol từ các loại dược liệu khác

nhau Các nghiên cứu này đều đánh giá một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết như nhiệt độ, nồng độ dung môi, thời gian, công suất bể siêu âm, pH… và sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) để xử lý số liệu thống kê (bảng 1.2)

Bảng 1.2: Một số nghiên cứu trong và ngoài nước sử dụng phương pháp chiết có

hỗ trợ siêu âm để chiết các hợp chất nhóm polyphenol

Tên dược liệu

chiết xuất

Polyphenol toàn phần (mg GAE/g DW)

TLTK Nồng độ

EtOH (%)

Nhiệt

độ ( o C)

Thời gian (phút)

Thông số khác

Nhận thấy, phạm vi ứng dụng của phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm khá rộng, được nhiều nghiên cứu sử dụng để tối ưu hóa quá trình chiết xuất đối với hợp chất nhóm polyphenol Sóng siêu âm mang đến hiệu quả cơ học, cho phép phá hủy cấu trúc tế bào, tăng diện tích bề mặt tiếp xúc giữa pha rắn và pha lỏng, tăng thẩm thấu từ dung môi vào nguyên liệu chiết và kết quả là chất tan nhanh chóng khuếch tán từ pha rắn tới dung môi [20], [35], [48] Ngoài ra, thiết bị siêu âm không quá đắt tiền, dễ vận hành, bảo quản đơn giản Thời gian chiết xuất được rút ngắn, ít ảnh hưởng đến hoạt chất chiết và tiết kiệm năng lượng đầu vào [20], [30], [35], [48] Từ những ưu điểm trên, đề tài lựa chọn phương pháp chiết xuất có hỗ trợ siêu âm (UAE) làm phương pháp chiết và hướng đến khảo sát ảnh hưởng của các thông số: nồng độ dung môi EtOH, nhiệt độ, thời gian tới quá trình chiết xuất Từ đó, đưa ra được quy trình chiết xuất lá Trà hoa vàng tối ưu nhất cho hàm lượng polyphenol cao

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là lá loài Trà hoa vàng, thu hái vào tháng 12 năm 2016 tại vườn trồng nhà anh Nịnh Văn Trắng, xã Đạp Thanh- huyện Ba Chẽ- tỉnh Quảng Ninh

Loài nghiên cứu đã được giám định tên khoa học là Camellia chrysantha (Hu) Tuyama, thuộc chi Camellia L Tiêu bản được lưu tại Phòng tiêu bản- Bộ môn Thực

Vật- Trường Đại học Dược Hà Nội với mã số tiêu bản : HNIP/18507/17

Xử lý nguyên liệu sau thu hái: Lá cây sau khi thu hái được làm sạch, hong khô

và sấy ở nhiệt độ 450C đến hàm ẩm <10%, sau đó, dược liệu được nghiền đến kích thước bột thô và bảo quản trong túi ni lông kín, tránh ánh sáng trực tiếp

2.1.2 Thiết bị, hóa chất nghiên cứu

2.1.2.1 Thiết bị máy móc, dụng cụ thí nghiệm

 Hệ thống máy sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao CAMAG gồm: máy chấm sắc ký Linomat 5, buồng phát hiện TLC Visualizer, phần mềm phân tích winCATS và VideoScan

 Máy đo quang Hitachu U-1900

 Tủ sấy WiseVen (R) WOF

 Cân phân tích hàm ẩm MR25

 Bể siêu âm WISD

 Cân kỹ thuật Sartorius (TE3102S)

 Cân phân tích Executive Pro Semi-Micro (ES 225 SM-DR)

 Bể đun cách thủy

 Cồn kế, nhiệt kế

 Các dụng cụ thủy tinh: cốc có mỏ, bình nón nút mài bình định mức, ống nghiệm, pipet chính xác các loại, đũa thủy tinh, phễu thủy tinh, bình gạn

2.1.2.2 Hóa chất

 Chất chuẩn acid gallic 97%, được cung cấp bởi Viện Dược Liệu

 Dung môi: methanol, ethanol 96%, nước cất

 Thuốc thử Folin- Ciocalteu (hãng Merck, Germany)

 Natri cacbonat (Na2CO3) (tiêu chuẩn DĐVN IV)

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quy trình chiết xuất lá Trà hoa vàng (Camellia chrysantha (Hu) Tuyama ) cho hàm lượng Polyphenol cao bằng phương pháp chiết xuất có hỗ trợ siêu âm

- Lựa chọn các biến số (nhiệt độ, nồng độ EtOH, thời gian) và giá trị của từng

biến số, thiết kế mô hình thí nghiệm, tiến hành chiết xuất theo mô hình đã xây dựng

- Định lượng hàm lượng polyphenol tổng (TPC) trong cao thu được bằng phương

pháp đo màu dùng thuốc thử Folin- Ciocalteu

- Kết quả được xử lý thống kê bằng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM - Response surface methodology) với phần mềm R, để xác định ảnh hưởng của các biến

số tới quá trình chiết xuất

2.2.2 Xác định điều kiện chiết xuất tối ưu cho hàm lượng polyphenol cao

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quy trình chiết xuất cao lá Trà hoa vàng ( Camellia chrysantha (Hu) Tuyama ) cho hàm lượng polyphenol cao bằng phương pháp chiết xuất có hỗ trợ siêu âm

2.3.1.1 Lựa chọn các biến số (nồng độ EtOH, nhiệt độ, thời gian) và xây dựng mô hình thí nghiệm

 Yếu tố ảnh hưởng

Qua các nghiên cứu ở bảng 1.2, kết hợp với điều kiện thiết bị siêu âm trong phòng thí nghiệm bộ môn, nhóm nghiên cứu đã lựa chọn 3 yếu tố để khảo sát ảnh hưởng đến quá trình chiết siêu âm bao gồm: dung môi, nhiệt độ và thời gian chiết xuất

1) Dung môi chiết xuất

Các nghiên cứu trên thế giới đã sử dụng aceton, ethylacetate, ethanol, methanol

và hỗn hợp methanol để tách chiết polyphenol Do có độ nhớt thấp nhất nên ethanol cho hiệu suất chiết polyphenol thấp hơn các dung môi còn lại [10] Tuy nhiên, để ứng dụng trong bảo quản và chế biến thực phẩm, ethanol thường được sử dụng vì đây là loại dung môi an toàn [30], [47] Tất cả những nghiên cứu trong bảng 1.2 đều sử dụng dung môi ethanol - nước làm dung môi chiết xuất Dung môi ethanol - nước được lựa chọn do có khả năng hòa tan tốt các chất trong nhóm polyphenol, là dung môi xanh, được sử dụng phổ biến và an toàn trong chiết xuất công nghiệp [30] Do đó, với mục đích khảo sát ảnh hưởng dung môi đến quá trình chiết xuất, nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát ba mức độ dung môi là: nước cất, ethanol 50% (EtOH 50) và ethanol 90% (EtOH 90) (tính theo thể tích)

2) Nhiệt độ chiết xuất

Theo các nghiên cứu đã được công bố trong và ngoài nước, hàm lượng polyphenol thu được tương đối cao ở khoảng nhiệt độ 700

C – 800C [10] Mặt khác khi chiết ở nhiệt độ rất cao trên 800C làm tăng chi phí sản xuất và giảm chất lượng sản phẩm do sự hình thành những hợp chất không mong muốn, làm chuyển dạng cấu trúc polyphenol hoặc phá hủy một số dạng polyphenol có tác dụng chống oxy hóa [9], [47], đồng thời có thể gây nguy hiểm khi chiết xuất bằng ethanol nếu thiết bị không đảm bảo

độ an toàn Vì vậy, đề tài giới hạn cận trên của yếu tố nhiệt độ là 800C, đồng thời khảo sát thí nghiệm tại các giá trị nhiệt độ 350C, 500C và 700C

3) Thời gian chiết xuất

Chọn các khoảng thời gian 15 phút, 30 phút và 45 phút để tiến hành chiết xuất

Cân chính xác khoảng 10g dược liệu, cho vào bình nón nút mài dung tích 500

ml, thêm khoảng 25 ml dung môi, dùng đũa thủy tinh trộn đều cho dược liệu thấm đều dung môi trong thời gian 15 phút Tiếp tục bổ sung 75 ml dung môi, đậy nắp và chiết siêu âm với thời gian và nhiệt độ tùy theo điều kiện các thí nghiệm đã thiết kế Lọc lấy dịch chiết Bổ sung 100 ml dung môi ( tỉ lệ dược liệu : dung môi = 1:10) và chiết lần 2 với cùng điều kiện Gạn, lọc và gộp dịch chiết của 2 lần chiết, thu được dịch chiết tổng

Cô cách thủy dịch chiết tổng ở nhiệt độ 800C trong bể cách thủy đến cắn Toàn bộ cắn được sấy trong cốc có mỏ ở nhiệt độ 45oC đến khối lượng không đổi Cân khối lượng cắn thu được

 Mô hình khảo sát

Tiến hành nghiên cứu sự ảnh hưởng của các yếu tố đã lựa chọn tới quá trình

chiết xuất polyphenol từ lá Trà hoa vàng (C chrysantha (Hu) Tuyama) với các thí

nghiệm được mã hóa tại bảng 2.1 Mỗi mẫu được tiến hành chiết lặp lại 3 lần (27 mẫu,

81 thí nghiệm)

Bảng 2.1: Danh sách mã hóa mẫu thí nghiệm theo điều kiện chiết xuất

15p Aa1 Ab1 Ac1 Ba1 Bb1 Bc1 Ca1 Cb1 Cc1

30p Aa2 Ab2 Ac2 Ba2 Bb2 Bc2 Ca2 Cb2 Cc2

45p Aa3 Ab3 Ac3 Ba3 Bb3 Bc3 Ca3 Cb3 Cc3

2.3.1.2 Định lượng hàm lượng polyphenol tổng bằng phương pháp đo màu, sử dụng thuốc thử Folin- Ciocalteu

 Nguyên tắc

Các polyphenol trong dịch chiết được xác định bằng phương pháp đo màu, dùng thuốc thử Folin-Ciocalteu Thuốc thử này chứa chất oxy hóa là axit phospho-vonframic Trong quá trình khử, các nhóm hydroxyl phenol dễ bị oxi hóa, chất oxy hóa sinh ra có màu xanh với độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 765 nm Xây dựng đường chuẩn với chất chuẩn acid gallic

 Cách tiến hành

1) Chuẩn bị dung môi và thuốc thử

- Thuốc thử: pha loãng dung dịch thuốc thử Folin- Ciocalteu 10 lần bằng nước cất ngay trước khi tiến hành phản ứng

- Dung dịch Na2CO3 7,5%: Cân 37,50 gam natri carbonat (Na2CO3) cho vào bình định mức 500ml Thêm nước ấm đến nửa bình, lắc để hòa tan, để nguội đến nhiệt

độ phòng và pha loãng bằng nước cho đủ thể tích

2) Chuẩn bị mẫu chuẩn

- Dung dịch chuẩn gốc acid gallic nồng độ chính xác khoảng 1000µg/ml: Cân chính xác 0,1100 gam acid gallic chuẩn 97% cho vào bình định mức 100ml Hòa tan, pha loãng bằng nước cất đến đủ thể tích

- Dung dịch chuẩn gallic: dùng pipet chính xác chuyển các thể tích dung dịch chuẩn gốc gallic vào bình định mức 100ml và pha loãng bằng nước cất theo bảng 2.2

Bảng 2.2:Xây dựng dãy dung dịch chuẩn acid gallic

Dung dịch chuẩn

acid gallic

Thể tích dung dịch chuẩn gốc (ml)

Nồng độ lý thuyết của dung dịch chuẩn pha loãng

và bổ sung dung môi đến vạch Hút chính xác 10ml vào ống chiết, ly tâm dịch với tốc

độ 3500 vòng/ phút trong 10 phút Gạn lọc dịch trong phía trên vào bình định mức 10ml, thêm dung môi đến vạch Hút chính xác 1ml dịch và pha loãng bằng dung môi tương ứng trong bình định mức 100ml thu được dung dịch thử

4) Tiến hành phản ứng

Hình 2.1: Sơ đồ các bước tiến hành định lượng polyphenol toàn phần

Tiến hành đo độ hấp thụ của dãy dung dịch chuẩn, xây dựng phương trình đường chuẩn thể hiện mối quan hệ giữa độ hấp thụ và nồng độ acid gallic (µg/ml) Sau

đó, xác định hàm lượng polyphenol toàn phần ở các mẫu dựa trên mật độ quang đo được và đường chuẩn acid gallic đã xây dựng

2.3.2 Nghiên cứu xử lý số liệu thống kê bằng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM)

Tính toán và xử lý thống kê với mục đích phân tích sự ảnh hưởng của các yếu tố được khảo sát (nồng độ ethanol, nhiệt độ, thời gian) đến quá trình chiết xuất

polyphenol từ lá cây Trà hoa vàng (Camellia chrysantha (Hu) Tuyama) Số liệu được

xử lý thống kê bằng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM - Response Surface Methodology) với phần mềm R

Phương pháp đáp ứng bề mặt RSM là phương pháp được sử dụng để kiểm tra tác động của các biến độc lập và tương tác của chúng trong mô hình toán học, thường