SAO CHÉP ADN CƠ SỠ DI TRUYỀN HỌC

Cấu trúc nàygồm hai chuỗi đường-phosphat ở mặt ngoài của phân tử, trong khi đó các base nitơ ở bêntrong được nối với nhau bằng các liên kết hydroHình 1..  Mặc dù các base A, T, G, và C

 Các phân tử ADN của các loài, thậm chí các cơ quan có thể khác nhau về thànhphần, trật tự sắp xếp các nucleotid, nhưng đều có cấu trúc xoắn kép cơ bản Cấu trúc nàygồm hai chuỗi đường-phosphat ở mặt ngoài của phân tử, trong khi đó các base nitơ ở bêntrong được nối với nhau bằng các liên kết hydro

Hình 1 Cấu trúc phân tử xoắn kép của acid deoxyribonucleic (ADN)

(https://www.google.com.vn/search?tbm=isch&q=C%E1%BA%A5u+tr%C3%BAc+ph%C3%A2n+t

%E1%BB%AD+xo%E1%BA%AFn+k%C3%A9p+c%E1%BB%A7a+acid+deoxyribonucleic+

(ADN#imgrc=jZCyVe3y_p8tqM:)

 Mặc dù các base A, T, G, và C có kích thước khác nhau nhưng phân tử ADNvẫn có thể tự điều chỉnh để có được cấu trúc xoắn kép đối xứng qua trục Trình tự chuỗigiữa các base nitơ tạo nên thông tin di truyền Sự khác nhau trong trình tự chuỗi này làmtăng sự đa dạng của sinh vật Do đó, nếu xét nghiệm dấu ấn hồng cầu thì có thể biết được70% bí mật di truyền, nghĩa là hàng triệu người mới có hai người giống nhau, nhưng nếuxét nghiệm ADN thì biết được 99% bí mật di truyền, nghĩa là trên 70 tỉ người mới có haingười giống nhau

 Các base nối với nhau bằng liên kết hydro theo từng cặp bổ sung Nhờ đó, khichuỗi xoắn kép tách ra cho phép các base được sao chép tạo nên hai mạch mới, cơ bảngiống với phân tử ADN gốc, và đây là sự sao chép cơ bản trong hệ thống sinh học Cácenzyme xúc tác quá trình sao chép của ADN là các ADN - polymerase Một số enzymekhác cũng có vai trò nhất định trong tiến trình này

 Các yếu tố vật lý, hóa học… có thể tác động lên ADN, làm phá hủy ADN haygây đột biến, sự hư hại này có thể được sửa chữa Các yếu tố này còn có thể làm chết tếbào hoặc làm biến đổi bộ gen (genome) Tất cả những thay đổi này có thể di truyền đượcqua con đường sao chép ADN

II SỰ SAO CHÉP CỦA ADN:

 Người ta đưa ra hai cơ chế cơ bản của sự sao chép ADN: một cơ chế bảo tồntrong đó phân tử ADN con gồm hai chuỗi hoàn toàn mới hoặc cơ chế bán bảo tồn trong

đó phân tử ADN con gồm một chuỗi mẹ kết hợp với một chuỗi mới được tổng hợp Thínghiệm của Meselson và Stahl (1958) đã chứng minh sự sao chép ADN được thực hiệntheo cơ chế bán bảo tồn

1 Thí nghiệm của Meselson và Stahl:

 Trong thí nghiệm này, vi khuẩn Escherichia coli được cho phát triển vài thế hệtrong môi trường N15 để đảm bảo cho tất cả ADN của vi khuẩn đều là loại nặng, sau đóchuyển tế bào vào môi trường có chứa N14, như là nguồn cung cấp nitơ duy nhất và đểcho phân chia trong môi trường N14, khi khối lượng ADN tăng lên gấp đôi, ADN đượcchiết ra khỏi tế bào và được ly tâm trên thang nồng độ cesium clorid

Hình 2 Thí nghiệm Meselson và Stahl

 Nếu cơ chế bảo tồn được thực hiện, hai băng ADN phải được thấy rõ sau khi lytâm: một băng nguyên thủy (N15) và một băng chứa N14 Nếu theo cơ chế bán bảo tồnthì chỉ có một băng có tỷ trọng trung gian chứa N14.5 xuất hiện Nếu ADN được đunnóng, rồi làm nguội nhanh để tách hai mạch, ly tâm trên thang nồng độ cesium clorid sẽthấy hai băng tương ứng với ADN N15 và ADN N14 (Hình 2)

Bảng 1 Các thông số định lượng sự sao chép

(E coli) Eukaryotic (tế bào HeLa người nuôi

cấy) Hàm lượng ADN (cặp nucleotid/ tế bào) 3.9.x 106 khoảng 109

Tốc độ sao chép AND (nucleotide/giây/chạc

3 sao chép)

Thời gian hoàn tất sao chép bộ gen (giờ) 0.67 8

2 Các yếu tố cần thiết cho sự sao chép ADN:

 Quá trình sao chép ở tất cả mọi sinh vật đều cần: khuôn mẫu (đoạn phân tử ADN banđầu), Mg2+, 4 loại desoxyribonucleotid triphosphat (dNTP) và enzyme AND polymerase

Tiến trình này có thể được tóm tắt bằng phương trình : d(NMP)n + dNTP => d(NMP)n+1+ PPi

 Trong đó, dNTP là một desoxyribonucleotid triphosphat và d(NMP)n là mộtpolymer có n desoxyribonucleotid

 Pyrophosphat tạo ra sẽ được thủy phân thành phosphat vô cơ, làm phản ứng xảy

ra theo chiều phải, kéo dài chuỗi ADN Cơ chế tương tự cũng xảy ra trong việc hoạt hóaacid amin, sinh tổng hợp glycogen và hoạt hóa acid béo để tăng hiệu suất của sản phẩm

Hình 3 Sự hình thành liên kết phosphodiester giữa desoxy-ribonucleotid và 3’-OH củachuỗi ADN đang sao chép

(https://www.google.com.vn/search?tbm=isch&sa=1&q=+Si%C3%AAu+xo%E1%BA%AFn+d

%C6%B0%C6%A1ng+v%C3%A0+%C3%A2m+c%E1%BB%A7a+ADN&oq=+Si%C3%AAu+xo

ab.3 46288.47489.0.47736.2.2.0.0.0.0.111.208.1j1.2.0 0 1.1.64.psy-

%E1%BA%AFn+d%C6%B0%C6%A1ng+v%C3%A0+%C3%A2m+c%E1%BB%A7a+ADN&gs_l=psy-ab 0.0.0 0.fjXvjjyoToM#imgdii=bHkXGcaCUbLtUM:&imgrc=KTD_zv0biWCjhM:)

3 Các ADN polymerase:

 ADN polymerase I, II, III được tìm thấy ở nhân nguyên thủy Đặc tính của cácADN polymerase khác nhau được tóm tắt trong Bảng 2

Bảng 2 Đặc điểm của ADN polymerase từ E coli và retrovirus

Trọng lượng phân tử (Mr) 109 000 120 000 180 000

a 140 000 160 000a 65 000Cấu trúc, đơn vị nhỏ, Mr Một Một e 25 000

Polymer hóa 5’đến 3’ + + + +

Hoạt tính exonuclease

- ADN polymerase I của E coli là một chuỗi polypeptid lớn có trọng lượng phân

tử 109.000 Trong mỗi phân tử có chứa một nguyên tử kẽm Enzyme polymerase I chỉ cóthể xúc tác sự polymer hóa theo hướng 5’  3’ do sự thêm một nucleotid từ mộtdeoxyribonucleotid-5’-triphosphat vào nhóm 3’-hydroxy của chuỗi ADN (Hình 3)

 Tất cả ADN polymerase của nhân nguyên thủy cũng có hoạt tính exonuclease,

vì chúng thủy phân mạch đơn ADN của chuỗi từ đầu 3’theo hướng 3’  5’(hoạt tínhexonuclease 3’ đến 5’); hoặc chúng có thể thủy phân chuỗi ADN từ đầu 5’ (hoạt tínhexonuclease 5’ đến 3’) ADN polymerase II của E coli rất giống ADN polymerase Inhưng không có hoạt tính exonuclease 5’ đến 3’ ADN polymerase III được cấu tạo gồm

7 đơn vị nhỏ : a, b, g, d, e, q, và t Tất cả 7 đơn vị nhỏ này đều cần cho sự sao chép củaADN của E coli ADN polymerase III có thể là enzyme sao chép chính của E coli vì cácđột biến với ADN polymerase III ưa nhiệt không thể sao chép được ở nhiệt độ 42oC.ADN polymerase I chịu trách nhiệm sửa chữa các ADN hư hỏng Vai trò của ADNpolymerase II chưa rõ

 Ở tế bào nhân thật có 5 loại polymerase được biết là a, b, g, d, và e (Bảng 3) Bảng 3 ADN polymerase của nhân thật

Sửa chửa Sao chép

AND ty thể Sao chépAND nhiểm

sắc thể (sợdẫn)

Sao chépAND

nhiễm sắcthể

 Các enzyme này có cơ chế tác động tương tự với các enzyme của nhân nguyênthủy a và d polymerase liên quan tới sự sao chép của ADN nhiễm sắc thể b polymerasecấu tạo từ một chuỗi polypeptid đơn, đóng vai trò sữa chữa g polymerase được tìm thấytrong ty thể và chịu trách nhiệm sao chép ADN ty thể e ADN polymerase mới được tìmthấy gần đây, có một số điểm tương tự d polymerase về hoạt tính

 ADN ty thể có dạng vòng, và có hai chạc ba sao chép Sự tổng hợp ADN củanhiễm sắc thể vi khuẩn luôn luôn bắt đầu ở cùng một điểm Điểm này được gọi là vị tríOrigin hay vị trí OriC, là một vùng gồm 254 cặp bases Dùng các chủng vi khuẩn độtbiến, người ta đã chứng minh rằng chỉ có một số nhỏ trong số các base này là cần cho sựkhởi đầu sao chép Ở E coli, quá trình sao chép bắt đầu khi protein B nhận biết đượcđiểm khởi đầu sự sao chép (Ori)

 Các sợi ADN được tách ra và một sợi ADN có hướng 3'  5' sẽ được sao chéptrực tiếp bởi ADN polymerase III Sợi con bổ sung vừa tạo ra được gọi là sợi dẫn Sợigốc còn lại có hướng 5'  3', không được sao chép cho đến khi một phần của sợi gốcđược tháo xoắn Bản sao này được gọi là sợi muộn Sợi muộn được tổng hợp bằng mộtquá trình sao chép không liên tục Sự sinh tổng hợp sợi muộn và sợi dẫn được điều hòabởi sự tạo nút thắt của sợi muộn, nhờ đó sợi muộn cũng được tổng hợp cùng hướng vớisợi dẫn

Hình 4 Chạc ba sao chép trong quá trình sao chép AND

(https://www.google.com.vn/search?biw=1600&bih=784&tbm=isch&sa=1&q=Ch%E1%BA

%A1c+ba+sao+ch%C3%A9p+trong+qu%C3%A1+tr%C3%ACnh+sao+ch%C3%A9p+ADN&oq=Ch

%E1%BA%A1c+ba+sao+ch%C3%A9p+trong+qu%C3%A1+tr%C3%ACnh+sao+ch

ab 0.0.0 0.FHNH1q137DI#imgrc=RMY4MFLzBmcpYM:)

%C3%A9p+ADN&gs_l=psyab.3 339653.340613.0.340903.2.2.0.0.0.0.99.193.2.2.0 0 1.1.64.psy Việc sao chép không liên tục tạo ra các đoạn ADN ngắn vào khoảng 1000

-2000 nucleotid gọi là đoạn Okazaki (Hình 5) Các đoạn này sau đó được nối với nhau bởiADN ligase để tạo ra sợi ADN liên tục

ab 0.0.0 0.s9qP7UgVziU#imgrc=bW28xe1089vOBM:)

%C3%A9p&gs_l=psy-ab.3 417607.418679.0.418995.2.2.0.0.0.0.104.202.1j1.2.0 0 1.1.64.psy- Đoạn mồi (primer) ARN luôn luôn cần cho sự tổng hợp ADN ADN polymeraseđòi hỏi một đoạn ARN ngắn có đầu 3' - OH tự do để bắt đầu sự tổng hợp và để gắn đượcdesoxyribonucleotid vào mạch con, bổ sung được với ADN khuôn

 Mồi ARN được tổng hợp bởi một enzyme đặc biệt có tên gọi là primase Chúng có thểkéo dài sự khởi động chuỗi de novo Primase nhận ra trình tự đặc hiệu trên chuỗi ADNđơn Tự bản thân primase không hoạt động được, nó phải tạo phức hợp với vài chuỗipolypeptid để tạo thành primosome chức năng Các trình tự ARN được tạo ra bởiprimosome là những đoạn ngắn khoảng 5 - 10 base đặc hiệu Các protein nhận diện đượcgọi là N - protein, chọn các điểm (origin) trên ADN, tại đó primase có thể hoạt động Cácđoạn mồi ARN sẽ bị ADN polymerase I loại khỏi chuỗi ADN Enzyme này đồng thời làmnhiệm vụ lắp đầy các khoảng trống (GAP) bằng các deoxyribonucleotid thích hợp do việcloại mồi Các đoạn ADN được nối lại với nhau bởi ADN ligase tạo thành sợi ADN liêntục

b Cấu trúc theta (q):

 Sự sao chép ADN vòng tạo ra cấu trúc theta, hình thành bởi hai chạc ba saochép xuất phát từ một vị trí Origin Sự tổng hợp ADN được tiến hành theo cả hai chiềuthuận và nghịch kim đồng hồ cùng một lúc Để tạo ra các sợi đơn ADN, hai sợi ADN gốc

phải vặn xoắn (quay) Cứ mỗi 10 base được sao chép thì phân tử ADN phải vặn xoắn 1vòng

 Chạc ba sao chép của E coli cần phải di chuyển với tốc độ 800 base/giây, đòihỏi ADN gốc phải tháo xoắn với tốc độ 80 vòng/giây Sự tháo xoắn ADN gây ra hiệntượng siêu xoắn (supercoiling) Việc tháo xoắn sợi kép dẫn đến siêu xoắn âm, trong khi

đó, sự xoắn thêm sẽ dẫn đến siêu xoắn dương

%A7a+ADN&gs_l=psy-ab.3 910001.911437.0.912087.2.2.0.0.0.0.94.187.2.2.0 0 1.1.64.psy-ab 0.0.0 0.sZTjqDusako#imgrc=korrb77aTdmL5M:)

 Cơ chế sao chép bán bảo tồn của ADN đòi hỏi các điểm cắt ở một sợi hay ở cảhai sợi ADN để tách chuỗi Một nhóm enzyme, gọi là topoisomerase sẽ chuyển trạng tháitopo của ADN sang trạng thái khác Topoisomerase II còn gọi là gyrase tạo ra các dạngsiêu xoắn âm (phải sang trái) Topoisomerase I gắn với ADN, cắt một sợi, cho phép ADNxoắn kép quay quanh một điểm làm mất đi sự xoắn (hình 8)

Hình 7 Vai trò tháo xoắn ADN của topoisomerase I

(https://www.google.com.vn/search?tbm=isch&q=th%C3%A1o+xo%E1%BA%AFn+ADN+c%E1%BB

%A7a+topoisomerase+I#imgdii=hOhvm65hppfihM:&imgrc=E4l9-Q0K_XKfCM:)

Hình 8 Vai trò tách hai phân tử ADN mạch kép lồng vào nhau (catena) củatopoisomerase II (Gyrase)

(https://www.google.com.vn/search?

q=topoisomerase+II&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwiJgpGk7tbWAhWGXrwKHcaGB WMQ_AUICigB&biw=1600&bih=784#imgdii=GLnt7Wkwy7NW1M:&imgrc=WlxEtOoxpMlREM:)

 Phần Tyrosin của topoisomerase gắn với gốc phosphat tự do trên ADN gốc vàphức hợp sẽ quay Lúc bấy giờ, enzyme tách khỏi phức hợp và sợi ADN được tạo thành.Loại topoisomerase I tham gia vào quá trình tạo chạc ba ở vi khuẩn cũng được tìm thấy ở

tế bào động vật

 Hai sợi ADN lồng vào nhau được gọi là vòng lồng ghép (catena) hay ADN lồngghép và thường được tạo ra khi sao chép ADN vòng Loại topoisomerase II thường làmmất đi vòng catena, cắt sợi ADN và để phân tử ADN sợi kép đi xuyên qua điểm cắt, tạophân tử ADN kép mới (Hình 9)

 Có hai loại helicase khác nhau : một là Rep-protein gắn với ADN gốc, trực tiếptổng hợp sợi dẫn và di chuyển theo hướng 3'  5' Helicase thứ hai gắn với sợi khuôn kia

để tổng hợp sợi chậm, enzyme này tạo phức hợp với primase để tạo mồi ARN

d Các protein khác tham gia sao chép:

 Các SSB - protein (Single Stranded binding Protein) (protein căng mạch) giữcho các sợi đơn ADN do helicase tạo ra không chập lại với nhau Nhờ sự hiện diện củaSSB - protein mà ADN ở dạng tháo xoắn vững chắc, lý tưởng cho việc sao chép Nếu cácSSB - protein bị tách ra sẽ làm xuất hiện các nút kẹp tóc (hairpin loop) trong ADN gốc vànhư vậy sẽ ngăn chặn sự sao chép

 3 protein khác hỗ trợ cho việc gắn ADN polymerase và hợp đồng tác động nhưATPase, thủy phân ATP để tạo năng lượng tự do cho helicase hoạt động Tác động hiệpđồng của các protein này trong Hình 10 và chức năng của chúng được tóm tắt trong

Bảng 4 Chức năng của các protein sao chép quan trọng của E Coli

Protein B Nhận biết điểm Ori

N – protein Cho phép primase hoạt động

Primase Tổng hợp mồi ARN

Rep protein Tháo xoắn sợi dẫn

Helicase Tháo xoắn sợi chậm

SSB - protein Ổn định sợi ADN đơn

ADN polymerase III Tổng hợp AND

ADN topoisomerase I Cắt khía một sợi đơn AND

ADN topoisomerase II Cắt khía cả hai sợi đơn AND

ADN ligase Nối các đầu của polynucleotid đã hình thành

Hình 9 Cơ chế hoạt động của ADN ligase (NMN = Nicotinamide mononucleotide)

Điểm khác biệt cơ bản là ADN tế bào nhân thực có nhiều replicon, ví dụ ởSaccharomyces cerevisiae có tới 500 replicon tức là có 500 điểm Ori

 Cơ chế và sự điều hòa sao chép ở nhân thật đã được nghiên cứu bằng một môhình đơn giản, đó là nghiên cứu sự sao chép ADN virus trong tế bào động vật

 Hai loại virus, là Adenovirus và SV40 (virus linh trưởng) được dùng làm các

mô hình này Cơ chế sao chép của nhiễm sắc thể vòng của SV40 cũng tương tự với cơchế sao chép từ một vị trí khởi đầu (Ori) của nhiễm sắc thể nhân thật

Hình 10 Mô hình sao chép ở nhân thật (PCNA = proliferating cell nuclear antigen =kháng nguyên tăng sinh nhân tế bào)

(https://www.google.com.vn/search?tbm=isch&sa=1&q=+M%C3%B4+h%C3%ACnh+sao+ch

%C3%A9p+%E1%BB%9F+nh%C3%A2n+th%E1%BB%B1c&oq=+M%C3%B4+h

 Trong pha S, ADN được sao chép và lượng ADN tăng gấp đôi (Hình 13) Cáchistone mới cũng được tổng hợp trong pha này, tạo thành 2 bộ nhiễm sắc thể Tuy nhiên,các nhiễm sắc tử vẫn dính chung cho đến khi phân chia

 Pha G2 ngắn hơn pha G1, trong pha này người ta biết được ít những điều gì xảy

ra ở tế bào Pha G2 kết thúc với các dấu hiệu đầu tiên của sự phân bào

 Pha M hay pha phân bào dẫn đến sự hòa tan màng nhân, sự tách nhiễm sắc thể

và sự phân chia tế bào

Hình 12 Lượng ADN được tạo ra trong chu kỳ tế bào.

(https://www.google.com.vn/search?tbm=isch&q=L%C6%B0%E1%BB%A3ng+ADN+

%C4%91%C6%B0%E1%BB%A3c+t%E1%BA%A1o+ra+trong+chu+k%E1%BB%B3+t%E1%BA

%BF+b%C3%A0o#imgrc=EU5RACSeRzki6M:)

c Sự sao chép của ADN ty thể và lạp thể:

 Ty thể (mitochrondia) và có khi cả lạp thể (chloroplast), chứa ADN polymerase

Cụ thể là ở ty thể có ADN polymerase g Sự sao chép bắt đầu từ việc sao chép một sợicủa ADN gốc Sự sao chép này tiến hành chưa được nửa đường thì sự sao chép của sợikia bắt đầu Kết quả tạo nên cấu trúc D Kết quả của quá trình sao chép là hình thành sựlồng ghép (catenation) của 2 vòng ADN và topoisomerase II cần cho việc tách đôi 2 vòngkép ADN ty thể

Hình 13 Sự hình thành cấu trúc D trong quá trình sao chép ADN ty thể.

(https://www.google.com.vn/search?tbm=isch&q=.+S%E1%BB%B1+h%C3%ACnh+th%C3%A0nh+c

%E1%BA%A5u+tr%C3%BAc+D+trong+qu%C3%A1+tr%C3%ACnh+sao+ch%C3%A9p+ADN+ty+th

%E1%BB%83#imgrc=Bf3U76KfA5hxFM:)

6 Sự sao chép ADN virus:

 Vì virus có nhiều loại acid nucleic, nên sự sao chép cũng diễn ra theo nhiềucách Trong đó, có 2 cách được đề cập sau đây

 Thực khuẩn thể T7 có chứa mạch kép ADN dạng thẳng In vivo virus T7 tạo raprimase, ADN polymerase và SSB – protein T7 là một Bacteriophage điển hình và tạo ramột mạch đơn ADN dài, trong đó, đơn vị bộ gen (genome) được lặp lại

 Endonuclease đặc hiệu tạo ra các điểm cắt khía, tạo ra các phân tử ADN riêngbiệt, từ đó phân tử ADN chuyên biệt được hình thành

 Retrovirus sao chép các sợi đơn của chúng tạo ra sợi ADN bổ sung bằng cáchdùng reverse transcriptase (Hình 16) ADN bổ sung này được dùng làm khuôn để tạo racác bản sao của bộ gen ARN của virus