Xác định hỗn hợp Cafein và Paracetamol trong mẫu dược phẩm bằng HPLC

HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn

1.Kháiniệm

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên

cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột

là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt

Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia th c ph m trong lĩnh v c

th c ph m, dượcph m, môitrường…

2 Phân loại và định nghĩa

Trong HPLC tùy thuộc vào bản chất của quá trình sắc ký của pha tĩnh trong cột tách mà có thể phân thành các loại sắc ký

- Sắc ký pha thuận ( Normal phase : NP-HPLC) :là Sắc ký có thành phần

pha tĩnh phân c c và pha dộng mang tính không phân c c

- Sắc ký pha đảo ( Reversae phase : RP- HPLC) Sắc ký có thành phân pha

tĩnh không phân c c và thành phần pha động phân c c

- Sắc ký trao đổi ion ( Ion exchange: IE-HPLC) :

Sắc ký trao đổi ion d a trên hiện tượng trao đổi thuận nghịch giữa các ion linh động của pha tĩnh rắn với các ion trong DD phân tích, khi cho DD này đi qua cột được nạp đầy pha tĩnh Các pha tĩnh trong trường hợp này được gọi là chất trao đổi ion

- Sắc ký ghép cặp Ion (Ion Pair: IP-HPLC) :

Sắc ký ghép cặp ion là một biên thể của sắc ký pha đảo trong đó pha tĩnh

và pha động như sắc ký pha đảo Điều khác biệt là trong sắc ký ghép cặp ion phải tạo điều kiện để chất phân tích phải ở dạng ion hóa hoàn toàn (bằng cách điều chỉnh pH)

- Sắc ký rây phân tử( Size exclution chromatography SEC-HPLC) :

Sắc ký rây phân tử là phương pháp chia tách các phân tử trong dung dịch

d a trên kích thước của chúng Trong trường hợp pha động là một dung môi hữu

cơ, kỹ thuật được gọi là sắc ký thấm qua gel, còn trường hợp pha động là nước thì kỹ thuật được gọi là sắc ký lọc trên gel

- Sắc ký tách đồng phân quang học (Chiral separation) :

Phương pháp này d a trên một phản ứng hóa học giữa hai đồng phân đối quang với một hợp chất bất đối tạo thành hỗn hợp hai đồng phân lập thể nhưng không đối quang trước khi được phân tách bằng điện di

3 Quá trình tách :

Do s tương tác khác nhau giữa các chất phân tích và vật liệu nhồi cột mà quá trình tách xảy ra

Hình 1 : Quá trình phân tách chất trong sắc ký cột

Một số ưu điểm của HPLC:

- Điều kiện phân tích khá dễ dàng:

+ Không cần bay hơi mẫu như GC, do đó phân tích được các chất kém bên nhiệt

- Dễ dàng thu hồi chất phân tích với độ tinh khiết cao nếu gắn bộ thu hồi phân đoạn (fraction collector) , thường dùng trong điều chế, tách tinh dầu, dược

ph m…

- Độ lặp lại cao

- Thường không phân hủy mẫu

Cách lựa chọn sắc ký:

Loại sắc ký Dung môi sử dụng Chất phân tích

Sắc ký pha đảo H2O/Đệm , ACN, MeOH Các chất trung hòa hoặc

không ion hóa, tan trong hỗn hợp nước/dung môi hữu cơ

Sắc ký ghép cặp ion Giống RP nhưng thêm

chất tạo cặp ion

Các chất dạng ion hoặc có thể ion hóa

Sắc ký pha thuận Hexane, CH 2 Cl 2 Hỗn hợp các chất không

tan trong hỗn hợp dung môi hữu cơ – nước

Sắc ký trao đổi ion H2O/Đệm Các ion vô cơ, protein,

axit nucleic Sắc ký rây phân tử H2O, THF, DMF… Các chất có phân tử lượng

lớn Sắc ký Chiral Hỗn hợp dung môi Các đồng phân quang học

hữu cơ – nước

- Ở bài th c hành này ta sử dụng sắc ký pha đảo để phân tách hỗn hợp Paracetamol, Cafein trong dược ph m

II Câu hỏi chuẩn bị :

Câu 1: Cấu tạo một hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao

Cấu tạo một hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao gồm: Bình chứa pha động,

bộ phận khử khí, bơm cao áp, bộ phận tiêm mẫu, cột sắc ký (pha tĩnh), đầu dò ,

hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống, in dữ liệu

Bình chứa pha động :

- Máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp cho phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng một lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn và tổng tỉ lệ của 4 đường là 100%

-Tuy nhiên, theo kinh nghiệm, ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùng một lúc mà thường sử dụng 2 hoặc 3 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn giúp ổn định quá trình rửa giải

- Tất cả dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết sử dụng cho HPLC Tất cả các hóa chất dùng để chu n bị mẫu và pha hệ đệm đều phải là hóa chất tích khiết dùng cho phân tích

- Việc sử dụng hóa chất tinh khiết nhằm tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo nên các peak tạp trong quá trình phân tích

Bộ khử khí Degases

Mục đích sử dụng bộ khử khí nhằm lọai trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động, tránh xảy ra một số hiện tượng có thể có như sau:

-Tỷ lệ pha động của các đường dung môi không đúng làm cho thời gian lưu của peak thay đổi

- Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể lọai trừ hết được thì bơm cao áp có thể không hút được dung môi, khi đó ảnh hưởng đến áp suất

và hoạt động của cả hệ thống HPLC

Trong các trường hợp trên đều dẫn đến sai kết quả phân tích

Bơm cao áp

Mục đích để bơm pha động vào cột th c hiện quá trình chia tách sắc ký Bơm phải đạt được áp suất cao khoảng 250-600bar và tạo dòng liên tục Lưu

lượng bơm từ 0.1 đến 10ml/phút

Bộ phận tiêm mẫu

Để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm có thể thay đồi

Có 2 cách đưa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu t động (autosamper)

Cột sắc ký

Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột thay đổi từ 5-25cm đường kính trong 1-10mm, hạt nhồi cỡ 0.3-5µm,…Chất nhồi cột phụ thuộc vào lọai cột và kiểu sắc ký

Đầu dò

- Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng Tùy theo tính chất của các chất phân tích mà người ta l a chọn lọai đầu dò phù hợp

- Tín hiệu đầu dò thu được có thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất,…

- Trên cơ sở đó, người ta sản xuất các lọai đầu dò sau:

+Đầu dò quang phổ tử ngọai 190-360nm để phát hiện UV

+ Đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) (190-900nm) để phát hiện các chất hấp thụ quang Đây là lọai đầu dò thông dụng nhất

+Đầu dò huỳnh quang (RF) để phát hiện các chất hữu cơ chứa huỳnh quang

t nhiên và các dẫn suất có huỳnh quang

+Đầu dò DAD (Detector Diod Array) có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thụ c c đại của các chất

+ Đầu dò khúc xạ (chiết suất vi sai) thường dùng đo các loại đường

+ Đầu dò điện hóa: đo dòng, c c phổ, độ dẫn

+ Đầu dò đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt,…

Bộ phận ghi nhận tín hiệu

Bộ phận này ghi tín hiệu do đầu dò phát hiện

Đối với các hệ thống HPLC hiện đại, phần này được phần mềm trong hệ thống ghi nhận, lưu các thông số, sắc ký đồ, các thông số liên quan đến peak như tính đối xứng, hệ số phân giải,… đồng thời tính toán, xử lý các thông số liên quan đến kết quả phân tích

In dữ liệu

Sau khi phân tích xong, dữ liệu sẽ được in ra qua máy in kết nối với máy tính có cài phần mềm điều khiển

Câu 2: Cơ chế hoạt động của van tiêm mẫu trong sắc kí lỏng

Mẫu lỏng hoặc dung dịch được tiêm thẳng vào pha động cao áp ngay ở đầu cột mà không cần dừng dòng bằng một van tiêm 6 cổng có vòng chứa mẫu (sample loop) Vòng chứa mẫu có dung tích khác nhau

Có 2 cách tiêm mẫu:

•Tiêm bằng tay với vòng mẫu có thể tích xác định hoặc dùng micro xilanh

•Hệ bơm mẫu t động theo chương trình định sẵn

Tiêm bằng tay

-Cắm xilanh vào cổng tiêm ở vị trí inject

-Vặn van về vị trí load Lúc này pha động vãn đang được bơm vào cột Tiêm mẫu này giúp thể tích mẫu tiêm luôn luôn giống nhau

-Vặn về inject, lúc này nhờ s di chuyển của van 6 cổng pha động được nối với mẫu vừa tiêm vào loop và đ y mẫu vào cột Bắt đầu quá trình chạy sắc ký -Rút xilanh khỏi cổng tiêm, rửa cổng tiêm

Tiêm t động: Mẫu được chu n bị sẵn và chứa trong bình chứa, bằng phần mềm cài đặt sẵn, hệ thống sẽ t tiêm mẫu và chạy sắc ký

Câu 3 Nguyên tắc hoạt động của đầu dò UV:

Khi không có mẫu qua detector ánh sáng đi qua dòng pin và phát ra tín hiệu lớn nhất tại dòng cảm biến, nếu một mẫu có bước sóng đi qua detector, mẫu này làm giảm lượng ánh sáng ở dòng cảm biến và là nguyên nhân làm thay đổi tín hiệu ở detector Tín hiệu này chuyển một dòng electron và xuất hiện sắc phổ trên máy tính Tín hiệu hiển thị tăng lên tập trung ở mẫu của dòng pin Detector cũng phản ứng lại để thay đổi theo dòng pin

Câu 4 Cách xác định LOD, LOQ trong bài

Bước 1: Xác định phương trình hồi quy tuyến tính

Bước 2: LOD =

LOQ = hoặc LOQ = LOD

Câu 5 Cách xác đinh phương trình hồi quy tuyến tính trong bài

D a vào sắc ký đồ tìm ra giá trị diện tích peak tương ứng với nồng độ Caffein có trong từng bình chu n Rồi từ đó ta lập bảng chứa giá trị: nồng độ Caffein (ppm) và Speak

Bấm máy tính: Mode  3: Stat  2: A+BX  nhập giá trị cột X là nồng

độ Caffein và cột Y là Speak , khi nhập tới giá trị cuối cùng của cột Y nhấn =

nhấn AC Để tìm giá trị của A ta nhấn Shief 1 rồi chọn 5: Reg  chọn 1: A

 nhấn = ta được giá trị của A Để tìm giá trị của B ta nhấn Shief 1 rồi chọn 5: Reg  chọn 2: B  nhấn = ta được giá trị của B

Phương trình hồi quy tuyến tính của paracetamol có dạng Y = A + BX: làm tương t Caffein

Câu 6 Tại sao trong sắc ký khí thì thường sử dụng phương pháp nội chuẩn còn trong sắc ký lỏng dùng phương pháp ngoại chuẩn?

Trong sắc ký khí để có độ chính xác cao khi sử dụng kỹ thuật đường chu n, thì chúng ta phải xử lý tương t nhau đối với tất cả mẫu và chu n và cần tiêm vào máy sắc ký các thể tích mẫu như nhau Điều đó rất khó và không thể, cũng như độ đúng và độ chính xác có ảnh hưởng khi sử dụng kỹ thuật tiêm mẫu bằng tay Vì thế để khắc phục hạn chế đó, kỹ thuật nội chu n được sử dụng cho sắc ký khí

Sử dụng phương pháp nội chu n trong sắc ký khí là phương pháp cho phép

ta xác định chính xác nồng độ của chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng đáng kể bởi thể tích tiêm mẫu giữa các lần tiêm

Ngoài ra, chất nội chu n dùng trong sắc ký khí với mục đích để loại bỏ sai

số do tiêm mẫu bằng tay Chất nội chu n được dùng phải tương t về mặt hóa học với chất phân tích và có nồng độ tương t nồng độ chất phân tích

Mặt khác, so với phương pháp ngoại chu n thì phương pháp nội chu n cho kết quả với độ sai số ít hơn nhiều

Trong sắc ký khí thường sử dụng phương pháp nội chu n còn trong sắc ký lỏng dùng phương pháp ngoại chu n

Câu 7: Quá trình tối ưu tách sắc ký dựa trên các thông số của sắc ký

đồ

Mục đích của quá trình tối ưu hóa là có được s tách hoàn toàn các chất cần phân tích trong thời gian ngắn nhất khi đi qua cột

Để có được tối ưu quá trình sắc ký người ta phải sử dụng những nguồn sẵn

về thiết bị, phần mềm để mô phỏng được những kết quả thu được từ s thay đổi các thông số vật lí khác

Quá trình tối ưu hóa đồng nghĩa với việc chọn l a: cột, chiều dài cột, đường kính cột, thành phần pha tĩnh trong cột, độ phân giải, tốc độ dòng và thành phần pha động Tất cả những yếu tố này lại tương tác với nhau Ví dụ phân giải R và thời gian chu kỳ tỷ lệ nghịch với nhau

Nhưng trên th c tế việc thay đổi các thông số cố định (như cột ,chiều dài cột , , đường kính cột , pha tĩnh nhồi cột …) như vậy rất khó khăn và tổn phí lớn

vì vậy khi cần tối ưu hóa ta ưu tiên đến các thông số có thể thay đổi như (thành phân pha động, độ phân giải hay nồng độ… )

III Tiến Hành Thí nghiệm và xử lý kết quả đo

Chuẩn bị dung dich chuẩn:

Pha chu n hỗn hợp 25ml *CAF 10ppm và *PAR 2ppm từ chất gốc 100ppm

và 118ppm

Cách pha d a vào CT : NV1=NV2

Vậy cần hút 2,5ml CAF 100ppm và hút 0,42 mL PAR 118ppm định mứt trong binh 25mL

Pha chu n đơn: cung tương t ta cũng rút từng chất cho vào binh định mức 25ml đinh mức tới vạch

Lọc qua màng lọc 0.45 µm

Khảo sát thành phần pha động:

Khi cho dung dịch chu n hỗn hợp PAR, CAF vào HPLC tiến hành chạy lần lượt với các tỉ lệ pha động khác nhau Từ 3 sắc ký đồ ta thấy đươc giữa các tỷ lệ thanh phân pha động thi tỉ lệ 50:50 cho 2 sắc ký đồ của PAR, CAF là gần nhau nhất nghĩa là thời gian lưu TR là ngắn nhất Vậy phân tách hỗn hợp ở tỷ lệ trên

là có độ tối ưu hóa cao

Pha các hỗn hợp chuẩn ở các nồng độ khác nhau từ dung dịch chuẩn gốc 100ppm, 118ppm

Nồng độ CAF sau

Thể tích dung dịch

CAF gốc 100ppm

(mL)

Nồng độ PAR sau

Thể tích dung dịch

PAR gốc 118ppm

(mL)

0,212 0,423 0,635 1,06 2,12

Xử lí các hỗn hợp chu n tiến hành đo trong hệ thông HPLC

Phân tích mẫu thuốc

Tiến hành xử lí mẫu thuốc Padadol Extra (1 viên thuốc có khối lượng khoảng 0,6g) Sau đó lấy 0,255 g mẫu thuốc tiến hành định mức lấy dung dich

mẫu xử lí lọc đánh siêu âm sau đó tiêm vào HPLC

Xử Lí Kết Quả Đo

Từ các sắc ký đồ ta thu được các số liệu sau :

Khối lượng 1 viên thuốc m= 0.5967 (g)

C huẩn 2 Chuẩn 3 Chuẩn 4 Chuẩn 5

Mẫu thuốc

Đồ thị tuyến tính Diện tích peak của CAF theo nồng độ: (ppm)

Đồ thị tuyến tính Diện tích peak của PAR theo nồng độ (ppm)

y = 78,938x + 34,209 R² = 0,9897

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

ppm

Đồ thị S-ppm của CAF

y = 24,109x + 18,98 R² = 0,9874

0

50

100

150

200

250

300

ppm

Đồ Thị S-ppm của PAR

Đồ thị tuyến tính Diện tích peak của PAR theo nồng độ: (ppm)

Kết quả tính toán:

Khối lượng viên thuốc m=0,5976 trong đó: khối lượng PAR 500mg; khối lượng CAF 65mg

Lập luận : Khi xử lý mẫu viên thuốc và hòa tan trong 1 lit dung dịch thì nồng độ ppm của PAR và CAF là 500ppm và 65ppm Tương đương trong 250ml thi sẽ

có nông độ là CPAR=

-Nhận xét thấy rằng nồng độ ppm rất lớn và hệ số pha loãng cao dụng cụ không thể hổ trợ được nên th c hiện chia đôi khối lượng viên thuốc ra Cho khối lượng PAR, CAF là phân bố đông đều thì sẽ được 250mg PAR và 37,5mg CAF

Tính nồng độ ppm của CAF, PAR trong 250 ml dung dich

CPAR=

=1000ppm và CCAF =

=130 ppm

Để được khoảng CPAR,CCAF trong vung tuyến tính thì

1ppm CPAR 10ppm

1ppm CCAF 20ppm

thì nồng độ pha loãng 100 lần

=100 vậy Vxd= 1ml (định mức ở 100ml) Với nữa khối lượng viên thuốc thì hòa tan thành 250 ml dd thì sẽ có nồng độ

CPAR=10ppm và CCAF=1,3ppm vậy ta có thể chon khối lượng viên thuốc nhỏ hơn 0,2988(g)

Cân 0,2565 g thuốc Panadol extra hòa tan vào bình định mức 250ml Rút 1mL đinh mức thành 100mL Xử lý mẫu đê tiêm vào HPLC phân tách

Nồng độ của PAR và CAF trong mẫu

Thế S peak CAF đo được của mẫu vào pt đường tuyến tính giữa S-ppm CAF

y = 78,938x + 34,209 => CCAF= 0,311 ppm

Thế S peak CAF đo được của mẫu vào pt đường tuyến tính giữa S-ppm PAR

y = 24,109x + 18,98 => CPAR = 5,56 ppm

Hàm lượng PAR và CAF trong mẫu:

CAF= 0,311

-6

= 0,015 (g)

PAR=5,56

-6

= 0,278 (g)