Luận văn ảnh hưởng của chế phẩm carotenoid thu nhận từ nấm men rhodotorula sp 3 lên gia cầm chuyên trứng isabrown

Nấm men Rhodotorula là một trong rất ít giống nấm men có khả năng tổng hợp một lượng lớn các sắc tố carotenoid trong đó chủ yếu là beta – carotene, một hợp chất có hoạt tính sinh học ca

NGUYỄN THỊ TÚ MINH

CAROTENOID THU NHẬN TỪ NẤM MEN

RHODOTORULA SP.3 LÊN GIA CẦM

CHUYÊN TRỨNG ISABROWN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2010

Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến TS Nguyễn Hữu Phúc

và nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Minh Nguyệt đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để em hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Em xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô khoa Sinh học trường Đại học Khoa học tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình dạy dỗ, truyền đạt những kinh nghiệm, kiến thức quý báu cho em trong những năm qua

Xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô, các anh, chị cán bộ, các bạn sinh viên đang công tác và thực tập tại khoa Thực phẩm – Sinh học trường Đại học Công nghiệp Tp.HCM, trường Đại hoc Bách khoa Tp.HCM, trường Đại học Bà Rịa – Vũng tàu và khoa chăn nuôi chuyên khoa trường Đại học nông lâm đã giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin gửi lời cảm ơn đến các bạn trong lớp sinh hóa k17 đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Cuối cùng, con xin cảm ơn ba, mẹ, anh chị và những người thân trong gia đình

đã giúp con có được sự thành đạt ngày hôm nay

Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn tất cả Chúc quý Thầy Cô dồi dào sức khỏe và thành đạt hơn nữa trong cuộc sống

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 03 năm 2010

NGUYỄN THỊ TÚ MINH

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số nghiên cứu về sinh tổng hợp carotenoid từ nấm men Rhodotorula 19

Bảng 1.2 Mối quan hệ giữa chiều cao lòng trắng, trọng lượng trứng và chỉ số Haugh

32

Bảng 2.1 Thành phần gạo tấm sử dụng 33

Bảng 2.2 Thành phần bã đậu nành của Vinamilk 34

Bảng 2.3 Thành phần thức ăn star feed GĐ26 dùng trong thí nghiệm đối chứng 37

Bảng 2.4 Công thức thức ăn của lô đối chứng 38

Bảng 2.5 Mức khảo sát của các nồng độ KH2PO4, MgSO4, NaNO3 và Saccarose để tìm thí nghiệm tại tâm 42

Bảng 2.6 Ma trận qui hoạch thực nghiệm phương án quay bậc 2 43

Bảng 2.7 Mức biến thiên của các nồng độ KH2PO4, MgSO4, NaNO3 và Saccharose 44

Bảng 2.8 Các mức khảo sát điều kiện nuôi cấy để tìm thí nghiệm tại tâm 45

Bảng 2.9 Mức biến thiên của các yếu tố điều kiện nuôi cấy 45

Bảng 2.10 Ma trận qui hoạch thực nghiệm 3 yếu tố theo phương án quay bậc 2 46

Bảng 2.11 Bố trí thí nghiệm trên gà chuyên trứng IsaBrown 60

Bảng 3.1 Khả năng tổng hợp beta-carotene tại các nồng độ KH2PO4 khác nhau 66

Bảng 3.2 Khả năng tổng hợp beta-carotene tại các nồng độ MgSO4 khác nhau 67

Bảng 3.3 Khả năng tổng hợp beta-carotene tại các nồng độ NaNO3 khác nhau 68 Bảng 3.4 Khả năng tổng hợp beta-carotene tại các nồng độ Sac bổ sung khác nhau 68 Bảng 3.5 Hàm lượng beta-carotene theo số liệu thực nghiệm tối ưu dinh dưỡng 70

Bảng 3.6 Các hằng số bj tính theo các số liệu thực nghiệm tối ưu dinh dưỡng 71

Bảng 3.7 Các hệ số hồi qui tj tính theo các số liệu thực nghiệm tối ưu dinh dưỡng 71

Bảng 3.8 Các phương sai và F theo các số liệu thực nghiệm tối ưu dinh dưỡng 71

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng tổng hợp beta – carotene 74

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của độ dày lớp môi trường đến khả năng tổng hợp beta – carotene 74

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến khả năng tổng hợp beta – carotene 75

Bảng 3.12. Hàm lượng beta-carotene theo số liệu thực nghiệm tối ưu các yếu tố điều kiện nuôi cấy 76

Bảng 3.13 Các hằng số bj tính theo các số liệu thực nghiệm tối ưu điều kiện 77

Bảng 3.14 Các hệ số hồi qui tj tính theo các số liệu thực nghiệm tối ưu điều kiện 77

Bảng 3.15 Các phương sai và F theo số liệu thực nghiệm tối ưu các yếu tố điều kiện nuôi cấy 77

Bảng 3.16 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình sinh tổng hợp beta – carotene từ Rhodotorula sp.3 trên môi trường nuôi bán rắn 80

Bảng 3.17 Thành phần dinh dưỡng của chế phẩm giàu carotenoid 82

Bảng 3.18 Công thức phối trộn thức ăn cho gia cầm chuyên trứng ở lô 1 84

Bảng 3.19 Công thức phối trộn thức ăn cho gia cầm chuyên trứng ở lô 2 84

Bảng 3.20 Công thức phối trộn thức ăn cho gia cầm chuyên trứng ở lô 3 85

Bảng 3.21 Công thức phối trộn thức ăn cho gia cầm chuyên trứng ở lô 4 85

Bảng 3.22 Công thức phối trộn thức ăn cho gia cầm chuyên trứng ở lô 5 86

Bảng 3.23 Năng suất trứng ở các tuần thí nghiệm 87

Bảng 3.24 Khối lượng trứng gà qua các đợt thí nghiệm 89

Bảng 3.25 Chỉ số hình dạng của trứng gà ở các lô qua các đợt thí nghiệm 90

Bảng 3.26 Chỉ số Haugh của trứng gà ở các lô qua các đợt thí nghiệm 92

Bảng 3.27 Màu lòng đỏ của trứng gà ở các lô qua các đợt thí nghiệm 93

Bảng 3.28 Tỷ lệ lòng đỏ của trứng gà (%) ở các lô qua các đợt thí nghiệm 95

Bảng 3.29 Tỷ lệ lòng trắng đặc của trứng gà (%) ở các lô qua các đợt thí nghiệm 96

Bảng 3.30 Tỷ lệ vỏ của trứng gà ở các lô qua các đợt thí nghiệm 98

Bảng 3.31 Độ dày vỏ của trứng gà (mm) ở các lô qua các đợt thí nghiệm 99

Bảng 3.32 Tỷ lệ gà sống sót qua các đợt thí nghiệm 101

Bảng 3.33 Hàm lượng Beta – carotene và Vitamin A ở các lô thí nghiệm 102

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Tế bào nấm men Rhodotorula glutinis 1

Hình 1.2 Khuẩn lạc Rh.mucilaginosa 3

Hình 1.3 Khuẩn lạc Rh.rubra 3

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của các carotenoid quan trọng 13

Hình 1.5 Phân loại carotenoid 15

Hình 1.6 Con đường sinh tổng hợp carotenoid 17

Hình 1.7 Các phản ứng dehydro hóa trong quá trình sinh tổng hợp caroteniod 18

Hình 1.8 Tổng hợp carotenoid có vòng từ lycopene 18

Hình 1.9 Công thức cấu tạo beta-carotene 21

Hình 1.10 Cấu trúc không gian của beta-carotene 21

Hình 1.11 Sơ đồ chuyển hóa beta-carotene thành vitamin A 24

Hình 1.12 Gà IsaBrown 27

Hình 2.1 Gạo tấm phụ phẩm 33

Hình 2.2 Bã đậu nành của công ty Vinamilk 34

Hình 2.3 Khuẩn lạc chủng nấm men Rhodotorula sp.3 35

Hình 2.4 Cấy chuyền giữ giống trên môi trường thạch malt trong ống nghiệm 35

Hình 2.5 Sơ đồ quy trình nuôi cấy và tiến hành thí nghiệm 39

Hình 2.6 Canh trường nấm men ở ngày 7 41

Hình 2.7 Tủ sấy và cân phân tích Sartorius 48

Hình 2.8 Máy cất đạm bán tự động Kjeltec 2200 49

Hình 2.9 Máy soctec 2050 của FOSS 51

Hình 2.10 Lò nung 53

Hình 2.11 Máy pH kế 59

Hình 2.12 Thước kẹp đo chiều dài và chiều rộng trứng 62

Hình 2.13 Quạt so màu Roche 63

Hình 2.14 Thước vi cấp 64

Hình 3.1 Đồ thị quá trình sinh tổng beta - carotenetheo thời gian 80

Hình 3.2 Chế phẩm βCR 81

Hình 3.3 Năng suất trứng 88

Hình 3.4 Trứng gà trên mặt phẳng kính 95

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Khối lượng trứng(g) trung bình qua các đợt thí nghiệm 89

Biểu đồ 3.2 Chỉ số hình dạng của trứng gà trung bình qua các đợt thí nghiệm 91

Biểu đồ 3.3 Chỉ số Haugh của trứng gà trung bình qua các đợt thí nghiệm 92

Biểu đồ 3.4 Màu lòng đỏ trứng gà trung bình qua các đợt thí nghiệm 94

Biểu đồ 3.5 Tỷ lệ lòng đỏ của trứng gà (%) trung bình qua các đợt thí nghiệm 95

Biểu đồ 3.6 Tỷ lệ lòng trắng đặc của trứng gà (%) trung bình qua các đợt thí nghiệm 97

Biểu đồ 3.7 Tỷ lệ vỏ trứng gà (%) trung bình qua các đợt thí nghiệm 98

Biểu đồ 3.8 Độ dày vỏ của trứng gà (mm) trung bình qua các đợt thí nghiệm 100

Biểu đồ 3.9 Hàm lượng beta – carotene và vitamin A ở các lô thí nghiệm 102

LỜI MỞ ĐẦU

Công nghệ sinh học phát triển nhanh chóng tạo ra cuộc cách mạng trong các ngành nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm, làm thay đổi phương thức sản xuất trong các ngành y dược, vật liệu mới, năng lượng khai khoáng và bảo vệ môi trường

Một trong những thành tựu phải kể đến của công nghệ sinh học là việc tận dụng

các phế phẩm và những nguồn nguyên liệu rẻ tiền để tạo ra những sản phẩm có chất lượng cao, giảm nguy cơ ô nhiễm môi trường, mang lại hiệu quả kinh tế cho xã hội

Việt Nam là một nước nông nghiệp, các phế phụ phẩm của ngành nông nghiệp, thực phẩm rất nhiều nhưng trong chăn nuôi phải nhập khẩu thức ăn với chi phí rất cao, chiếm hơn 70% chi phí trong chăn nuôi

Nguồn thức ăn thực vật rất dồi dào tại Việt Nam như tấm, khoai mì, cám… dùng chủ yếu trong chăn nuôi gia cầm, gia súc hầu như không có sắc tố vàng carotenoid Vì vậy mà trứng sản xuất ra từ các nguồn nguyên liệu này không phù hợp với thị hiếu của người tiêu dùng, đồng thời do gia cầm, gia súc bị thiếu sắc tố vàng nên sức đề kháng yếu, dễ sinh bệnh tật, giảm tỷ lệ đẻ

Vitamin A có vai trò rất quan trọng trong đời sống con người và vật nuôi Nguồn nguyên liệu thực vật và vi sinh vật được xem là các nguồn cung cấp dồi dào sắc tố carotenoid nói chung và tiền vitamin A nói riêng

Nấm men Rhodotorula là một trong rất ít giống nấm men có khả năng tổng hợp

một lượng lớn các sắc tố carotenoid trong đó chủ yếu là beta – carotene, một hợp chất

có hoạt tính sinh học cao có vai trò quan trọng trên người, gia súc, gia cầm, Ngoài việc được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực y học, beta – carotene còn được quan tâm hơn khi bổ sung vào các loại thực phẩm cho người và thức ăn gia súc nhằm nâng cao

giá trị dinh dưỡng, cũng như cải thiện và giảm thiểu một số bệnh do thiếu vitamin A

Bên cạnh đó, tại các nước có nền sinh học phát triển nấm men Rhodotorula đã được

nghiên cứu và được sử dụng như một nguồn cung cấp chất màu thực phẩm an toàn, sinh khối nấm men có giá trị dinh dưỡng cao được dùng trong chăn nuôi

Từ các vấn đề trên, đề tài “Ảnh hưởng của chế phẩm carotenoid thu nhận từ

nấm men Rhodotorula sp.3 lên gia cầm chuyên trứng IsaBrown” được thực hiện

nhằm mục đích nghiên cứu ứng dụng việc nuôi cấy nấm men Rhodotorula trên môi

trường tấm gạo để tạo ra chế phẩm giàu giá trị dinh dưỡng dùng làm thức ăn trong

chăn nuôi. Đề tài được thực hiện với mong muốn tạo ra được chế phẩm thức ăn giàu giá trị dinh dưỡng, đặc biệt có thêm sắc tố beta - carotene; góp phần vào sự đa dạng hóa các sản phẩm thức ăn dùng trong chăn nuôi, nâng cao giá trị dinh dưỡng, cải thiện nâng suất và chất lượng của vật nuôi và gia cầm

MỤC LỤC

X W

Trang phụ bìa

Lời cảm ơn

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

Danh mục các biểu đồ

Lời mở đầu

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1

1.1 NẤM MEN RHODOTORULA 1

1.1.1 Phân loại 1

1.1.2 Phân bố 2

1.1.3 Hình thái, kích thước tế bào 2

1.1.4 Cấu tạo và sinh sản của nấm men Rhodotorula 3

1.1.4.1 Cấu tạo 3

1.1.4.2 Sinh sản 5

1.1.5 Đặc điểm sinh hóa 6

1.1.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy nấm men Rhodotorula 7

1.1.6.1 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng 7

1.1.6.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy 9

1.1.7 Giá trị dinh dưỡng của sinh khối nấm men Rhodotorula 10

1.2 GIỚI THIỆU VỀ CAROTENOID 12

1.2.1 Tổng quan về carotenoid 12

1.2.1.1 Định nghĩa 12

1.2.1.2 Lịch sử của carotenoid 12

1.2.1.3 Danh pháp và cấu tạo 12

1.2.1.4 Phân loại 14

1.2.1.5 Tính chất 15

1.2.2 Cơ chế sinh tổng hợp sắc tố carotenoid ở vi sinh vật 16

1.2.2.1 Cơ chế sinh tổng hợp sắc tố carotenoid ở vi sinh vật 16

1.2.2.2 Một số nghiên cứu về sinh tổng hợp carotenoid của nấm men Rhodotorula 19

1.2.3 Hợp chất beta - carotene – tiền vitamin A 20

1.2.3.1 Tầm quan trọng của beta – carotene đối với sức khỏe của người và động vật 20

1.2.3.2 Cấu tạo 20

1.2.3.3 Tính chất 21

1.2.3.4 Sự chuyển hóa beta – carotene thành vitamin A 23

1.2.4 Ứng dụng của carotenoid 25

1.2.4.1 Tạo màu cho thực phẩm 25

1.2.4.2 Dùng làm dược phẩm 26

1.3 TỔNG QUAN VỀ GÀ 27

1.3.1 Khái quát về gà 27

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sức sản xuất trứng của gia cầm 27

Con giống 28

1.3.2.1 1.3.2.2 Dinh dưỡng 28

1.3.2.3 Tuổi của gà đẻ 28

1.3.2.4 Điều kiện chăm sóc và nuôi dưỡng 28

1.3.3 Các chỉ tiêu về chất lượng trứng 30

1.3.3.1 Hình dạng trứng 30

1.3.3.2 Tình trạng vỏ trứng 31

1.3.3.3 Màu lòng đỏ 31

1.3.3.4 Độ nhớt của lòng trắng 31

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 33

2.1 VẬT LIỆU, GIỐNG VI SINH VẬT VÀ MÔI TRƯỜNG 33

2.1.1 Nguyên vật liệu 33

Gạo tấm 33

2.1.1.1 2.1.1.2 Bã đậu nành 33

2.1.1.3 Dầu ăn Cooking Oil 34

.1.2 Giống vi sinh vật và môi trường 34

2 2.1.2.1 Nguồn giống 34

2.1.2.2 Môi trường giữ giống nấm men 35

2.1.2.3 Môi trường hoạt hóa nấm men 36

2.1.2.4 Môi trường nuôi cấy bán rắn 36

2.1.2.5 Môi trường tổng hợp trong nuôi cấy nấm men 36

2.1.2.6 Giống gà 37

2.1.2.7 Thức ăn cho gà 37

2.1.2.8 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ 38

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39

2.2.1 Sơ đồ nuôi cấy bán rắn nấm men Rhodotorula sp.3 39

2.2.2 Thuyết minh quy trình 40

2.2.3 Tối ưu hóa hàm lượng khoáng đến khả năng sinh beta - carotene của nấm men Rhodotorula sp.3 41

2.2.3.1 Thí nghiệm sơ khởi: khảo sát chọn điểm ở tâm 41

2.2.3.2 Tối ưu hóa hàm lượng khoáng theo phương pháp quy hoạch thực

nghiệm bậc 2 Box - Hunter 42

2.2.4 Tối ưu điều kiện nuôi cấy bán rắn nấm men Rhodotorula sp.3 44

2.2.4.1 Xác định thí nghiệm tại tâm cho bài toán tối ưu điều kiện nuôi cấy 44

2.2.4.2 Ma trận thực nghiệm tối ưu điều kiện nuôi cấy 45

2.2.5 Xác định khả năng sinh tổng hợp beta - carotene theo thời gian của nấm men Rhodotorula sp.3 trên các điều kiện đã khảo sát 46

2.2.6 Các phương pháp phân tích chế phẩm nấm men 47

2.2.6.1 Phương pháp xác định ẩm theo TCVN 4326:1986 47

2.2.6.2 Phương pháp phân tích hàm lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl theo TCVN 4328:2001 48

2.2.6.3 Phương pháp phân tích hàm lượng lipid thô bằng phương pháp trích ly theo TCVN 4331:2001 51

2.2.6.4 Phương pháp xác định hàm lượng tro theo TCVN 4327:1986 52

2.2.6.5 Phương pháp xác định hàm lượng xơ tổng theo TCVN 4329 – 1993 54

2.2.6.6 Phương pháp xác định hàm lượng tinh bột bằng phương pháp kết tủa bằng cồn 55

2.2.6.7 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme phytase 56

2.2.6.8 Phương pháp xác định pH 58

2.2.6.9 Phương pháp xác định hàm lượng carotenoid 59

2.3 CÁC THỬ NGHIỆM TRÊN GÀ ISABROWN 59

2.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 59

2.3.2 Xác định công thức thức ăn cho gà chuyên trứng 60

2.3.3 Điều kiện thí nghiệm 60

2.3.3.1 Thức ăn 60

2.3.3.2 Chuồng trại 61

2.3.4 Các chỉ tiêu theo dõi 61

2.3.4.1 Sản lượng trứng 61

2.3.4.2 Các chỉ tiêu về chất lượng trứng 62

2.3.4.3 Sức sống 65

2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu 65

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 66

3.1 KẾT QUẢ TỐI ƯU THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG CHO QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢPP BETA-CAROTENE CỦA NẤM MEN RHODOTORULA SP.3 THEO QUI HOẠCH THỰC NGHIỆM BOX-HUNTER 66

3.1.1 Kết quả thí nghiệm khảo sát thành phần dinh dưỡng gồm KH2PO4, MgSO4, NaNO3, và saccharose để chọn thí nghiệm tại tâm 66

3.1.1.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 66

3.1.1.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4 67

3.1.1.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng NaNO3 67

3.1.1.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng saccharose 68

3.1.2 Kết quả tối ưu 4 yếu tố thành phần dinh dưỡng gồm KH2PO4, MgSO4, NaNO3 và saccharose 69

3.1.3 Kết luận và nhận xét 72

3.2 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY TỐI ƯU CHO QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP BETA-CAROTENE CỦA NẤM MEN RHODOTORULA SP.3 THEO QUI HOẠCH THỰC NGHIỆM BOX-HUNTER 73

3.2.1 Tìm thí nghiệm tại tâm 73

3.2.1.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm thích hợp 73

3.2.1.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của độ dày lớp môi trường thích hợp

74

3.2.1.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giống thích hợp 75

3.2.2 Kết quả tối ưu 3 yếu tố điều kiện nuôi cấy gồm giống cấy giống, độ ẩm và độ dày lớp môi trường 75

3.2.3 Kết luận và nhận xét 78

3.3 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BETA - CAROTENE THEO THỜI GIAN CỦA NẤM MEN RHODOTORULA SP.3 79

3.4 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN CHẤT LƯỢNG CHẾ PHẨM TỪ CANH TRƯỜNG NUÔI CẤY BÁN RẮN NẤM MEN RHODOTORULA SP.3 81

3.5 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM TRÊN GÀ 82

3.5.1 Đề xuất công thức phối trộn thức ăn cho gà chuyên trứng 82

3.5.2 Năng suất trứng 86

3.5.3 Khối lượng trứng 89

3.5.4 Chỉ số hình dạng 90

3.5.5 Chỉ số Haugh 92

3.5.6 Màu lòng đỏ 93

3.5.7 Tỷ lệ lòng đỏ 94

3.5.8 Tỷ lệ lòng trắng đặc 96

3.5.9 Tỷ lệ vỏ trứng 97

3.5.10 Độ dày vỏ 99

3.5.11 Sức sống của gà 101

3.5.12 Hàm lượng beta – carotene và vitamin A sau 16 tuần thí nghiệm 10

1 3.5.13 Nhận xét về phẩm chất trứng ở các lô thí nghiệm 103

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 104

4.1 KẾT LUẬN 104

4.2 ĐỀ NGHỊ 105

TÀI LIỆU THAM KHẢO 106 BÀI BÁO

PHỤ LỤC

1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Hình 1.1 Tế bào nấm men Rhodotorula glutinis [10]

Còn được gọi là nấm men sinh sắc tố carotenoid, là một trong rất ít các giống nấm men có khả năng tổng hợp, tích luỹ một lượng lớn các sắc tố carotenoid trong đó

chủ yếu là beta – carotene, torulene, torularhodin

Năm 1921, A Harden là người đầu tiên phân lập được loài Rhodotorula

mucilaginose Sau đó vào năm 1928, Harison và nhiều nhà khoa học khác đã phân lập

được 34 loài, trong đó phổ biến nhất là 3 loài Rhodotorula glutinus, Rh.mucilaginosa

và Rhodotorula gracilis Năm 2000, Krutzman và Fell cho rằng giống nấm men

Rhodotorula gồm 45 loài, theo mô tả của tác giả cho rằng loài Rh mucilaginosa trước

đó có tên gọi là Rh rubra, loài này tạo ra enzyme urease, không đồng hoá nitrate,

không phát triển trên cycloheximide hoặc nhiệt độ 40oC và loài Rh rubra thực ra chỉ là

một dạng riêng của loài Rh glutinis, tên gọi Rh ruba ở một số tài liệu hiện nay không còn nữa và được thay thế bằng tên mới là Rh Mucilaginosa [9], [13]

Riêng tác giả người Nhật, Hasegawa lại dựa vào quang phổ hấp thụ sắc tố

carotenoide để chia giống nấm men Rhodotorula thành hai giống phụ là: Rhodotorula (hấp thụ tối đa ở bước sóng 610 nm) và Flavotorrula (hấp thụ tối đa ở bước sóng 450

nm)

Theo Lodder (1971), Koneman E.W và Robert (1983), Rhodotorula thuộc cơ

thể đơn bào, nhóm nấm men không sinh bào tử, không có sợi khuẩn ty hay sợi khuẩn ty giả và là nhóm vi sinh vật ưa ấm, khoảng nhiệt độ hoạt động từ 20 – 40oC

1.1.2 Phân bố [10]

Nấm men Rhodotorula phân bố rộng rãi khắp nơi Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, nấm men Rhodotorula có thể được tìm thấy trong đất, không khí, các ao, hồ,

nước biển và trong các sản phẩm từ bơ sữa, trên người và các động vật hữu nhũ khác

Người ta thấy rằng Rhodotorula còn rất phổ biến trên trái cây xanh, rau quả Ngoài ra,

chúng còn hiện diện trong các sản phẩm hằng ngày như yaourt, kem, bơ, cá, nghêu sò, thịt tươi và thịt đã qua chế biến

1.1.3 Hình thái, kích thước tế bào

Rhodotorula có nhiều hình dạng khác nhau tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy Hình dạng của nó gồm: Hình trứng, hình dài, elip, hình tròn cầu và hình gậy

Rhodotorula có khuẩn lạc trơn, mềm, có màu từ kem đến vàng hoặc đỏ

Tế bào nấm men Rhodotorula ở dạng đơn bào, kích thước tế bào dao động trong

khoảng 2 – 5 µm chiều rộng; 2,5 – 10 µm chiều dài [4], [53]

Khuẩn lạc của Rhodotorula phát triển nhanh, bề mặt trơn nhẵn, bóng sáng hoặc

mờ đục, đôi khi ghồ ghề, mịn và nhớt Mép khuẩn lạc không có răng cưa Khuẩn lạc có màu từ kem, hồng đến đỏ san hô, cũng có khi có màu vàng và đỏ cam Kích thước khuẩn lạc tùy thuộc vào môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ nuôi cấy Quan sát dưới

kính hiển vi không thấy có sự hình thành sợi nấm, một số loài có sinh sợi nấm giả

nhưng rất kém phát triển, không hình thành bào tử túi [4], [18], [22], [54]

Hình 1.2 Khuẩn lạc Rh.mucilaginosa[9] Hình 1.3 Khuẩn lạc Rh.rubra [9]

1.1.4. Cấu tạo và sinh sản của nấm men Rhodotorula [9], [13]

1.1.4.1 Cấu tạo

Các nghiên cứu cho thấy, nấm men Rhodotorula có hình thái và cấu tạo tế bào

giống như các loài nấm men khác, được cấu tạo từ các thành phần sau:

a Thành tế bào

Được cấu tạo từ các thành phần khác nhau, trong đó đáng kể nhất là: glucan, manan, protein, lipid và một số thành phần nhỏ như kitin

– Glucan: là hợp chất cao phân tử của D-glucose Đó là một polysacharit

phân nhánh có liên kết beta-1,3 và beta-1,6 Cả hai thành phần này phân

bố đều trên thành tế bào

– Manan: là hợp chất cao phân tử của D-manose, mỗi phân tử thường chứa

200 - 400 thành phần manose Thường manan liên kết với protid theo tỷ

lệ 2:1 Manan thường có mối liên kết alpha - 1,6; alpha - 1,3; beta-1,3 Phân tử lượng của chúng khoảng 5x104

– Protein: thường protein liên kết với các thành phần khác như là manan

Trong thành phần của chúng chứa nhiều acid amin Phân bố ở màng tế bào, gần sát bào tương

– Kitin: nằm ở phần nẩy chồi Chúng chiếm số lượng rất nhỏ khoảng 3%

Là chất bền vững, không bị enzym phá hủy, vì thế chúng có tác dụng bảo

Vì thế mà khả năng trao đổi chất của nấm men gặp khó khăn Hai hiện tượng này được gọi là co và trương nguyên sinh chất

c Nguyên sinh chất

Tế bào còn non thì nguyên sinh chất càng đồng nhất, càng về già càng mất tính đồng nhất do xuất hiện nhiều không bào và hạt volutin Thành phần bao gồm: Nước, protid, lipid, glucid, muối khoáng và enzym Tế bào chất luôn luôn chuyển động, thường chuyển động một chiều xung quanh thành tế bào

d Nhân

Ở Rhodotorula đã có nhân thật, nhân hình bầu dục hay hình cầu Nó được bao

bọc bởi lớp màng bên trong là lớp dịch nhân Giống như các vi sinh vật khác, nhân nấm men có chứa protein và acid nucleic Ở trạng thái lên men nhân tăng 20 – 30 lần

so với ở trạng thái hô hấp

e Các thành phần khác

Không bào: Là nơi chứa đựng protease

Hạt không bào: Thường nằm trong không bào, là chất dinh dưỡng của tế bào, nguồn năng lượng cho tế bào, tham gia điều hòa các quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào

Ty thể: Cung cấp năng lượng hoạt động cho tế bào

Riboxom: Tham gia vào nhiều quá trình sinh tổng hợp của nấm men

Volutin: Không phải là thành phần cấu trúc tế bào, chúng xuất hiện ở những điều kiện đặc biệt như khi nuôi cấy trên môi trường giàu hydratcacbon và phosphat vô

cơ Số lượng volutin còn phụ thuộc vào tỷ lệ carbon : Nitơ và sự có mặt của lưu huỳnh cũng như của vitamin Volutin đóng vai trò quan trọng sau:

– Là chất dự trữ dinh dưỡng cho tế bào

– Tham gia điều hòa quá trình sinh trưởng, phát triển của tế bào

– Làm nguồn năng lượng cho tế bào

1.1.4.2 Sinh sản [9], [10], [13]

Đa số loài của nấm men Rhodotorula sinh sản bằng cách nẩy chồi như: Rh

pilimanae, Rh pilatii, Rh javaniti, Rh ingniosa, Rh diffluens và Rh bogoriensis và phân đôi, nhưng giống Rhodotorula không có hình thức sinh sản hữu tính

a Sinh sản bằng hình thức nẩy chồi

Đầu tiên, hạch nấm men bắt đầu dài ra và sau đó hạch bắt đầu thắt lại ở chính giữa Tế bào mẹ bắt đầu phát triển một chồi con Hạch, một phần chuyển vào chồi và một phần ở tế bào mẹ, nguyên sinh chất cũng chuyển sang chồi con Khi chồi con gần bằng chồi mẹ nó sẽ được tách ra và sống độc lập Đây là phương pháp sinh sản vô tính chủ yếu nhất ở nấm men

b Sinh sản bằng hình thức phân đôi

Lúc đầu tế bào dài ra, sau đó từ từ thắt lại ở chính giữa, nơi thắt này nhỏ dần, nhỏ dần tới khi đứt hẳn và tạo thành hai tế bào con độc lập Hai tế bào con này giống hệt nhau và đều mang một nửa vật chất di truyền của tế bào mẹ

Tốc độ sinh sản của Rhodotorula: Nhanh, thời gian để số tế bào tăng gấp đôi

thường từ 2 – 6 giờ.[22], [54]

Quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men gồm bốn giai đoạn: Giai đoạn thích nghi, giai đoạn phát triển, giai đoạn ổn định và giai đoạn diệt vong

Thời gian sinh trưởng tốt nhất của Rhodotorula trong khoảng 24 – 96 giờ tùy

loài, tùy thuộc vào thành phần môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy

1.1.5 Đặc điểm sinh hóa

Nấm men Rhodotorula có một số đặc tính sinh hoá sau:

– Không lên men các loại đường như: D-glucose, D-galactose, maltose,

α-D glucoide, saccharose, trehalose và nhiều loại đường khác, nhưng chúng lại sử dụng các loại đường này để cung cấp nguồn carbon cho việc xây

dựng tế bào Vài nấm men thuộc giống Rhodotorula có khả năng lên men

sinh ra CO2 (khí gây ra hiện tượng sủi bọt) và có hoạt tính polygalacturonase – enzyme có khả năng thủy phân pectin (Vaughn, 1969; Vaughn, 1972) [50], [53], [54]

– Tạo ra ezyme urease

– Đồng hoá DBB (Diazonium Blue B)

– Không tạo thành hợp chất loại tinh bột

– Không tạo ra acid acetic

– Không đồng hoá được inositol, đây là nét đặc trưng cơ bản nhất của

Rhodotorula khác với các giống nấm men Cryptococus, Candida [22],

[52]

– Có hoạt tính protease ngoại bào trên các nguồn cơ chất khác nhau

– Có chứa enzyme D-amino-acid oxidase (EC 1.4.3.3) [51], [58]

– Có chứa các enzyme khử bão hòa (desaturase), đặc biệt có khả năng chuyển hóa acid oleic (C 18:1) thành acid linolenic (C18:3) [59]

– Khả năng sinh tổng hợp sắc tố carotenoid

1.1.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy nấm men Rhodotorula

1.1.6.1 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng

a Ảnh hưởng của nguồn carbon

Nguồn carbon ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển, khả năng tổng hợp sắc tố và

thành phần sắc tố và các acid béo của nấm men Rhodotorula Khi nuôi Rhodotorula

bằng nguồn carbon là saccharose sẽ cho torularhodin và beta-carotene cao hơn khi nuôi

bằng nguồn glucose Ngược lại, nếu nuôi nấm men Rhodotorula bằng glycerol thì hàm lượng torulene tổng hợp được lại kém hơn khi nuôi bằng glucose Nếu Rhodotorula

được sử dụng nguồn carbon là nước ép cà rốt, không cần bổ sung khoáng chất thì hàm lượng beta-carotene thu được chiếm đến 97% carotenoid tổng Ngoài ra, theo Müncnero và D và Augustín J nhiều loài thuộc giống Rhodotorula có thể sử dụng

được benzoate như nguồn carbon [10], [53]

Nấm men Rhodotorula đặc biệt có khả năng sử dụng nguồn carbon là các

hydrocarbon mạch dài, các loại than bùn (Nikolaev và cộng sự, 1966; Vaskivnyuk và

Kvasnikov, 1968) [52] Rhodotorula dễ dàng đồng hóa nguồn carbon thô từ các phế

phụ phẩm của ngành công, nông nghiệp thực phẩm như: bột mì, bột bắp [31], dịch chiết bột đậu nành, dịch chiết bột ngô [32], nước sữa [36], nước chiết than bùn [107], mật đường glucose, rỉ đường, nước ép nho [32] Các hydrocarbon mạch dài có trong các loại dầu mỏ đã được dùng làm cơ chất cho quá trình tổng hợp sinh khối tế bào, carotenoid, protein, lipid và trong công nghệ sản xuất protein đơn bào SCP (Single Cell

Protein) từ nấm men Rhodotorula [4, 53]

b Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Nguồn nitơ có ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp carotenoid của Rhodotorula và

tùy thuộc vào khả năng sử dụng các nguồn nitơ của từng loài Song cũng có quan điểm cho rằng khả năng tổng hợp carotenoid của vi sinh vật không chịu ảnh hưởng của

nguồn nitơ mà phụ thuộc chủ yếu vào đặc tính di truyền của chủng giống dùng trong nghiên cứu [32], [53]

Theo nhiều tài liệu, hai nguồn nitơ có ảnh hưởng lớn đến khả năng tổng hợp

carotenoid tổng của Rhodotorula là NH4NO3 và (NH4)2SO4 .Trong khi đó, nguồn nitơ acid amin như: glycine, valine, asparagine và leucine không ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp carotenoid Nitơ sử dụng dưới dạng NH4+ có tác dụng kích thích quá trình tích lũy sinh khối cực đại Trong khi đó, nitơ ở dạng NO3- sẽ cho hiệu suất thu hồi sinh khối chỉ ở mức trung bình nhưng hàm lượng carotenoid tổng (theo khối lượng sinh khối khô) tăng lên rất lớn [13] Tỷ lệ C/N thích hợp từ 30÷40 [11]

c Ảnh hưởng của các muối

Theo Zalashko và cộng sự (1984) cho rằng trong môi trường, muối làm gia tăng hàm lượng acid béo, sterol và triglyceride Các tác giả Bhosale P., Grade R.V cũng kết

luận rằng chủng đột biến Rh glutinis mutant 32 cần phải được cung cấp thêm các

khoáng chất là K2HPO4 và MgSO4.7H2O vào môi trường nhân giống lẫn môi trường nuôi cấy khi tiến hành lên men nuôi cấy thu nhận sắc tố carotenoide

Một số loài nấm men thuộc giống Rhodotorula bị ức chế ở nồng độ muối trên

5%, hiện tượng này đã giải thích vì sao khả năng lên men của các nấm men càng thấp khi ở nồng độ muối càng cao Các tài liệu cho thấy nhiều loài nấm men thuộc giống

Rhodotorula khá thích hợp với môi trường nước biển, môi trường muối kim loại kiềm

Khi môi trường không có NaH2PO4 nấm men phát triển yếu và hàm lượng lipid thấp Ở nồng độ NaH2PO4 0,5g/l hiệu suất lên men cao nhất Mặt khác thay đổi hàm lượng các muối K2SO4, ZnSO4.7H2O và FeCl3 (cùng một thời điểm) trong môi trường nuôi cấy hầu hết các thí nghiệm cho thấy các muối này không ảnh hưởng đến hoạt lực lên men Ở các nồng độ muối MgSO4.7H2O bổ sung vào môi trường nuôi cấy cũng không có dấu hiệu cho thấy muối này ảnh hưởng nhiều đến hoạt lực men Điều này có thể giải thích là beet molasses (BM) đã có sẵn các loại muối này và đủ để cung cấp cho

hoạt động trao đổi chất bình thường của nấm men, do đó không cần bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy

1.1.6.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy [10]

a. Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nấm men Rhodotorula thường phát triển ở nhiệt độ khoảng từ 250 đến 300C

Theo các nghiên cứu cho thấy đa số các loài thuộc giống Rhodotorula phát triển tối ưu

ở nhiệt độ 27÷280C

Khi nuôi cấy ở nhiệt độ 400C, nấm men Rhodotorula kém hoặc hầu như không

phát triển Tổng hàm lượng carotenoid theo trọng lượng khô khi nuôi cấy ở nhiệt độ phòng 250C và 50C gần bằng nhau Khi nhiệt độ tăng lên đến 300C, hàm lượng carotenoid tổng thay đổi không đáng kể do hàm lượng γ-carotene gần như không đổi nhưng hàm lượng beta-carotene giảm đi gần bằng với lượng tăng lên của torulene và torularhodin Ở nhiệt độ 300C, nếu có chiếu sáng vào cuối giai đoạn tăng trưởng logarith sẽ làm tăng lượng beta-carotene đồng thời giảm lượng torulene và torularhodin [23], [32]

b Ảnh hưởng của pH

Theo các tài liệu ghi nhận được, pH thích hợp cho sự phát triển của nấm men

Rhodotorula khác nhau tùy từng loài, chủng Tuy nhiên, pH thích hợp thông thường ở

khoảng pH hơi acid từ pH 5 đến 6 [42] Giá trị pH thích hợp với từng loài Rhodotorula

cụ thể còn phụ thuộc rất nhiều vào thành phần môi trường và nhiệt độ nuôi cấy Ví dụ,

loài Rhodotorula glutinis có tốc độ phát triển cực đại ở môi trường có nguồn carbon là

benzoate tại pH kiềm yếu 7,5 [53] Ngược lại, trong môi trường có nguồn carbon là glucose có bổ sung dịch chiết nấm men và khoáng chất thì nấm men phát triển tốt nhất

ở pH acid từ 4,3 đến 4,7 [58]

c Ảnh hưởng của ánh sáng

Khả năng hình thành carotenoid ở Rhodotorula nói riêng và nấm men nói chung

phụ thuộc nhiều vào cường độ chiếu sáng Việc điều khiển quá trình tổng hợp sắc tố

carotenoid bằng ánh sáng qua hai giai đoạn Giai đoạn đầu xảy ra phản ứng quang hóa, giai đoạn này không phụ thuộc vào nhiệt độ nhưng cần ánh sáng Giai đoạn hai xảy ra các phản ứng hóa sinh không phụ thuộc vào ánh sáng Một số loài mất khả năng tổng hợp carotenoid trong tối Tỷ lệ alpha-carotene và beta-carotene so với torulene trong

ánh sáng cao hơn so với trong bóng tối Khi nuôi nấm men Rhodotorula ở nhiệt độ

khoảng 300C, hàm lượng beta-carotene giảm đáng kể nhưng nếu trong quá trình nuôi nấm men được chiếu sáng vào cuối giai đoạn phát triển logarith kết quả lượng beta-carotene sẽ tăng 58% so với khi không chiếu sáng Ở nhiệt độ thấp (khoảng 200C), hàm lựơng beta-carotene thu được khi nấm men được chiếu sáng tăng không đáng kể so với khi không được chiếu sáng [22], [53]

d Ảnh hưởng của oxygen

Quá trình tổng hợp carotenoid rất cần đến các sự tạo thành của các hợp chất có tính oxy hóa cao Do đó, không khí đóng vai trò rất quan trọng, có liên quan đến sự hình thành sắc tố cho nấm men và các vi sinh vật khác Mặt khác, không khí còn có vai trò trong việc phân chia thành từng vùng của sắc tố trong quá trình sinh tổng hợp carotenoid của tế bào [10]

Hầu hết các nấm men sinh sắc tố carotenoid thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí bắt buộc, do đó cần phải cung cấp oxygen cho chúng sinh sản và phát triển [22] Theo các tài liệu thu được, khi tiến hành nuôi cấy theo phương pháp nuôi cấy dịch thể các tác giả đều phải lắc, khuấy trộn hay sục khí với các lưu lượng khác nhau tuỳ thuộc vào môi trường nuôi cấy [13]

1.1.7. Giá trị dinh dưỡng của sinh khối nấm men Rhodotorula

Sinh khối nấm men Rhodotorula giàu protein, chất béo, vitamin đặc biệt là các

carotenoid dạng carotene Theo nhiều tác giả, giá trị dinh dưỡng của sinh khối nấm men nói chung cao do giàu hàm lượng protein và enzyme (Dambergar, 1964), hàm lượng protein (theo nitrogen) đạt từ 13,9 – 25,12g / 100g sinh khối khô (theo Krauze, 1966), có chứa các khoáng chất và vitamin nhóm B (Bekarputnunia, 1964 và Valdman,

1957) Sinh khối nấm men Rhodotorula được ghi nhận là có hàm lượng acid béo không

no có giá trị cao, đặc biệt là acid folic và acid linoleic chiếm chủ yếu (Cochrane, 1958)

và được xếp vào loại vi sinh vật siêu tổng hợp chất béo, cụ thể là men Rh gracilis có

khả năng tích luỹ tới 65% chất béo / trọng lượng khô tế bào (Ratledge, 1982) [13]

Theo Khaled M.Ghanem nấm men Rh glutinis là sinh vật tổng hợp chất béo cao nhất,

do đó ngoài tên gọi carotenogensis do khả năng sinh tổng hợp carotenoid, giống

Rhodotorula còn được gọi là nấm men dầu (oleaginous yeast) [10] Nấm men

Rhodotorula có khả năng tổng hợp chất béo rất cao trên cơ chất là các hydrocarbon mạch dài, Pelechova và cộng sự (1971) khi nghiên cứu khả năng tổng hợp chất béo của

tế bào nấm men đã xác định được hàm lượng các acid béo có trong sinh khối tế bào

nấm men Rh glutinis và Rh gracilis khi phát triển trên chất nền là hydrocarbon mạch

dài thu được lượng acid béo lần lượt là 35% và 32% [13]

Việc dùng sinh khối nấm men Rhodotorula làm thức ăn cho gia súc là an toàn

và không độc tính [17] Gần đây đã được nhiều nhà khoa học công bố như: Eugenia và

cộng sự (1997) dùng sinh khối men Rhodotorula làm thức ăn bổ sung cho gà mái đẻ;

Naidu và cộng sự làm thức ăn cho vật nuôi; Somashekar và Joseph (2000) cho biết việc

khai thác sắc tố carotenoid có trong tế bào nấm men Rhodotorula để bổ sung vào thực

phẩm cho người và vật nuôi là hướng nghiên cứu đầy tiềm năng [24], Bhosale P và cộng sự (2003) đã tách chiết beta-carotene, xác định độ bền của sắc tố và dùng cho dinh dưỡng của vật nuôi [23]

1.2 GIỚI THIỆU VỀ CAROTENOID [9], [10], [13], [27], [28], [63]

1.2.1 Tổng quan về Carotenoid

1.2.1.1 Định nghĩa [63]

Nhóm carotenoid là các sắc tố hữu cơ tự nhiên được tìm thấy trong thực vật và một số cơ thể sinh vật quang hợp, tảo, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn Chúng là những chất màu không độc, tạo màu vàng, cam và đỏ cho nhiều loại thực phẩm

1.2.1.2 Lịch sử của carotenoid [37]

Vào năm 1831, Wackenroder đã thu nhận được carotene từ cà rốt Năm 1837 Berzelius đã gọi các sắc tố có màu vàng trong lá cây là xanthophylls Và thập niên

1950, carotenoid đã được sinh tổng hợp để sử dụng như là một chất màu thực phẩm

Ngày nay số lượng các carotenoid tìm thấy trong tự nhiên lên đến 700 hợp chất với các màu sắc khác nhau [42] Các carotenoid chủ yếu được tách từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên như thực vật và vi sinh vật

1.2.1.3 Danh pháp và cấu tạo [9], [27]

Có hai cách gọi tên carotenoid:

+ Tên truyền thống : Tên theo nguồn gốc mà loại carotenoid đó được trích chiết đầu tiên

+ Tên hệ thống: Tên theo công thức hoá học Carotenoid được gọi tên theo dẫn xuất carotene với hai nhóm cuối được ký hiệu bằng các ký tự Hy Lạp (theo trình tự alphabe) Các tiếp đầu ngữ, tiếp vị ngữ được sử dụng để chỉ mức độ hydro hoá và sự hiện diện của các nhóm chức thay thế

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của các carotenoid quan trọng [9], [27]

Một số carotenoid quan trọng và tiêu biểu như: lycopene, beta - carotene (III), alpha - carotene (IV), beta - cryptoxanthin (V), zeaxanthin (VI), lutein (VII), neoxanthin (VIII), violaxanthin (IX), fucoxanthin (X)

Tất cả các carotenoid có thể được xem như là dẫn xuất của acrylic C40H56 có trung tâm là chuỗi gồm nhiều nối đôi liên hợp, do kết hợp với hydro (hydrogenation), khử hydro (dehydrogenation), hình thành vòng (cyclization), thực hiện quá trình oxi hóa (oxidation) tạo nên

Carotenoid được tổng hợp đầu tiên là các tiền chất C5-terpenoid; isopentyl diphosphat (IPP), hợp chất này sau đó chuyển thành geranyl diphosphat (C20) Hai phân tử này kết hợp với nhau tạo thành phytoene, sau đó tiếp tục khử hydro tạo thành phytofluene, zeta-carotene và neurosporence để cho ra lycopene Tiếp theo đó là sự tạo vòng, sự khử hydro và sự oxi hóa, để tạo ra các carotenoid riêng biệt thường gặp trong

tự nhiên Tuy nhiên có một số ít các hợp chất được biết có sự chuyển hóa cấu trúc cuối cùng dẫn đến hình thành hàng trăm các carotenoid khác nhau

Cấu trúc của carotenoid có thể có vòng hoặc không vòng Vòng 6 cạnh hoặc 5 cạnh ở 1 đầu hay 2 đầu của phân tử

Do hệ thống nối đôi liên hợp trong phân tử, mỗi loại carotenoid đều có thể tồn tại ở những dạng đồng phân lập thể khác nhau Hầu hết các carotenoid tự nhiên đều ở dạng trans Tuy vậy dạng đồng phân cis cũng thường có với một số lượng nhỏ là kết của sự chuyển từ đồng phân dạng trans sang dạng cis [10]

Hợp chất carotenoid (C40) bi mất đi một nhóm đầu thì gọi là apo-carotenoid Một vài loại apo-carotenoid là những chất màu thực phẩm quan trọng [10]

1.2.1.4 Phân loại [9]

Carotenoids được chia làm 2 nhóm sắc tố chính:

– Carotenes: Gồm các hợp chất hydrocacbon carotenoid

– Xanthophylls: Gồm các dẫn xuất carotene với nhóm chức có chứa oxy (hydroxy, keto, epoxy, methoxy, các nhóm acid carboxylic)

Theo Bong và cộng sự (2004) các carotenoid chính được nghiên cứu từ giống

nấm men Rhodotorula hiện diện đủ cả hai nhóm, trong đó torulene, beta - carotene

thuộc nhóm carotenes ; torularhodin (II) thuộc xanthophylls [26]

Hình 1.5 Phân loại carotenoid [10]

1.2.1.5 Tính chất [10]

Carotenoid thường kết tinh ở dạng tinh thể Tinh thể carotenoid có nhiều dạng khác nhau và kích thước của chúng cũng rất khác nhau như: Dạng hình kim dài ( lycopen, δ-carotene), hình khối lăng trụ đa diện (alpha - carotene), dạng hình thoi (beta

- carotene), kết tinh vô định hình (γ-carotene)

Nhiệt độ nóng chảy cao, khoảng (130 – 220)0C

Độ hòa tan của carotenoid thay đổi tùy loại dung môi Tinh thể carotenoid không tan trong nước, tan tốt trong các dung môi như: Chloroform, dichloromethane Hầu như tất cả carotenoid đều tan trong chất béo và các dung môi không phân cực

Các carotenoid tự do tạo màu kem, vàng, cam, hồng, đỏ tùy theo loại hợp chất, nguồn nguyên liệu, điều kiện nuôi trồng, thời tiết, … dạng caroteneoprotein tạo dãy màu từ xanh lá, tím, xanh dương và đen Khi đun sôi sẽ chuyển sang màu đỏ cam do protein bị biến tính, phức hợp với carotenoid bị phá huỷ, màu carotenoid trở lại bình thường [42]

Do hệ thống nối đôi liên hợp nên carotenoid dễ bị oxy hóa mất màu, hoặc đồng phân hoá, hydro hóa tạo màu khác Các tác nhân ảnh hưởng đến độ bền màu là nhiệt

độ, phản ứng oxy hóa trực tiếp hoặc gián tiếp, ion kim loại, ánh sáng, tác dụng của enzyme (peroxidase, lipxidase, lipperoxidase)…

Carotenoid tinh khiết rất bền khi ở dạng huyền phù hoặc dung dịch với dầu thực vật, đặc biệt là khi có chất chống oxi hoá là α - tocopherol [9]

1.2.2 Cơ chế sinh tổng hợp sắc tố carotenoid ở vi sinh vật [9],[49]

1.2.2.1 Cơ chế sinh tổng hợp sắc tố carotenoid ở vi sinh vật

Toàn bộ quá trình sinh tổng hợp sắc tố carotenoid của nấm men có thể chia thành 3 giai đoạn: giai đoạn cảm ứng ánh sáng (tối thiểu 12 giờ), giai đoạn tổng hợp enzyme – giai đoạn này xảy ra trong tối và giai đoạn tổng hợp carotenoid phụ thuộc vào ánh sáng Điều này phù hợp với nghiên cứu của Kocková-Kratochvílova và cộng

sự là màu của nấm men sinh sắc tố tăng lên rất nhiều so với màu của các giống nấm men trắng khi sống ở vùng có tia cực tím mạnh Tuy nhiên, ở cường độ bức xạ quá cao,

các sắc tố carotenoid không có khả năng che chở cho cơ thể sinh vật [49]

Giai đoạn đầu tiên hình thành các tiền terpenoid gồm 5 carbon ban đầu Giai đoạn hai là giai đoạn hình thành các hợp chất C40 Giai đoạn cuối cùng là thay đổi chuỗi C40 trong hệ thống các carotenoid Có nhiều hệ enzyme khác nhau được sử dụng vào giai đoạn cuối của quá trình tổng hợp các sterol và carotenoid, chúng có chung con

đường là thông qua farnesyl pyrophosphate Giống Rhodotorula thông qua tổng hợp

acid mevalonic phù hợp với sự hình thành carotene của nấm men và tương tự với con đường tổng hợp carotene của các vi sinh vật sinh sắc tố carotenoid khác (Scharf và Simpson, 1968)

Carotenoid là một loại hợp chất isoprenoid được sinh tổng hợp từ acetyl coenzyme-A qua acid mevalonic Giai đoạn tạo các carotenoid bắt đầu với sự tạo thành hợp chất C40 đầu tiên, phyotene, từ hai phân tử geranylgeranyl diphosphate (GGDP)

Hình 1.6 Con đường sinh tổng hợp carotenoid

Phyotene tạo thành ở dạng đồng phân 15C, có 3 nối đôi liên hợp, không có màu,

sẽ chuyển hóa tiếp tục bằng những phản ứng dehydro hóa, tạo sản phẩm cuối cùng là lycopene Sơ đồ chuyển hóa theo hình 1.7

Hình 1.7 Các phản ứng dehydro hóa trong quá trình sinh tổng hợp caroteniod

Sau cùng, lycopene tiếp tục đóng vòng ở một hoặc hai đầu tạo ra các sản phẩm carotene như γ-carotene, δ-carotene (đơn vòng), beta - carotene, alpha - carotene, ε-carotene (hai vòng) Sơ đồ theo hình 1.8

Hình 1.8 Tổng hợp carotenoid có vòng từ lycopene

Các hợp chất carotene chứa nhóm chức chứa oxy như hydroxyl, epoxy, methoxy, thường tổng hợp vào giai đoạn cuối cùng Ngoài ra, cũng có thể xảy ra phản ứng cắt một phần đầu phân tử carotene để tạo thành apocarotenoid

1.2.2.2 Một số nghiên cứu về sinh tổng hợp carotenoid của nấm men

Rhodotorula [12], [22], [30], [35]

Nấm men Rhodotorula là một trong rất ít các giống nấm men có khả năng tổng

hợp tích lũy một lượng lớn các sắc tố carotenoid trong đó chủ yếu là beta – carotene,

torulene, torularhodin Tại các nước có nền sinh học phát triển nấm men Rhodotorula

được nghiên cứu nhiều và được sử dụng như một thực phẩm an toàn có giá trị dinh dưỡng cao trong chăn nuôi Ở nước ta việc tìm kiếm, thu nhận để sử dụng giống nấm

men Rhodoturula đã được bắt đầu gần mười năm nay Một số nghiên cứu của các tác giả trong và ngoài nước về sinh tổng hợp carotenoid từ nấm men Rhodotorula được

trình bày trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Một số nghiên cứu về sinh tổng hợp carotenoid từ nấm men Rhodotorula

nuôi cấy Hàm lượng carotenoid

Abello Velasoco

A

13000mg/gsk C.T.Shihvà

Alesssandro

Martini

2000 Rhodotorula glutinis Nước nho đặc

chưa lên men

0.9154mg/gskk (beta-carotene)

0,6039mg/lít

và chiết men

9,323mg/lit carotene) trong 10,62g sinh khối tươi

(beta-1.2.3 Hợp chất beta – carotene – tiền vitamin A

1.2.3.1 Tầm quan trọng của beta – carotene đối với sức khỏe của

người và động vật [62]

Beta – carotene còn được biết đến dưới tên gọi là tiền vitamin A Phân tử vitamin A khi oxy hóa gốc aldehyt của nó sẽ hình thành nên một chất mới có tên là opsin, là chất tham gia vào cấu tạo võng mạc của mắt Do đó, beta – carotene có ảnh hưởng tốt đến thị lực của con người

Ngoài ra, beta – carotene còn có tham gia quá trình sinh tổng hợp glycoprotein, chất mà nếu thiếu hụt trong cơ thể sẽ dẫn đến sự phát triển không bình thường của xương

Beta – carotene còn được tìm thấy trong huyết tương người Các nghiên cứu về sức khỏe y học đã cho thấy những người có lượng beta – carotene đưa vào cơ thể cao

và có một lượng lớn beta – carotene trong huyết tương thì có khả năng giảm thiểu các mối nguy hiểm của bệnh ung thư phổi

Beta – carotene còn có khả năng ngăn ngừa bệnh tim, dựa trên khả năng của beta-carotene là có thể kìm chế các chất LDL cholesterol gây hại

Có khả năng ngăn ngừa ung thư là một trong những đặc tính quan trọng nhất của beta – carotene Khả năng ngăn ngừa bệnh ung thư của beta – carotene còn phải dựa trên sự kết hợp của beta – carotene với các carotenoid khác như lycopene và các chất chống oxy hóa như vitamin C, vitamin E

Hình 1.9 Công thức cấu tạo beta – carotene

Hình 1.10 Cấu trúc không gian của beta-carotene [10]

1.2.3.3 Tính chất [9], [57]

Beta – carotene là đồng phân quan trọng của hydrocacbon carotene Công thức phân tử C40H56 M = 536,85

Nhiệt độ nóng chảy 176 - 1830C, kèm theo sự phân huỷ

Độ hoà tan: Beta – carotene có độ hòa tan rất khác nhau như

– Tan tốt trong chloroform, benzen, CS2

– Tan trung bình trong ether, petroleum ether, dầu thực vật

– Tan hạn chế trong methanol, ethanol

– Không tan trong nước, acid, hợp chất alkane

Tinh thể beta – carotene có dạng hình lăng trụ 6 mặt màu tím đậm nếu kết tinh

từ dung môi benzen-methanol và có dạng lá hình thoi gần như vuông có màu đỏ nếu kết tinh từ dung môi petroleum ether

Dung dịch beta – carotene loãng có màu vàng Trong dung dịch, beta – carotene dần bị thay đổi (nhanh hơn ở 80 0C) đến hỗn hợp cân bằng gồm beta – carotene 70 %,

H3 CH3

CH3

Beta – carotene tự nhiên gồm hai dạng đồng phân Một đồng phân quan trọng là

9 – cis beta – carotene, đồng phân kia là all – trans beta – carotene Các đồng phân này đều có công thức phân tử giống nhau nhưng cách sắp xếp của chúng trong không gian

ba chiều lại khác nhau Các đồng phân như vậy thường có những đặc tính sinh hóa học rất khác biệt 9 – cis beta – carotene là thành phần chống oxi hóa chủ yếu của beta – carotene Trong khi đó, loại beta – carotene tổng hợp chỉ chứa loại đồng phân all – trans beta – carotene có khả năng chống oxi hóa rất thấp

Tuy nhiên, 9 – cis beta – carotene ít được nghe nói đến vì cách phân tích thường dùng nhất cho sự hấp thu một dưỡng chất là đo lường nồng độ của nó trong máu, nhưng đối với 9 – cis beta – carotene các chuyên gia gặp phải nhiều khó khăn Một số