Nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm đông trùng hạ thảo tuyết (isaria tenuipes) phân bố ở việt nam

3.1 Đặc điểm và kết quả phân lập các chủng nấm ở Ba Vì 16 3.2 Kết quả xác định môi trường dinh dưỡng nhân sinh khối hệ 3.3 Xác định nhiệt độ không khí tối ưu cho sinh trưởng của 3.10 K

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành chương trình đào tạo cao học tại trường Đại học Lâm nghiệp, nhằm vận dụng kiến thức đã học vào thực tiễn, làm quen với công tác nghiên cứu khoa học và khả năng tổng hợp phân tích vấn đề, tác giả tiến hành thực hiện Luận văn tốt nghiệp cao học

Trong quá trình thực hiện và hoàn thiện luận văn, tác giả đã nhận được nhiều sự quan tâm, giúp đỡ và đóng góp của cán bộ Phòng nghiên cứu Bảo vệ Thực vật rừng – Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, Khoa đào tạo sau Đại học - Trường Đại học Lâm nghiệp, từ gia đình và bạn bè đồng nghiệp Tác giả xin chân thành cảm ơn sự ủng hộ, giúp đỡ đó Đặc biệt tác giả muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Phạm Quang Thu, người thầy trực tiếp hướng dẫn khoa học đã tận tình quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi và truyền đạt những kiến thức quý báu trong suốt quá trình thực hiện

Luận văn được hoàn thiện trên cơ sở tham khảo nhiều tài liệu có liên quan và ý kiến đóng góp của nhiều nhà chuyên môn và sự nỗ lực của tác giả Tuy nhiên do khả năng, điều kiện và thời gian còn hạn chế, chủ đề nghiên cứu hoàn toàn mới nên luận văn không tránh khỏi những thiếu sót Tác giả rất mong nhận được ý kiến đóng góp, xây dựng của các nhà khoa học cũng như của bạn bè đồng nghiệp để Luận văn được hoàn thiện

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 3 năm 2013

Tác giả

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa

Lời cảm ơn i

Mục lục ii

Danh mục các bảng iv

Danh mục các hình v

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2

1.1 Nghiên cứu ở ngoài nước 2

1.1.1 Nghiên cứu về phân loại nhóm nấm Đông trùng hạ thảo và nấm Đông trùng hạ thảo tuyết (Isaria tenuipes) 2

1.1.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học của I tenuipes 2

1.1.3 Nghiên cứu về giá trị dược liệu của nấm Đông trùng hạ thảo 4

1.1.4 Nghiên cứu về nuôi trồng thể quả trên giá thể và nuôi cấy sinh khối hệ sợi 6

1.2 Nghiên cứu ở trong nước 7

1.2.1 Nghiên cứu về thành phần loài các loài nấm ký sinh côn trùng và nấm đông trùng hạ thảo 7

1.2.2 Nghiên cứu về giá trị dược liệu 8

1.2.3 Nghiên cứu về nuôi trồng thể quả trên giá thể và nuôi cấy sinh khối hệ sợi 9

Chương 2 MỤC TIÊU - ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.1 Mục tiêu nghiên cứu 11

2.2 Đối tượng nghiên cứu 11

2.3 Nội dung nghiên cứu 11

2.3.1 Phân lập các chủng nấm Isaria tenuipes ở Việt Nam 11

2.3.2 Đặc điểm sinh học của hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết 11

2.3.3 Nghiên cứu hoạt tính của các chủng nấm 11

2.3.4 Nghiên cứu khả năng hình thành thể quả trên giá thể nhân tạo 11

2.4 Phương pháp nghiên cứu 12

2.4.1 Phương pháp phân lập 12

2.4.2 Đặc điểm sinh học của hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết 12

2.4.3 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm bê ̣nh của chủng nấm Isaria tenuipes 14

2.4.4 Phương pháp nghiên cứu khả năng hình thành thể quả trên giá thể nhân tạo 15

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 16

3.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu và đặc điểm sinh trưởng của chủng nấm Isaria tenuipes 16

3.1.1 Kế t qua ̉ điều tra, phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng các chu ̉ng nấm Isaria tenuipes tại vườn Quốc gia Ba Vì 16

3.1.2 Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu nấm Isaria tenuipes 19

3.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hệ sợi nấm trong điều kiện nuôi cấy thuần khiết 20

3.2.1 Nghiên cứu xác định môi trường dinh dưỡng tối ưu cho nhân sinh khối hệ sợi 20

3.2.2 Nghiên cứu xác định nhiêt độ không khí tối ưu cho quá trình nhân sinh khối hệ sợi 25

3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh trưởng của hệ sợi 29

3.3 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm bê ̣nh của chủng nấm Isaria tenuipes 33

3.3.1 Bước đầu đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của nấm Isaria tenuipes 33

3.3.2 Bước đầu đánh giá hoạt tính kháng nấm của nấm Isaria tenuipes 36

3.4 Nghiên cứu đánh giá khả năng hình thành thể quả trên giá thể nhân ta ̣o 40

3.4.1 Nghiên cứu đánh giá khả năng hình thành thể quả trên gia ́ thể lỏng 40 3.4.2 Nghiên cứu nuôi trồng thể quả nấm Isaria tenuipes trên nhộng tằm 50

KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO

3.1 Đặc điểm và kết quả phân lập các chủng nấm ở Ba Vì 16

3.2 Kết quả xác định môi trường dinh dưỡng nhân sinh khối hệ

3.3 Xác định nhiệt độ không khí tối ưu cho sinh trưởng của

3.10 Kết quả nghiên cứu khả năng hình thành thể quả của nấm

Isaria tenuipes trên giá thể nhộng tằm 51

3.11 Sự khác nhau về đô ̣ dầy hê ̣ sợi nấm 22

3.12 Trọng lươ ̣ng tươi hê ̣ sơ ̣i ở các môi trường dinh dưỡng khác

3.17 Hệ sơ ̣i nấm nuôi cấy trên môi trường CT5 ở các pH khác

3.22 Khả năng kháng khuẩn Bacillus subtilis của nấm Isaria

3.25 Khả năng kháng nấm của nấm Isaria tenuipes và đối chứng 39

3.28 Trọng lươ ̣ng tươi thể quả ở các môi trường dinh dưỡng

3.29 Trọng lươ ̣ng khô thể quả ở các môi trường dinh dưỡng khác

3.30 Thể quả nấm ở các thang nhiệt độ khác nhau 44

3.31 Trọng lươ ̣ng tươi thể quả ở các nhiệt độ không khí khác

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nấm đông trùng hạ thảo tuyết (Isaria tenuipes (Peck.) Samson), tên trước đây là (Paecilomyces tenuipes Peck.) là một loài nấm dược liệu được

nuôi trồng và sử dụng lâu đời ở Hàn Quốc Trong tự nhiên, loại nấm này tồn

tại ở hai giai đoạn: giai đoạn hữu tính có tên là Cordyceps takaomontana Yakushiji, còn giai đoạn vô tính có tên là Isaria tenuipes Peck Đây là một

loài nấm có giá trị dược liệu quý, tác dụng chủ yếu trong điều trị và hỗ trợ điều trị bệnh ung thư nhờ tác dụng về dược lý và sinh học của chúng Một hợp chất hóa học có hoạt tính sinh học có giá trị dược liệu chứa trong thể quả

ở giai đoạn hữu tính và ở giai đoạn vô tính của loài nấm này là 12,13-epoxyl-9-trichothecene-3,15-diol (Oh, G.S et.al 2001) Đây là hợp chất đang được dùng để điều trị bệnh ung thư, đặc biệt là bệnh máu trắng ở các nước trên thế giới, đặc biệt được sử dụng rộng rãi ở Hàn Quốc (Eiji

4-acetyl-Yokoyama et al., 2003) Đây là một loài nấm dược liệu quý và lần đầu tiên

được mô tả và được ghi nhận có phân bố ở Việt Nam Qua các đợt điều tra, Trung tâm nghiên cứu bảo vệ rừng - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã thu được một số mẫu Đông trùng hạ thảo tại rất nhiều nơi như: Vườn Quốc gia Ba Vì, Vườn quốc gia Tam Đảo, Khu bảo tồn thiên nhiên Tây Yên Tử,

và nguồn gen các loài này đang đươ ̣c lưu giữ bảo quản ta ̣i phòng

Việc nhân nuôi và gây trồng nhân tạo thành công loài nấm này có ý nghĩa vô cùng to lớn trong việc bảo tồn và phát triển loài này ở Việt Nam Để nhân nuôi nhân ta ̣o thành công loài nấm này thì không thể không biết được đặc điểm sinh học của chúng Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các loài nấm

Isaria tenuipes là cơ sở khoa học quan trọng được xem như yếu tố quyết định

đến sự thành bại của việc nuôi trồng thể quả nấm nhân tạo

Với những lý do trên, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm Đông trùng hạ thảo tuyết (Isaria tenuipes) có phân

bố ở Việt Nam” nhằm góp phần bảo tồn, nghiên cứu ứng dụng và phát triển

bền vững các loài Đông trùng hạ thảo quý hiếm Thành công của đề tài sẽ có ý nghĩa rất lớn trong nghiên cứu khoa học và y học nước nhà, đặc biệt là cơ sở để tiếp tục nghiên cứu quy trình nuôi trồng nhân tạo loại nấm thần dược này

Chương 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Nghiên cứu ở ngoài nước

1.1.1 Nghiên cứu về phân loại nhóm nấm Đông trùng hạ thảo và nấm Đông trùng hạ thảo tuyết (Isaria tenuipes)

Dựa trên đặc điểm hình thái cũng như đặc điểm về cấu trúc phân tử, các loài nấm đông trùng hạ thảo được xếp trong 162 đơn vị phân loại thuộc 2 họ

Cordycipitaceae và Ophiocordycipitaceae [14]

Isaria tenuipes là một loài nấm phổ biến được tìm thấy tại nhiều khu

vực miền núi Hàn Quốc [21] Hình dạng nấm có thể mọc riêng lẻ hay thành cụm nhóm Có thể mọc thẳng hoặc đột xuất nhánh, và có thể dài lên 45 mm, thân cây nấm chủ yếu là màu vàng chanh và bên trên có bột màu trắng [13]

Theo hệ thống phân loại truyền thống loài nấm Isaria tenuipes được

xếp vào họ Clavicipitaceae [11] Đây là một loài nấm dược liệu được nuôi

trồng và sử dụng lâu đời ở Hàn Quốc Trong tự nhiên, trên cùng một ký chủ, rất dễ dàng thấy 2 dạng thể quả: dạng thể quả chứa bào tử hữu tính (stromata)

có tên go ̣i là Cordyceps takaomontana Yakushiji & Kumazawa và dạng thể quả chứa bào tử vô tính (synnemata) chính là Isaria tenuipes

1.1.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học của I tenuipes

Nấm I tenuipes xâm nhiễm nhộng hay sâu non và sau đó hình thành

các dạng thể quả màu vàng mọc thẳng hay phân nhánh ra bên ngoài mình của

vật chủ Theo y học truyền thống của Trung Hoa, dạng thể quả của nấm I tenuipes có giá trị cao về mặt dược liệu do các tác dụng về dược lý và sinh

học của chúng Các hoạt chất Ergosterol peroxide và Acetoxyscirpenediol

tách chiết từ nấm I tenuipes nuôi cấy nhân tạo có khả năng ức chế các dòng

tế bào ung thư ở người như tế bào khối u dạ dày, tế bào ung thư gan, tế bào ung thư ruột kết - ruột thẳng Hoạt tính của Acetoxyscirpenediol mạnh hơn Cisplatin là hoạt chất đang được dùng điều trị cho các bệnh nhân ung thư hiện

nay là 4 đến 6,6 lần [16] Một hợp chất hóa học có hoạt tính sinh học có giá trị dược liệu chứa trong thể quả ở giai đoạn hữu tính và ở giai đoạn vô tính

của loài nấm Isaria tenuipes này là

4-acetyl-12,13-epoxyl-9-trichothecene-3,15-diol [17] Đây là hợp chất đang được dùng để điều trị bệnh ung thư, đặc biệt là bệnh máu trắng ở các nước trên thế giới, đặc biệt được sử dụng rộng rãi ở Hàn Quốc [10]

Trong dạng thể quả của nấm Isaria tenuipes còn chứa các hợp chất sinh

học và giá trị dược phẩm cao, chẳng hạn như adenosine và hydroxyethyl) adenosine [13] Có tác dụng tăng cường hệ thống miễn dịch và lấy lại năng lượng, tương tự các chức năng bổ của nhân sâm

N6-(2-Một số thành phần sinh hoá, nguyên tố khoáng, acid amin và các

vitamin trong nấm đông trùng hạ thảo I tenuipes đã được xác định như sau

[30]:

Bảng 1.1: Thành phần sinh hoá và nguyên tố khoáng trong nấm I tenuipes

STT Chỉ tiêu Đơn vị tính Hàm lượng

Bảng 1.2: Thành phần acid amin trong nấm đông trùng hạ thảo I tenuipes

TT Acid amin ĐV Hàm

lượng TT Acid amin ĐV

Hàm lượng

Bảng 1.3: Thành phần vitamin trong nấm Đông trùng hạ thảo I tenuipes

1.1.3 Nghiên cứu về giá trị dược liệu của nấm Đông trùng hạ thảo

Nấm Đông trùng hạ thảo là một loại nấm là loại dược liệu quý, rất tốt cho sức khoẻ, phù hợp với mọi lứa tuổi Đông trùng hạ thảo là một vị thuốc bồi bổ hết sức quý giá, có tác dụng tích cực với rất nhiều bệnh như rối loạn

tình dục, thận hư, liệt dương, di tinh, hay có tác dụng làm tăng cường công năng của tuyến thượng thận, cải thiện được chức năng thận, nâng cao năng

lực miễn dịch, kháng khuẩn, kháng virus, chống ung thư và chất phóng xạ

Isaria tenuipes là một loài nấm có giá trị dược liệu quý, tác dụng chủ

yếu trong điều trị và hỗ trợ điều trị bệnh ung thư nhờ tác dụng về dược lý và sinh học của chúng Những hợp chất có hoạt tính chống khối u hoặc tác động đến hệ thống miễn dịch như: Leucinostatins A, D, Polygalactosamine, Saintopin, Sphingofungins E và F, UCE1022, Paeciloquinones A, B, C, D, E

và F, Ergosterol peroxide, Acetoxyscirpenediol, … Đă ̣c biê ̣t, hoạt chất Ergosterol peroxide và Acetoxyscirpenediol trong nuôi cấy nhân tạo có khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư ở người như khối u dạ dày, ung thư gan, ung thư ruột kết - ruột thẳng được tách chiết và thử nghiệm trên lâm sàng

Không chỉ vậy loài nấm Isaria tenuipes còn được phát hiện có hàm lượng

dinh dưỡng cao: giàu các vitamin D, vitamin B1, vitamin B6, và nhiều nguyên tố khoáng như K, Fe, Mg, Cu (Borchers et al., 1999; Liu et al., 1996; Lee et al., 1996)

Trong thể quả của nấm Isaria tenuipes còn chứa các hợp chất sinh học

và giá trị dược phẩm cao, chẳng hạn như adenosine và N6-(2-hydroxyethyl) adenosine [13] Nấm này đã được sử dụng như một loại thuốc dân gian truyền thống hoặc như là một thực phẩm thành phần tăng cường hệ thống miễn dịch

và lấy lại năng lượng, tương tự như các chức năng bổ của nhân sâm

Một kết quả thí nghiệm về sức sống của chuột cho thấy chuột uống dịch nấm đông trùng hạ thảo chiết trong nước, chiết trong cồn và đối chứng (được uống nước vô trùng) đều sống khỏe mạnh trong 4 tuần thí nghiệm và biểu hiện bình thường về hình thái, tập tính trong ăn, uống và các hoạt động khác trong cả 2 lần thí nghiệm dù liều dùng cho chuột/ngày là rất cao so với thể trọng của chuột Điều này cho thấy với liều uống hàng ngày tương đương

890mg nấm đông trùng hạ thảo Isaria tenuipes/kg thể trọng là an toàn đối với

chuột bạch Thời gian bơi của chuột được uống dịch chiết nấm trong nước và trong cồn đều dài hơn so với đối chứng Chuột đối chứng có thời gian bơi dao động từ 3 đến 4 giờ, còn ở các công thức được uống dịch chiết của nấm thường là trên 5 giờ Điều đó cho thấy nấm đã tăng cường khả năng vận động của chuột

1.1.4 Nghiên cứu về nuôi trồng thể quả trên giá thể và nuôi cấy sinh khối

hệ sợi

Trong những năm gần đây cùng với phương pháp nuôi cấy hệ sợi nấm trong môi trường lỏng (Xu và cs, 2003; 2004; 2006) thì phương pháp nuôi cấy nấm nhân tạo trên giá thể tằm - nhộng để sản xuất nấm ở qui mô lớn làm dược liệu hoặc thức ăn bổ dưỡng rất phát triển tại các nước như Nhật Bản, Trung Quốc và Hàn Quốc [22]; Kikuchi và cs, 2004

Nuôi cấy thu sinh khối hệ sợi cũng được các tác giả tiến hành trên môi trường dinh dưỡng lỏng với thành phần như sau: 40 g/lít đường glucose, 10 g/lít cao nấm men, 0.5 g/lít KH2PO4, 0.5 g/lít K2HPO4:3H2O, và 0.5 g/lít MgSO4.7H2O

Ở Hàn Quốc dạng bào tử vô tính Isaria tenuipes đã được nuôi cấy trên

môi trường có chứa nhộng tằm, kết quả cho thấy tỷ lệ sống cao nhất đạt 97,6% trên các giống tằm được thử nghiệm Trọng lượng tươi của bào tử vô

tính Isaria tenuipes khác nhau tùy theo từng mùa, dao động từ 1,44 ~ 0,94 g Đạt cao nhất khi nuôi cấy vào mùa xuân Bào tử vô tính của I tenuipes sản

xuất trên nhộng là màu trắng hoặc màu trắng sữa, và tương tự về hình dạng và màu sắc thể quả thu thập trong tự nhiên [20]

Trong những năm gần đây cùng với phương pháp nuôi cấy hệ sợi nấm trong môi trường lỏng thì phương pháp nuôi cấy nấm nhân tạo trên giá thể nhộng tằm [15] Ngoài ra nấm cũng được nuôi cấy trên môi trường gạo và nhộng tằm [20]

Thành phần môi trường nuôi cấy nấm luôn là đề tài để các nhà khoa học nghiên cứu tìm ra môi trường thích hợp nhất phù hợp với mục đích nuôi cấy Thành phần trong 1 lít môi trường [9]: 50g glucose, 1.84g NH4NO3, 0.39g KH2PO4, 1.42g Na2HPO4.12H2O, 0.60g MgSO4.7H2O, 0.1mg KCl, 2mg MnSO4.H2O, 10mg CoCl2.6H2O, 2mg Na2MoO4·2H2O, 20mg ZnSO4.7H2O, 3mg of CuSO4·5H2O, 2mg of FeSO4.7H2O and 60mg of EDTA Trong thành phần này KH2PO4 phosphate làm ảnh hưởng đến sinh khối của nấm tuy nhiên lại có khả năng kích thích làm tăng số lượng thể quả

1.2 Nghiên cứu ở trong nước

1.2.1 Nghiên cứu về thành phần loài các loài nấm ký sinh côn trùng và nấm đông trùng hạ thảo

Các loài nấm ký sinh côn trùng như Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, đã được nghiên cứu về những vấn đề khác nhau như điều tra

thành phần loài, loài sâu bị ký sinh, phân lập và nuôi cấy trong phòng thí nghiệm và đặc biệt là nhân sinh khối, tạo chế phẩm để phòng trừ một số loài sâu hại đối với cây nông nghiệp và cây lâm nghiệp Phân lập và sử dụng nấm

Beauveria để phòng trừ mọt hại nông sản [2] Nghiên cứu sản xuất với quy

mô công nghiệp và thử nghiệm trên diện rộng chế phẩm nấm ký sinh côn

trùng Beauveria và Metarhizium được thể hiện nhiều trong các công trình

nghiên cứu của [7]

Trong báo cáo tổng kết đề tài "Nghiên cứu xây dựng công trình nuôi

trồng nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris (L.:Fr.) có giá trị dược liệu

và thương mại cao" của PGS.TS Phạm Quang Thu [6] cho thấy đã điều tra

được rất nhiều mẫu nấm của Isaria tenuipes Loài nấm I tenuipes này lần đầu

tiên được phát hiện và mô tả ở Việt Nam vào năm 2010 [4] Loài nấm này phân bố ở rừng tự nhiên nhiệt đới lá rộng thường xanh ở độ cao từ 800 - 1000

m so với mực nước biển Hiê ̣n đã phát hiê ̣n được nhiều mẫu nấm Isaria

tenuipes ở các Vườn Quốc gia Ba Vì - Hà Nội và Vườn Quốc gia Tam Đảo - Vĩnh Phúc, Vườn Quốc gia Tây Yên Tử - Quảng Ninh Nấm mọc đơn lẻ hoặc mọc thành cụm, chùm trên nhộng thuộc bộ Cánh vẩy [5]

1.2.2 Nghiên cứu về giá trị dược liệu

Tác dụng của đông trùng hạ thảo cũng được nhiều tác giả Việt Nam khẳng định Theo tài liệu tổng hợp của y học cổ truyền Việt Nam thì đông trùng hạ thảo có tác dụng bổ phế và thận, ích khí, chỉ huyết và trừ đờm Chủ trị: trị ho lâu ngày, yếu mệt, thổ huyết, nhiều mồ hôi, di tinh, đau lưng mỏi gối Thận kém biểu hiện như bất lực, xuất tinh và đau lưng dưới và đầu gối: Dùng đông trùng hạ thảo với Sơn thù du, Sơn dược và Thỏ ti tử, hoặc dùng độc

vị đông trùng hạ thảo Ho và hen mạn tính hoặc ho có đờm máu, do phế hư: Dùng đông trùng hạ thảo với Sa sâm, A giao và Xuyên bối mẫu Ra mồ hôi nhiều do cơ thể mệt, ốm: đông trùng hạ thảo nấu với thịt gà, vịt hoặc heo [29]

Đỗ Tất Lợi (1977) [1] cho rằng Đông trùng hạ thảo là một vị thuốc bổ, dùng để chữa trị thần kinh suy nhược, chữa ho, ho lao, bổ tinh khí, chữa đau lưng, bổ thận Liều dùng 6 - 12 g với hình thức ngâm rượu

Một số sản phẩm từ nấm Đông trùng hạ thảo I tenuipes [30]:

- Nấm khô: Nấm tươi sau khi thu hoạch được sấy ở 600C trong 24 giờ

và bảo quản trong tùi nylon hàn kín

- Rượu Đông trùng hạ thảo: phát triển sản phẩm rượu từ nấm Đông trùng hạ thảo nhằm mục đích tăng cường thể lực Thành phần của rượu bao gồm: Nấm khô được ngâm trong rượu nếp với tỷ lệ 20 gr nấm khô trong 1lít rượu Rượu có màu vàng nâu, mùi vị thơm, ngon

- Viên nang Đông trùng hạ thảo: Bột nấm Đông trùng hạ thảo bổ sung thêm chất phụ gia được trộn ướt bằng máy trộn siêu tốc rồi sấy tầng sôi ở

700C trong 20 phút Sau đó trộn khô, đóng viên nang, mỗi viên 400mg Đóng

lọ 50 viên

1.2.3 Nghiên cứu về nuôi trồng thể quả trên giá thể và nuôi cấy sinh khối

hệ sợi

Ở Việt Nam thì các nghiên cứu về nuôi trồng thể quả nấm đông trùng

hạ thảo Isaria tenuipes có rất ít

Quy trình sản xuất đông trùng hạ thảo trên tằm dâu của tiến sỹ Nguyễn Mậu Tuấn [30] tại Trung tâm Nghiên cứu Thực nghiệm Nông Lâm nghiệp Lâm Đồng tại Bảo Lộc hoàn tất đã mở ra một hướng đi mới đầy triển vọng cho Lâm Đồng trong việc sản xuất dược liệu quý trên diện rộng Đây là người đầu tiên trong nước đưa ra được qui trình hoàn chỉnh về sản xuất đông trùng

hạ thảo trên con tằm dâu, một loại côn trùng được người dân nuôi từ rất lâu đời và với qui trình này có thể sản xuất đại trà loại dược liệu quý này ngay trên đất Lâm Đồng Cho đến nay tiến sỹ Tuấn đã hoàn thiện 2 qui trình nuôi

cấy đông trùng hạ thảo ở 2 sản phẩm là nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris) trên nhộng tằm dâu và đông trùng hạ thảo tằm dâu (Cordyceps takaomontana hay Isaria tenuipes (còn gọi là Paecilomyces tenuipes)) trên

con tằm dâu

Theo Tiến sỹ Nguyễn Xuân Thám [30], Phó Giám đốc Sở Khoa học Công nghệ Lâm Đồng, việc hoàn tất qui trình sản xuất đông trùng hạ thảo trên tằm dâu có ý nghĩa đặc biệt cho những người làm nghiên cứu sinh học trên đất Lâm Đồng, mở ra một hướng đi mới cho việc nghiên cứu sản xuất các loại dược liệu ở địa phương phục vụ phát triển kinh tế xã hội

Nhận xét:

Từ phần tổng quan tài liệu những nghiên cứu về Đông trùng hạ thảo cho thấy: nấm Đông trùng hạ thảo là một loài nấm có giá trị dược liệu quý, chữa trị được nhiều loài bệnh nan y như ung thư, kháng khuẩn, chống oxy hóa

và các bệnh về yếu sinh lý

Nghiên cứu về thành phần loài, giá trị dược liệu và nuôi trồng thể quả được tiến hành nghiên cứu với trình độ cao ở nhiều nước trên thế giới và đạt được kết quả tốt

Tại Việt Nam, những nghiên cứu về thành phần loài nấm Đông trùng

hạ thảo được công bố vào năm 1996 và 2001 có 3 loài nấm thuộc chi

Cordyceps Về thành phần hóa học và giá trị dược liệu chưa được nghiên cứu

nhiều, từ các nguồn tài liệu khác nhau, các nhà khoa học đã khẳng định nấm Đông trùng hạ thảo là một dược liệu quý và hiếm

Từ những cơ sở lý luận trên, việc nghiên cứu hệ thống về nấm Đông trùng hạ thảo ở Việt Nam là rất cần thiết Việc phân lập thuần khiết các chủng nấm ở Việt Nam để lưu trữ nguồn gen và tiến hành xác định hàm lượng để tuyển chọn chủng có tiềm năng dược liệu cao Đây là cơ sở ban đầu để tiếp tục nghiên cứu quy trình nuôi trồng nấm trong điều kiện ở Việt Nam

Chương 2 MỤC TIÊU, ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu nghiên cứu

- Tìm hiểu một số đặc điểm của hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết của các chủng nấm đã thu thập được

- Đánh giá hoạt tính sinh học của chủng nấm thông qua hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm bệnh của chúng

- Đánh giá khả năng hình thành thể quả trên giá thể nhân tạo

2.2 Đối tượng nghiên cứu

Chủng nấm Isaria tenuipes sưu tầm ở Vườn quốc gia Ba Vì

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Phân lập các chủng nấm Isaria tenuipes ở Việt Nam

- Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng của hệ sợi nấm trong nuôi cấy thuần khiết

- Nghiên cứu đặc điểm hình thái nấm Isaria tenuipes

2.3.2 Đặc điểm sinh học của hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết

- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng của hệ sợi

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ không khí đến sự sinh trưởng của hệ sợi

- Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh trưởng của hệ sợi

2.3.3 Nghiên cứu hoạt tính của các chủng nấm

- Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các chủng Isaria tenuipes

- Đánh giá hoạt tính kháng nấm của các chủng Isaria tenuipes

2.3.4 Nghiên cứu khả năng hình thành thể quả trên giá thể nhân tạo

- Thí nghiệm nuôi trồng các chủng Isaria tenuipes trên giá thể lỏng

- Thí nghiệm nuôi trồng các chủng Isaria tenuipes trên nhộng tằm

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp phân lập

2.4.1.1 Phương pháp phân lâ ̣p và nghiên cứu đặc điểm sinh học của hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết

Phân lâ ̣p nấm: Môi trường phân lập nấm Đông trùng hạ thảo là môi

trường PDA (Potato Dextrose Agar) Môi trường sau khi pha xong được hấp khử trùng ở 121oC trong thời gian 20 phút sau đó được đổ vào các hộp lồng

vô trùng Chọn thể quả nấm tươi mới, non không bị sâu bệnh Tách lấy bô ̣t

bào tử nấm cấy vào môi trường dinh dưỡng Sau đó cất giữ mẫu trong tủ định

ôn ở nhiệt độ 25oC Khi sợi nấm bắt đầu xuất hiê ̣n chọn sợi nấm không bị tạp nhiễm mọc ra từ mô nấm cấy truyền sang môi trường dinh dưỡng mới Sau khi tách sợi nấm khoảng 2 - 3 lần, sợi nấm không bị nhiễm khuẩn, nấm tạp và sợi nấm mọc đồng nhất thì được sợi nấm thuần khiết

Đặc điểm sinh trưởng của hệ sợi nấm trong nuôi cấy thuần khiết:

Các chủng nấm được cấy trên môi trường chuẩn PDA và được nuôi trong tủ định ôn có nhiệt độ 250C Định kỳ theo thời gian 05 ngày quan sát mô tả cách thức mọc, màu sắc, và đo tốc độ sinh trưởng của hệ sợi và khả năng sinh bào

tử vô tính (bào tử chồi) của nấm Sử dụng phương pháp quan sát, mô tả, đo đếm và chụp ảnh dưới sự hỗ trợ của kính hiển vi quang học và kính soi nổi

2.4.1.2 Nghiên cứu đặc điểm hình thái của nấm Isaria tenuipes

Nhận biết đặc điểm hình thái qua quan sát, mô tả, chụp ảnh (hình dạng, kích thước, màu sắc…) bằng mắt thường, kính hiển vi soi nổi Olympus SZ-

PT và kính hiển vi quang học Olympus BX50, xem đặc điểm của nấm như thể quả, bào tử, (hình dạng, kích thước, màu sắc, cách thức sắp xếp…)

2.4.2 Đặc điểm sinh học của hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết

2.4.2.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng và phát triển của hệ sợi

Nấm được nuôi cấy trên 07 môi trường dinh dưỡng lỏng với thành phần như sau:

TT Công thức Mô tả công thức thí nghiệm

6 Công thức 6 200 g/lít khoai tây + 20 g/lít glucoze

7 Công thức 7

30 g/lít glucose + 3 g/lít peptone + 0.5 g/lít KH2PO4 + 0.5 g/lít K2HPO4:3H2O, + 0.5 g/lít MgSO4.7H2O + 3 g/lit yeast extract + 5g/l nhộng

Môi trường được pha chế theo đúng tỷ lệ, hấp khử trùng ở 121oC và được đổ vào các lọ thuỷ tinh sạch, để nguội và cấy nấm Mỗi loài nấm được cấy trên 10 bình thuỷ tinh, thí nghiệm lặp lại 03 lần Sinh trưởng của hệ sợi đánh giá thông qua tro ̣ng lươ ̣ng tươi, tro ̣ng lươ ̣ng khô hê ̣ sơ ̣i Xử lý số liệu bằng Excel và SPSS

2.4.2.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ không khí đến sinh trưởng và phát triển của hệ sợi

Sau khi cấy nấm vào hộp lồng chứa môi trường thích hợp đặt vào các thang nhiệt độ không khí khác nhau: 100C, 150C, 200C, 250C, 300C và 350C

Chỉ tiêu đánh giá là sinh trưởng của hệ sợi, và sự hình thành bào tử vô tính (bào tử chồi) Mỗi thang nhiê ̣t đô ̣ được cấy trên 10 bình thuỷ tinh, thí nghiệm lặp lại 03 lần Xử lý số liệu bằng Excel và SPSS

2.4.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH môi trường đến sinh trưởng và phát triển của hệ sợi

Nấm đươ ̣c cấy trong các thang pH khác nhau: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 pH của môi trường đươ ̣c điều chỉnh bằng dung dịch HCL 10% và KOH 10% Sau khi

đã điều chỉnh pH môi trường đem hấp khử trùng ở 1210C tương đương 1 atm trong 20 phút Cấy nấm vào các lọ chứa môi trường thích hợp có độ pH khác nhau, theo dõi ở thang nhiệt độ 250C và độ ẩm không khí thích hợp Chỉ tiêu đánh giá là sinh trưởng của hệ sợi, và sự hình thành bào tử vô tính (bào tử chồi) Mỗi thang pH được cấy trên 10 bình thủy tinh, thí nghiệm lặp lại 03 lần Xử lý số liệu bằng Excel và SPSS

2.4.3 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm bê ̣nh của chủng nấm Isaria tenuipes

Chuẩn bị dịch nuôi cấy: Nuôi cấy hệ sợi nấm của các chủng nấm Đông

trùng hạ thảo cần thử hoạt tính trên môi trường lỏng sau 25 ngày lọc lấy dịch nuôi cấy Các chất có hoạt tính sinh học do hệ sợi nấm Đông trùng hạ thảo tạo

ra có trong dịch nuôi cấy

2.4.3.1 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của chủng nấm Isaria tenuipes

Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn: Khuẩn được chọn để đánh giá hoạt

tính kháng khuẩn của nấm Isaria tenuipes loài Bacillus subtilis Môi trường

PDA được đổ ra các hộp lồng để nguội trang khuẩn Bacillus subtilis đều trên

mặt thạch, giữa hộp lồng khoan lấy 01 giếng thạch có đường kính 10mm, cho 01ml dịch nuôi cấy nấm vào giếng ở giữa hộp lồng Nuôi cấy nấm trong điều kiện 250C, xác định đường kính vòng ức chế Mỗi loài nấm thí nghiệm với 05 hộp lồng với 03 lần nhắc lại

2.4.3.2 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính kháng nấm bê ̣nh của chủng nấm Isaria tenuipes

Đánh giá hoạt tính kháng nấm: Môi trường PDA được đổ ra các hộp lồng, giữa hộp lồng khoan lấy giếng có đường kính 10mm, cho 01ml dịch nuôi cấy nấm vào giếng ở giữa hộp lồng Để hộp lồng trong điều kiện nhiệt độ

40C cho các chất hóa học khuếch tán ra môi trường PDA Cấy chủng nấm

bệnh được chọn vào 04 góc của hộp lồng chứa dịch Nuôi cấy nấm trong điều kiện 25oC, sau 12 ngày xác định đường kính vòng ức chế Mỗi loài nấm thí nghiệm với 05 hộp lồng và 03 lần nhắc lại

2.4.4 Phương pháp nghiên cứu kha ̉ năng hình thành thể quả trên giá thể nhân tạo

2.4.4.1 Phương pháp nghiên cứu kha ̉ năng hình thành thể quả trên giá thể lỏng

Nấm Isaria tenuipes đươ ̣c cấy trên đĩa thạch PDA và nuôi ở điều kiê ̣n

25oC trong 07 - 10 ngày Nấm được cấy trên giá thể nước là môi trường dinh dưỡng di ̣ch thể được trình bày ở mu ̣c 3.4.2.1 Lo ̣ nuôi cấy có dung tích 250

ml, mỗi lọ đựng 100 ml môi trường di ̣ch thể, chiều sâu của dung dịch 4cm

Theo dõi sinh trưởng của nấm và sự hình thành mầm thể quả cũng như thể quả, chỉ tiêu đánh giá là số lượng thể quả, hình dáng và màu sắc thể quả

2.4.4.2 Phương pháp nghiên cứu kha ̉ năng hình thành thể quả trên giá thể nhộng tằm

Nuôi trồng thể quả nấm đông trùng hạ thảo tuyết trên nhộng tằm được thực hiện theo quy trình của Pil - Don Kang và cộng sự 2010 [19]

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Nghiên cứu đặc điểm hi ̀nh thái, giải phẫu và đặc điểm sinh trưởng

của chủng nấm Isaria tenuipes

3.1.1 Kết qua ̉ phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng các chủng nấm Isaria tenuipes ta ̣i vườn Quốc gia Ba Vì

Tại Vườn Quốc gia Ba Vì đã thu được 07 chủng nấm Isaria Kết quả

phân lâ ̣p nấm đươ ̣c trình bày trong bảng 3.1 sau:

Bảng 3.1: Đặc điểm và kết quả phân lập các chủng nấm ở Ba Vì

STT Ký hiệu

chủng Ký chủ

Kết quả phân lập

Tôc đô ̣ sinh trưởng (µm/giờ)

hệ sợi nấm của từng chủng được mô tả dưới đây:

Chủng BV2: Hệ sợi nấm khi cấy trên môi trường dinh dưỡng PDA khi

non có màu trắng, khi già chuyển dần sang màu vàng nhạt, sợi nấm dài, hệ sợi rất bông, độ dầy hệ sợi 0,8 mm, hệ sợi thường mọc thành những vòng tròn

đồng tâm (Hình 3.1)

Chủng BV4: Hệ sợi nấm bông, ngắn, màu trắng, độ dầy hệ sợi 0,3 mm,

hệ sợi nấm mọc thành những đường tròn đồng tâm bên trên có một lớp bột

mỏng màu trắng Nấm sinh trưởng nhanh (Hình 3.2)

Chủng BV5: Hệ sợi nấm bông, sợi nấm ngắn có màu vàng nhạt, độ dầy hệ sợi 0,8 mm Hệ sợi nấm cũng mọc thành những đường tròn đồng tâm (Hình 3.3)

Chủng BV6: Hệ sợi nấm dày 0,6 mm, nấm khi non có màu trắng, khi

già chuyển sang màu vàng chanh nha ̣t, sợi nấm ngắn mọc bám trên bề mặt thạch Nấm sinh trưởng nhanh nhất trên môi trường PDA, với tốc đô ̣ sinh trưởng 195,8 µm/giờ trong điều kiê ̣n nuôi cấy thuần khiết trên môi trường PDA

hệ sợi nấm vẫn có khả năng hình thành thể quả gần giống với thể quả ngoài tự

nhiên (Hình 3.4) Vì vậy, đề tài chọn nấm BV6 để tiến hành nghiên cứu về các

đặc điểm hình thái, giải phẫu, kháng khuẩn kháng nấm và nuôi trồng nhân tạo

Chủng BV11: Hệ sợi nấm bông, ngắn, có màu trắng đục Độ dày hệ sợi

0,3 mm, tốc độ sinh trưởng khá nhanh Trong điều kiện nuôi cấy thuần khiết

thấy xuất hiện chồi bào tử phân sinh (Hình 3.5)

Chủng BV16: Hệ sợi nấm bông, ngắn, màu trắng tinh, độ dầy hệ sợi

0,3 Nấm mọc tròn đều, tốc độ sinh trưởng khá chậm Trong điều kiện nuôi

cấy thuần khiết chưa thấy xuất hiện chồi bào tử phân sinh (Hình 3.6)

Chủng BV17: Hệ sợi nấm ít bông, màu trắng hơi vàng, độ dầy hệ sợi 0,2 mm, tốc độ sinh trưởng của nấm là chậm nhất (Hình 3.7)

Một số hình ảnh về các chủng nấm phân lập được

Hình 3.1: Hệ sợi nấm BV2 Hình 3.2: Hệ sợi nấm BV4

Hình 3.3: Hệ sợi nấm BV5 Hình 3.4: Hệ sợi nấm BV6

Hình 3.5: Hệ sợi nấm BV11 Hình 3.6: Hệ sợi nấm BV16

Hình 3.7: Hệ sợi nấm BV17

(Nguồn: Tác giả)

3.1.2 Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu nấm Isaria tenuipes

Ngoài tự nhiên, thể quả nấm có màu trắng, bông, chiều dài thể quả nấm

khoảng 5 - 45 mm, thể quả (synnemata) bao gồm 2 phần chính là: cuống nấm

và tế bào sinh bào tử vô tính (conidiogenous structures) Cuống nấm dài bằng

¾ chiều dài thể quả, nấm có màu vàng chanh Phần trên là đỉnh sinh bào tử vô tính phân thành nhiều nhánh giống như san hô và căng phồng chứa đầy bào tử

màu trắng, nhìn tựa như các ha ̣t bu ̣i, khô và rất dễ ru ̣ng khỏi tế bào sinh bào

tử Kích thước thể quả rất biến đô ̣ng tùy thuô ̣c vào điều kiê ̣n mo ̣c mà số lượng thể quả nấm trên cùng mô ̣t ký chủ có thể khác nhau, thường nhiều và mọc

cụm (Hình 3.8)

Bào tử vô tính có hình dạng khác nhau, hình hạt gạo hoặc hạt đậu hơi cong ở giữa có kích thước nhỏ Chiều dài 2,3 - 3,0 m, chiều rộng 0,5 -

1,0m (Hi ̀nh 3.9)

Hình 3.8 Thể quả nấm Hình 3.9 Bào tử vô tính

(Nguồn: Phòng nghiên cứu bảo vệ thực vật rừng)

Từ những đặc điểm hình thái, giải phẫu và đă ̣c điểm hê ̣ sợi nấm, loài nấm trên được xác đi ̣nh là loài Isaria tenuipes (Peck.) Samson với 2 tên đồng nghĩa là Isaria japonica Yasuda, và Paecilomyces japonica Ellis Nấm thuộc chi Isaria thuộc họ Clavipiteceae, bộ Hypocrales, lớp Sorclariomycetes ngành

phụ nấm túi Ascomycota

3.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hệ sợi nấm trong điều kiện nuôi

cấy thuần khiết

3.2.1 Nghiên cứu xác định môi trường dinh dưỡng tối ưu cho nhân sinh khối hệ sợi

Kết quả đánh giá sinh trưởng của hệ sợi nấm sau 25 ngày nuôi cấy trên

7 công thức môi trường dinh dưỡng dịch thể khác nhau được trình bày trong bảng 3.2 sau:

Bảng 3.2: Kết quả xác định môi trường dinh dưỡng nhân sinh khối

hệ sợi nấm Isaria tenuipes

và tro ̣ng lươ ̣ng hê ̣ sơ ̣i, trong đó chỉ tiêu được xem là quan tro ̣ng nhất để đánh giá môi trường dinh dưỡng tốt nhất là tro ̣ng lươ ̣ng khô hê ̣ sơ ̣i

Trước tiên, ta thấy: Ở cả 7 công thức môi trường dinh dưỡng dịch thể thì nấm đều sinh trưởng được Tuy nhiên, ở mỗi loại môi trường dinh dưỡng khác nhau thì thời gian nấm sinh trưởng nhanh hay chậm cũng khác nhau, sinh trưởng nhanh ở các môi trường: CT6 chỉ cần 4 - 5 ngày sau khi cấy nấm, hệ sợi

nấm đã mọc kín bề mặt dịch thể, CT4 cần 12 ngày để mọc kín bề mặt nhưng ở các công thức môi trường khác như CT1, CT2, CT3, CT5, CT7 thì nấm mọc chậm hơn cần đến 20 - 25 ngày mới mọc kín được bề mặt giá thể (Hình 3.10)

Hình 3.10: Sinh trưởng hê ̣ sợi nấm ở các môi trường dinh dưỡng khác nhau

Hình 3.11: Sự khác nhau về độ dầy hê ̣ sợi nấm

(Nguồn: Tác giả)

Cũng theo bảng 3.2 trên, ta thấy: độ dầy hệ sợi nấm cũng khá khác nhau CT5 cần 21 ngày là nấm mo ̣c kín được bề mă ̣t môi trường di ̣ch thể và cho đô ̣ dày hê ̣ sợi nấm bông nhất, dày lên đến 5,0 mm CT7 với 20 ngày nuôi cấy, nấm mọc kín được bề mă ̣t môi trường, sợi nấm có đă ̣c điểm rất bông và

dài, đô ̣ dầy hê ̣ sơ ̣i là 4,0 mm gấp 4 lần so với hê ̣ sơ ̣i ở môi trường CT2 là 1,0

mm và CT4 với 12 ngày nuôi cấy nấm đã mo ̣c kín được bề mă ̣t di ̣ch thể, đô ̣ dầy hệ sơ ̣i 2,5 mm, CT6 chỉ cần 5 ngày sợi nấm mo ̣c kín được bề mă ̣t di ̣ch thể, độ dầy hê ̣ sơ ̣i đươ ̣c 3,5 mm Các môi trường CT1, CT2, CT3 nấm sinh

trưởng chậm, hệ sợi nấm mỏng dầy khoảng 1,0 - 1,8 mm Hình 3.11 ở trên đã

thể hiện rõ mức độ dày mỏng của hệ sợi

Dựa vào bảng 3.2 ở trên, ta cũng có thể thấy: Trọng lượng tươi của hệ sợi của môi trường CT6 là lớn nhất với 6,66 g/bình, tiếp theo là môi trường CT7 là 5,92/bình Công thức 4 cho trọng lượng tươi của hệ sợi là thấp nhất chỉ đạt 3,52g/bình Các môi trường còn lại cho kết quả trung bình từ 4,04 - 4,44 g/bình Điều này thể hiện rõ trong Hình 3.12 sau:

Hình 3.12: Trọng lượng tươi hê ̣ sợi ở các môi trường dinh dưỡng khác nhau

Dựa vào các chỉ tiêu nêu trên để đánh giá thì bảng 4.2 cho thấy sinh trưởng của nấm đa ̣t tối ưu cả 4 chỉ tiêu chính là khi nấm được nuôi trong công thứ c môi trường dinh dưỡng di ̣ch thể CT5 Ở môi trường này thì sinh khối hê ̣

sợi khô đa ̣t cao nhất lên đến 0,72 gam/bình vượt trội so với các công thức còn lại Công thức 7 có sinh khối khô hê ̣ sợi đa ̣t 0,52 g/bình Môi trường CT4 có trọng lươ ̣ng khô hê ̣ sơ ̣i 0,54 g/bình Công thức CT6 sinh khối hê ̣ sợi đa ̣t 0,5

Hi ̀nh 3.13: Trọng lượng khô hê ̣ sợi ở các môi trường dinh dưỡng khác nhau

Kết hợp hai hình 3.12 và 3.13: ta thấy có mô ̣t số công thức cho sinh khố i tươi cao nhưng khi sấy khô trọng lươ ̣ng khô la ̣i thấp ví du ̣ như CT6, hoă ̣c ngươ ̣c la ̣i tro ̣ng lươ ̣ng tươi có thể thấp hơn nhưng tro ̣ng lượng khô la ̣i cao như CT4, CT5, … điều này là do mô ̣t số công thức môi trường di ̣ch thể ta ̣o nên hê ̣

sợi nấm không chỉ nổi trên bề mă ̣t di ̣ch thể mà còn có mô ̣t phần hê ̣ sợi mo ̣c dưới bề mă ̣t di ̣ch thể do đó khi cân tro ̣ng lượng tươi thì hê ̣ sợi la ̣i nă ̣ng hơn so

vớ i những công thức khác có phần hê ̣ sơ ̣i dưới nước mỏng hơn Khi nấm nuôi trong các môi trường di ̣ch thể khác nhau đều cho hê ̣ sơ ̣i màu trắng

Dựa vào các phụ biểu 03, 04 và 05 ta thấy: CT5 có trung bình về độ dày hệ sợi và trọng lượng khô hệ sợi là lớn nhất CT7 cho trọng lượng tươi và

độ dày hệ sợi lớn thứ 2 Tuy CT6 cho trọng lượng tươi lớn nhất nhưng độ dày

hệ sợi và trọng lượng khô chỉ thuộc mức trung bình Các công thức môi trường còn lại đều cho các chỉ tiêu trên ở mức trung bình và thấp Xét một cách tổng quát thì CT5 và CT7 là tốt hơn các công thức môi trường khác

Như vâ ̣y, với kết quả như đã phân tích ở trên thì công thức cho năng suất nấm lớn về tro ̣ng lươ ̣ng khô là công thức CT5 và CT7 Công thức CT5 (40 g/lít glucose + 10 g/lít peptone + 0.5 g/lít KH2PO4 + 0.5 g/lít

K2HPO4:3H2O, + 0.5 g/lít MgSO4.7H2O + 10g/lít yeast extract) và CT7 (30 g/lít glucose + 3g/lít peptone + 0.5 g/lít KH2PO4 + 0.5 g/lít K2HPO4:3H2O, + 0.5 g/lít MgSO4.7H2O + 3 g/lit yeast extract + 5g/l nhộng) đều có thể đuơ ̣c chọn để nhân nuôi trồ ng thể quả nấm nhân ta ̣o Kết quả này có ý nghĩa rất lớn

vì nó là cơ sở cho việc nghiên cứu lựa chọn giá thể nhân tạo thích hợp để nhân sinh khối hệ sợi nấm và nuôi trồng thể quả nấm Từ kết quả thí nghiệm trên đề tài chọn môi trường CT5, CT7 là môi trường dinh dưỡng chính để

thực hiện nuôi cấy chủng nấm Isaria tenuipes

3.2.2 Nghiên cứu xác định nhiêt độ không khí tối ưu cho quá trình nhân sinh khối hệ sợi

Nhiệt đô ̣ không khí có ảnh hưởng rất lớn tới quá trình sinh trưởng của

hệ sợi nấm Loài nấm khác nhau có biên đô ̣ nhiê ̣t khác nhau, có những loài ưa nhiệt đô ̣ cao nhưng có những loài ưa nhiê ̣t đô ̣ thấp Vì vâ ̣y, việc nghiên cứu

xác đi ̣nh nhiê ̣t đô ̣ tố i ưu cho nấm sinh trưởng là rất quan tro ̣ng Từ kết quả lựa chọn môi trường dinh dưỡng di ̣ch thể tối ưu như trình bày trong phần 4.2.1 ở trên, công thức môi trường CT5, CT7 được tiếp tu ̣c để nghiên cứu xác đi ̣nh nhiệt đô ̣ không khí tối ưu cho sinh trưởng của nấm Isaria tenuipes, tiến hành

với 3 lần lặp thì kết quả được trình bày trong Bảng 3.3 dưới đây:

Bảng 3.3: Xác định nhiệt độ không khí tối ưu cho sinh trưởng của nấm

Môi

trường

Nhiê ̣t độ không khí

Thơ ̀ i gian

mo ̣c kín (Ngày)

Đô ̣ dầy

hê ̣ sơ ̣i

Trọng lượng (gam/bi ̀nh)

Chú thích: (-) Nấm không sinh trưởng

Bảng 3.3 cho thấy: khi nuôi cấy hệ sợi nấm Isaria tenuipes trên 6 thang

nhiệt độ 10oC, 15oC, 20oC, 25oC, 30oC, 35oC thì thời gian sinh trưở ng của nấm, độ dầy hệ sợi và trọng lượng hệ sợi nấm thu được khác nhau rất rõ ràng

ở cả hai công thức môi trường

Theo như bảng trên thì hệ sợi nấm hầu như không sinh trưởng ở nhiệt

độ 30oC và 35oC, còn ở nhiệt độ 10oC thì nấm sinh trưở ng rất châ ̣m, sau 30 ngày cấy mà nấm vẫn chưa mọc kín được bề mă ̣t môi trường, đô ̣ dầy hê ̣ sợi

cũng rất mỏng chỉ được 1,0 mm Trong khi đó ở các thang nhiê ̣t đô ̣ 15oC,

20oC và 25oC thì nấm lại sinh trưở ng tốt, sơ ̣i nấm màu trắng và rất bông ở cả hai môi trường CT5 và CT7, sau 15 - 20 ngày thì nấm mọc kín bình, độ dầy

hệ sợi từ 3,0 - 6,0 mm Đặc biệt, ở nhiệt độ 150C thì thời gian nấm mọc kín bình là ngắn nhất (16 ngày ở CT5 và 15 ngày ở CT7) (Hình 3.14)

Hi ̀nh 3.14: Sinh trưởng của nấm ở thang nhiê ̣t độ không khí khác nhau

(Nguồn: Tác giả )

Đối với CT5 thì nhiệt độ cho năng suất hệ sợi nấm lớn nhất là nhiệt độ

15oC với 6,68 g/bình trọng lượng tươi tương đương với 1,36 g/bình tro ̣ng lượng khô, tiếp theo là ở nhiệt độ 20oC với 6,57 g/bình trọng lượng tươi hệ sợi tương đương với 1,09 g/bình tro ̣ng lượng khô, môi trường nhiệt độ 25oC với 6,06g/bình trọng lượng tươi tương ứng với 0,56 g/bình trọng lượng khô hệ sợi

Công thức 7 ở nhiệt độ cho năng suất hệ sợi lớn nhất cũng là môi trường nhiệt độ 15oC với 7,09 g/bình trọng lượng tươi tương đương với 0,69g/bình khi sấy khô, tiếp theo là môi trường nhiệt độ 20oC với 6,70 g/bình trọng lượng tươi tương ứng với 0,58 g/bình trọng lượng khô hệ sợi, môi trường nhiệt độ 25oC với 6,32 g/bình trọng lượng tươi hệ sợi tương đương với 0,54 g/bình trọng lượng khô hệ sợi Còn trọng lượng của hệ sợi tươi và khô của cả hai công thức môi trường ở thang nhiệt 100C hầu như không đáng kể.

Tiến hành phân tích phương sai hai nhân tố trên SPSS thì theo phụ biểu

11 và 13 thì ở nhiệt độ môi trường 150C cho kết quả trọng lượng tươi và trọng lương khô hệ sợi là lớn nhất là 6,885g/bình và 1,025g/bình

Sự khác nhau này có thể thấy rõ qua Hình 3.15 và Hình 3.16 dưới đây:

Hi ̀nh 3.15: Trọng lượng tươi hệ sơi ở các nhiệt độ không khí khác nhau

Hi ̀nh 3.16: Trọng lượng khô hệ sợi ở các nhiệt độ không khí khác nhau

Như vậy, ta có thể thấy rằng: khi nuôi cấy nấm ở các nhiệt độ không khí khác nhau thì thời gian nấm sinh trưởng nhanh hay chậm cũng khác nhau,

bề dầy của hệ sợi cũng rất khác nhau Như vâ ̣y, ta có thể kết luâ ̣n nấm Isaria tenuipes không thể sinh trưở ng đươ ̣c ở nhiê ̣t đô ̣ 300C và 35oC, sinh trưở ng rất

kém ở nhiê ̣t đô ̣ 10oC và không có khả năng hình thành thể quả Vậy biên đô ̣ nhiệt phù hợp cho sinh trưởng của nấm là trong khoảng 15 - 25oC

3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh trưởng của hệ sợi

Nghiên cứu ảnh hưởng pH của môi trường đến sinh trưởng của hê ̣ sợi

và khả năng hình thành thể quả nấm được thực hiê ̣n trên môi trường dinh

dưỡng di ̣ch thể CT5 và CT7 Kết quả sinh trưởng nấm I.tenuipes (lấy trung

bình 03 lần lặp) đươ ̣c trình bày trong Bảng 3.4 sau:

Môi

trường

pH môi trường

Thơ ̀ i gian

mo ̣c kín (Nga ̀y)

Theo bảng 3.4 trên thì nấm được cấy trên môi trường có 7 mức pH khác nhau là từ 3,0; 4,0; … 9,0 đều cho thấy nấm sinh trưởng và phát triển tốt Tuy nhiên, ở mỗi một môi trường pH khác nhau thì sự sinh trưởng của nấm lại có sự khác nhau, có loại sợi nấm mọc cao, bông hơn và nổi trên bề mặt môi trường như pH = 7, pH = 8 và pH = 9 của cả công thức CT5, CT7 Hay cũng có loa ̣i sinh trưởng nhanh như môi trường pH = 5 nấm chỉ cần 15 ±

2 ngày đã có thể mo ̣c kín được bề mă ̣t giá thể, có loa ̣i sinh trưởng châ ̣m như ở

pH = 3 cần tớ i 24 - 25 ngày mới kín được Ngoài ra, ta cũng thấy độ dày mỏng của hệ sợi nấm cũng có khác nhau, tuy nhiên sự chênh lê ̣ch này không quá lớn (Hình 3.5 và Hình 3.6)

Hình 3.18: Hê ̣ sợi nấm nuôi cấy trên môi trường CT7 ở các pH khác nhau

(Nguồn: Tác giả)

Hình 3.17: Hê ̣ sợi nấm nuôi cấy trên môi trường CT5 ở các pH khác nhau

Bảng 3.4 trên cũng cho thấy khi nuôi cấy hệ sợi nấm trên 7 môi trường

pH khác nhau thì trọng lượng hệ sợi nấm thu được cũng khác nhau rất rõ:

Đối với chủng nấm cấy trên công thức CT5 thì môi trường pH cho năng suất hệ sợi lớn nhất là môi trường pH = 8, 9, 7 và 6 với tro ̣ng lượng tươi lần lượt là 5,67; 5,44; 5,43; 4,48 g/bình trọng lượng khô tương đương với 1,00; 1,00; 0,89; 0,89 g/bình khi sấy khô Sinh trưở ng của nấm thấp nhất về tất cả

các chỉ tiêu là môi trường có pH = 3 với tro ̣ng lượng tươi là 3,91 g/bình trọng lượng tuơi tương đương với 0,69 g/bình khi sấy khô, trung bình là pH môi trường 4 - 5 với tro ̣ng lượng tươi là 4,39; 4,45 g/bình trọng lượng tuơi tương đương với 0,74; 0,83 g/bình khi sấy khô (Hình 3.19 và Hình 3.20)

Dựa vào các chỉ tiêu tro ̣ng lượng khô hê ̣ sợi, thì có thể thấy pH môi trường CT5 cho năng suất của nấm lớn nhất là pH trong khoảng 6 - 9

Sinh trưởng của nấm trên công thức môi trường dinh dưỡng CT7 có điều chỉnh pH cũng có sự khác nhau rất rõ Môi trường pH cho năng suất hệ sợi nấm lớn nhất trên các chỉ tiêu vẫn là môi trường pH = 9, 8 với tro ̣ng lượng tươi hê ̣ sơ ̣i là 5,44 - 5,50 g/bình tương đương với tro ̣ng lượng khô là 0,64 - 0,69 g/bình Tiếp theo là pH môi trường từ 5 - 7 với tro ̣ng lươ ̣ng tươi hê ̣ sơ ̣i khoảng từ 5,0 - 5,5 g/bình tương đương với tro ̣ng lương khô khoảng 0,5 g/bình Thấp nhất vẫn là pH môi trường = 3 và 4 với tro ̣ng lươ ̣ng tươi hê ̣ sơ ̣i khoảng 5,0 - 5,1 g/bình tương đương với 0,4 - 0,5 g/bình tro ̣ng lượng khô

Dựa vào các phụ biểu 19 và 21 (phân tích trên SPSS), ta thấy được rằng: Trọng lượng tươi và trọng lượng khô hệ sợi trung bình đạt cao nhất ở môi trường có pH = 8 lần lượt là: 5,585g/bình và 0,845g/bình, sau đó là môi trường pH = 9, 7 và 6 Còn ở các môi trường có pH từ 3 - 5 cho trọng lượng tươi và khô hệ sợi thấp

Sự khác nhau này có thể thấy rõ qua Hình 3.7 và Hình 3.8 dưới đây:

Hình 3.19: Trọng lượng tươi hệ sợi ở pH môi trường khác nhau

Hình 3.20: Trọng lượng khô hệ sợi ở pH môi trường khác nhau

Từ hình 3.19 và 3.20 cho thấy cả 2 công thức môi trường CT5 và CT7 đều cho trọng lượng hệ sợi khô cao nhất ở môi trường có pH = 8 và pH = 9 và

thấp nhất ở môi trường có pH = 3

Như vâ ̣y, qua viê ̣c phân tích kết quả ở trên cho ta thấy nấm Isaria tenuipes có thể sinh trưởng đươ ̣c trên môi trường dinh dưỡng có pH từ axit tới kiềm tứ c là từ pH = 3,0 - 9,0 Nhưng sinh trưởng của nấm tố t nhất trên môi trường CT5 có pH từ 6,0 - 9,0 và môi trường CT7 có pH từ 8,0 - 9,0 Điều

này cho thấy nấm thích nghi với môi trường pH kiềm

3.3 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm bê ̣nh

của chủng nấm Isaria tenuipes

3.3.1 Bước đầu đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của nấm Isaria tenuipes

Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các chủng nấm Isaria tenuipes bước đầu được thử nghiệm với loại khuẩn Bacillus subtilis, khả năng kháng

khuẩn được thể hiện thông qua đường kính vòng ức chế hay còn gọi là vòng

vô khuẩn

Tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn Bacillus subtilis bằng dịch nấm Isaria tenuipes sau 22 ngày (mọc hệ sợi nấm) và 100 ngày nuôi cấy

(sau khi đã mọc thể quả) Kết quả theo dõi hoạt tính kháng khuẩn của nấm

Isaria tenuipes được thông qua đường kính trung bình vòng kháng khuẩn thể

hiện trong bảng 3.5 dưới đây:

Bảng 3.5: Đường kính vòng ức chế khuẩn B subtilis của nấm I tenuipes

Ngày Độ pha loãng Đường kính (mm) Đối chứng

Theo bảng trên thì ta thấy: Ở mẫu thử nghiệm dịch nấm Isaria tenuipes

sau 22 ngày nuôi cấy thì trung bình đường kính vòng ức chế lớn hơn trung bình đường kính vòng ức chế ở mẫu thử nghiệm dịch nấm sau 100 ngày nuôi cấy ở cả 3 cấp pha loãng Ở cấp pha loãng 10-1 thì đường kính vòng ức chế ở mẫu 22 ngày lớn hơn 0,83 mm so với mẫu 100 ngày cùng cấp, ở cấp pha loãng 10-3 là 0,33 mm, ở cấp pha loãng 10-2 thì mẫu 22 ngày có đường kính vòng ức chế lớn hơn 0,26 mm so với mẫu 100 ngày ở cùng cấp pha loãng Tuy nhiên, sự lớn hơn này không đáng kể

Cũng theo bảng trên ta thấy: Ở cùng mẫu dịch lấy thử nghiệm thì có sự khác nhau giữa các cấp pha loãng Ở cấp pha loãng 10-1 thì có đường kính vòng ức chế lớn hơn so với 2 cấp pha loãng còn lại Ở mẫu dịch nấm 22 ngày thì cấp độ pha loãng 10-1 lớn hơn 0,8 - 1,33 mm so với hai cấp pha loãng còn lại Còn ở mẫu dịch nấm 100 ngày thì cấp độ pha loãng 10-1 lớn hơn 0,3 - 0,75

mm so với hai cấp pha loãng còn lại Tuy nhiên, sự khác nhau này cũng không quá lớn (Hình 3.21)

Hình 3.21: Đường kính vòng ức chế khuẩn B subtilis của nấm I tenuipes