Sự kiểm soát biểu hiện của nhân tố kích hoạt phiên mã flowering BHLH (basic helix–loop–helix) của gen CONSTANS (CO) điều hòa quang kỳ ra hoa ở arabidopsis

Sự kiểm soát biểu nhân tố kích hoạt phiên mã Flowering BHLH (basic helix– loop–helix) gen CONSTANS (CO) điều hòa quang kỳ hoa Arabidopsis I Tổng quan SỰ HÌNH THÀNH HOA Định nghĩa: Sự hình thành hoa dấu hiệu chuyển tiếp từ giai đoạn sinh dưỡng sang giai đoạn sinh sản Các giai đoạn hình thành hoa  Sự chuyển tiếp hoa  Sự tượng hoa  Sự tăng trưởng nở hoa Các yếu tố ảnh hưởng Các yếu tố tác động đến giai đoạn cảm ứng hình thành hoa bao gồm: nhiệt độ quang kỳ Đặt vấn đề:  Ở Arabidopsis: dịch mã mRNA gen CO dẫn đến hoạt hóa số gen khởi phát hoa FT khởi phát tượng hoa  Điều hòa phiên mã gen CONSTANS (CO) điều hòa dịch mã protein CO chế quan trọng để đo độ dài ngày quang kỳ hoa Arabidopsis có số yếu tố điều hòa phiên mã CO Một số yếu tố điều hòa phiêm mã CO  GIGANTI (GI)  FLAVIN-BINDING  KELCH REPEAT  F-BOX (FKF1)  RED RED FAR-INSENSITIVE (RFI2)  LONG VEGETATIVE PHASE (LOV1)  FIONA1 (FIO1)  LIGHT-REGULATED WD1 (LWD1)/2 proteins CYCLING DOF FACTOR (CDF)  FLOWERINGBHLH1 (FBH1), FBH2, FBH3 FBH4 yếu tố điều hòa phiên mã trên, ta tập trung nhân tố khởi đầu phiên mã gen CO FBH1, FBH2, FBH3, FBH4 FBH protein có cấu trúc xoắn vòng xoắn, nhân tố mà ưu tiên liên kết với yếu tố cis E-box promoter CO E-box vùng trình tự nằm vị trí điểm khởi đầu phiên mã, protein FHB gắn vào khởi phiên mã CO II Đối tượng nghiên cứu Giống hoang dại Arabidopsis thaliana Các giống đột biến: fbh III Mục đích thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng BHLH điều hòa quang kỳ hoa Arabidopsis IV Kết thí nghiệm Thí nghiệm 1: chứng minh FBH1 FBH2 nhân tố gắn vào promoter cảu gen CO vị trí E-box hình 1A, người ta tiến hành nghiêm thức, lấy đoạn trình tự vùng promoter gen CO với độ dài là: - Từ -509 đến -1 ( có chứa vùng E-box G-box) - Từ -288 đến -1 ( có chứa vùng E-box G-box) - Từ -196 đến -1 ( có chứa vùng G-box) Sau tiến hành đo biểu nhân tố FBH1 FBH2 Kết cho thấy biểu FBH1 FBH2 cao đoạn tirn2h tự có vùng E-box, đoạn trình tự có vùng E-box biểu hơn, vùng trình tự có vùng Gbox gần biểu nhận tố FBH1 FBH2 Ta kết luận rằng: FBH1 FBH2 nhân tố liên kết với promoter gen CO vị trí E-box Để có thêm kết người ta tiến hành thêm thí nghiệm hình 1B Người ta làm tương tự hình A với nghiêm thức - đoạn trình tự có vùng E-box - đoạn trình tự bị đột biến vùng E-box Kết cho thấy trình tự có vùng E-box có biểu mạnh FBH1 FBH2 trình tự bị đột biến vùng E-box gần biểu nhân tố Dẫn đến kết luận sau cho thí nghiêm này: FBH1 FBH2 liên kết với promoter gen CO vị trí E-box FBH1 FBH2 nhân tố kích hoạt hoa thông qua CO / FT FBH1 FBH2 có vai trò quan trọng trình điều hòa phiên mã CO, biểu mức FBHs thay đổi lượng CO biểu hiện, từ làm thay đổi thời gian hoa Vì vậy, người ta phân tích tượng hoa FBH1 FBH2 biểu mức (35S:FBH1 35S:FBH2) điều kiện ngày dài ngày ngắn Hình 2A cho thấy tổng số chứa FBH1 FBH2 biểu mức thấp nhiều so với hoang dại Sự thay đổi kiểu hình dấu hiệu quan trọng cho thấy tượng hoa sớm chứa FBH1 FBH2 biểu mức điều kiện ngày dài ngày ngắn (Hình 2A-C) Trong điều kiện ngày dài, chuyền gen 35S:FBH1 35S:FBH2 hoa 18 ngày tuổi hoang dại 27 ngày tuổi chưa hoa Tương tự, điều kiện ngày ngắn, chuyền gen 35S:FBH1 35S:FBH2 hoa 28 ngày tuổi hoang dại 70 ngày tuổi chưa hoa Kết cho thấy FBHs biểu mức làm tăng lượng CO Như dự đoán, lượng CO biểu chứa FBH1 FBH2 biểu mức cao nhiều so với hoang dại điều kiện ngày dài ngày ngắn (Hình 2D E) Điều cho thấy FBH1 FBH2 cảm ứng phiên mã CO Thật thú vị, lượng CO biểu 35S: FBHs cao 20 lần so với hoang dại mô hình biểu CO 35S: FBHs giống với hoang dại điều kiện ngày dài ngày ngắn Kết cho thấy FBHs biểu mức làm tăng lượng CO phiên mã Để làm sáng tỏ nguyên nhân hoa sớm chứa FBH1 FBH2 biểu mức, người ta nghiên cứu mức độ biểu FT điều chỉnh thời gian hoa FT mRNA tăng cao chứa FBHs biểu mức điều kiện ngày dài ngày ngắn (Hình 2F G) Những kết cho thấy lượng FT cao giúp hoa sớm 35S: FBHs Để đánh giá khả này, người ta tiến hành đột biến ft 35S: FBH1 Kết cho thấy tượng hoa muộn điều kiện ngày dài ngày ngắn Kết góp phần giải thích tượng hoa sớm 35S:FBH1 chủ yếu gia tăng lượng FT lượng CO cao Người ta chứng minh tăng nồng độ FBH1 FBH2 dẫn đến tăng biểu CO Để phân tích biểu CO phụ thuộc vào lượng FBHs, người ta tiến hành cảm ứng FBHs nhờ β-Estradiol β-Estradiol bổ sung vào môi trường nuôi chuyển gen (pER8-FBH1, pER8-FBH2) hoang dại vào cuối ngày thứ biểu FBH1, FBH2 biểu CO phân tích ngày sau (Hình 2H) Sự biểu CO tăng chuyển gen mà biểu FBH1 hay FBH2 cảm ứng (Hình I-L) Kết tiếp tục lượng FBH1 FBH2 điều chỉnh biên độ dao động CO hàng ngày Bởi CO biểu chủ yếu mô mạch (Hình 2M) nên người ta phân tích biểu CO nhuộm GUS toàn con, mầm mầm chứa FBH1 FBH2 biểu mức hoang dại mười hai ngày tuổi Kết cho thấy CO: GUS hoạt động 35S: FBHs cao so với hoang dại CO biểu cao mầm (Hình 2M-O) Tương tự, người ta phân tích biểu FT Kết FT: GUS hoạt động 35S: FBHs cao so với hoang dại FT biểu cao trưởng thành Như vậy, chứa FBH1 FBH2 biểu mức hoa sớm lượng FBH1 FBH2 cao làm tăng lượng CO biểu từ kích hoạt FT giúp hoa sớm không phụ thuộc vào quang kỳ 3 FBH1 liên kết gần vị trí khởi đầu phiên mã promoter CO Để hiểu chế điều hòa CO phụ thuộc FBH, kiểm tra vùng biểu FBH1 cách phân tích vùng biểu promoter FBH1_ GUS (FBH1: GUS) Chúng giả định FBH1 nhân tố điều hòa CO, vùng biểu trùng lặp với vùng CO FBH1: GUS hoạt động, chủ yếu phát mô mạch (Hình A, B, C), dự đoán Tiếp theo, nghiên cứu xem FBH1 liên kết trực tiếp với promoter CO thể cách sử dụng phương pháp miễn dịch nhiễm sắc (ChIP) Đối với phương pháp ChIP, sử dụng chuyển gen biểu FLAG-gắn FBH1 điều hòa promoter FBH1 (FBH1: FLAG-FBH1) 35S: FLAG -FBH1 Để nghiên cứu FBH1 liên kết với promoter CO, thu hoạch phát triển LD (ZT4) biểu CO mức độ thấp ZT 13 biểu CO vào ban ngày đỉnh Chúng phân tích làm giàu FLAG-FBH1 cụ thể mảnh ADN điểm CO khác (amplicon 1-9 cách sử dụng PCR định lượng (qPCR) (Hình 3D) Trong FBH1: FLAG -FBH1, FBH1 cụ thể phát từ tất mẫu nhiễm sắc thu hoạch ZT ZT 13 (Hình E F) với mức cao amplicon 5, 6, 7, tiếp giáp với vị trí bắt đầu phiên mã CO Amplicon (vị trí: -430 Đến -273) amplicon (vị trí: -301 đến -89), hai chứa E-box Amplicon (-89 đến 66) có chứa E-box -5'-UTR CO So sánh kết thu từ hai thời điểm cho thấy lượng cao mẫu thu hoạch ZT 13 (Hình E F), trùng với vùng thượng nguồn phiên mã CO () Xu hướng tương tự quan sát thấy sử dụng chuyển gen 35S: FLAGFBH1 (Hình G H) 4 Các đồng đẳng FBH1 có chức hoạt hóa CO Để bổ sung cho phân tích biểu mức chúng tôi, phân tích kiểu hình đột biến Vì vậy, mở rộng tìm kiếm đồng đẳng FBH1 (hoặc FBH2) Trên sở phân tích phát sinh loài trước đó, có bốn gen bHLH nhánh giống FBH1 FBH2 (tên FBH3 FBH4) gây kiểu hình hoa sớm Điều biểu FT cao gây biểu gia tăng CO LD SD (Hình A, D) Tương tự kiểu hình biểu mức FBH1 FBH2 , vùng biểu CO phần lớn phục hồi dòng 35S: FBH3 35S: FBH4 (Hình A.) Bởi kết bốn protein FBH có chức không cần thiết, phân tích biểu CO cho thấy giảm lớn 50% biểu CO trong thời kỳ tối LD SD (Hình E F), cho thấy protein FBH kích hoạt chủ yếu CO đặc biệt khởi đầu đêm Trong LD, có giảm nhẹ biểu CO buổi chiều (Hình 4E) Điều gây biểu thấp FT sau nở hoa đột biến tăng gấp bốn lần LD () Những kết ngụ ý bốn protein FBH hoạt hóa phiên mã CO Arabidopsis V Kết luận  FBH1 FBH2 liên kết với promoter CO vị trí E-box điều hòa biểu gen CO dẫn đến điều hòa quang kỳ hoa Arabidopsis  Protein FBH tích cực điều hòa phiên mã CO cho quang kỳ hoa chế bảo tồn loài thực vật đa dạng  Protein FT tổng hợp mạch di chuyển đến mô phân sinh chồi (SAM) cho tín hiệu cảm ứng thay đổi hoa  khẳng định nhà khoa học là: protein FT tổng hợp sau chuyển lên vùng SAM mRNA protein FT vận chuyển lên vùng SAM tổng hợp protein Tài liệu tham khảo:  Shogo Ito, Young Hun Song, Anna R Josephson-Day, Ryan J Miller, Ghislain Breton, Richard G Olmstead and Takato Imaizumi (2012) FLOWERING BHLH transcriptional activators control expression of the photoperiodicflowering regulator CONSTANS in Arabidopsis PNAS 109: 3582–3587  www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1118876109 ... khởi phát hoa FT khởi phát tượng hoa  Điều hòa phiên mã gen CONSTANS (CO) điều hòa dịch mã protein CO chế quan trọng để đo độ dài ngày quang kỳ hoa Arabidopsis có số yếu tố điều hòa phiên mã. .. hoạt hóa phiên mã CO Arabidopsis V Kết luận  FBH1 FBH2 liên kết với promoter CO vị trí E-box điều hòa biểu gen CO dẫn đến điều hòa quang kỳ hoa Arabidopsis  Protein FBH tích cực điều hòa phiên. .. trưởng nở hoa Các yếu tố ảnh hưởng Các yếu tố tác động đến giai đoạn cảm ứng hình thành hoa bao gồm: nhiệt độ quang kỳ Đặt vấn đề:  Ở Arabidopsis: dịch mã mRNA gen CO dẫn đến hoạt hóa số gen