mô hình ảnh hưởng của asparaginase trong việc giảm sự hình thành acrylamide trong bánh quy

BỘ CÔNG THƢƠNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MÔI TRƢỜNG BÀI TIỂU LUẬN NHÓM Môn: CÔNG NGHỆ ENZYME ĐỀ TÀI: TÊN ĐỀ TÀI: GVHD: Đỗ THị Hiền TP Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng năm 2017 Danh sách nhóm Tên Nguyễn Thị Thùy Võ Thị Thu Thảo Trần Thị Nhàn MSSV 2008140309 2008140277 2008140196 MỤC LỤC Mở đầu Giới thiệu enzyme asparaginase chất acrylamide: I Sơ lƣợc chất acrylamide: Enzyme asparaginase: II Vật liệu phƣơng pháp: Chuẩn bị vật liệu: Phân tích acrylamide: Phân tích màu sắc: Xác định hàm lƣợng chất rắn: Phƣơng trình đa thức phân tích thống kê: III Kết thảo luận: IV Kết luận: 16 V Một số enzyme dùng sản xuất bánh kẹo: 17 Tài liệu tham khảo 18 Mở đầu Bánh quy loại bánh nướng phổ biến sử dụng nhiều Việt Nam giới Các nhà khoa học rằng, acrylamide có thực phẩm giàu carbohydrate chế biến nhiệt độ cao hình thành acrylamide Nguyên nhân hình thành acrylamide thực phẩm phản ứng asparagin đường khử glucose fructose xảy nhiệt độ cao( nướng hay chiên nhiệt độ lớn 1200C) độ ẩm thấp Bánh quy nướng nhiệt độ cao nên có khả tạo acrylamide Trong tiểu luận nhóm trình bày ảnh hưởng asparaginase việc giảm hình thành acrylamide bánh quy I Giới thiệu enzyme asparaginase chất acrylamide: Sơ lƣợc chất acrylamide:  Acrylamide chất hóa học sử dụng chủ yếu số ngành công nghiệp làm giấy, thuốc nhuộm, nhựa xử lý nước uống, nước thải Hợp chất tìm thấy số sản phẩm tiêu dùng, bao bì thực phẩm, số chất kết dính khói thuốc  Công thức phân tử C3H5NO  Acrylamide hình thành số loại thực phẩm giàu tinh bột chiên, nướng nhiệt độ 1200C Cơ quan Nghiên cứu Quốc tế Ung thư (IARC) - phần Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) phân loại acrylamide coi "chất gây ung thư xảy ra" quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ (EPA) trì hệ thống tích hợp rủi ro thông tin (IRIS), sở liệu điện tử có chứa thông tin ảnh hưởng sức khỏe người tiếp xúc với chất khác môi trường phân loại acrylamide "có thể chất gây ung thư cho người" dựa nghiên cứu động vật  Có nhiều phương pháp nghiên cứu để giảm lương acrylamide thực phẩm Trong việc sử dụng enzyme asparaginase tiền xử lý với khoai tây, bột tuyên bố để giảm hiệu nồng độ acrylamide mà không làm thay đổi diện mạo vị sản phẩm cuối Hiệu asparaginase việc giảm acrylamide chứng minh số đơn xin cấp sáng chế liên quan đến loại thực phẩm chế biến khác nhau, thức ăn nhanh, khoai tây chiên, loại thực phẩm dạng bột, vv Vì biết đến, asparaginase xúc tác trình thủy phân asparagine thành axit aspartic amoniac, loại bỏ tiền thân then chốt cho hình thành acrylamide Enzyme asparaginase:  Asparaginase (L- asparaginase amidohydrolase) enzyme thủy phân Lasparagine thành aspartic amoniac Asparaginase có mặt thực vật, động vật, vi sinh vật thực vật, phần lớn nghiên cứu enzyme từ đậu Ở động vật, enzyme tìm thấy gan gà Ở vi sinh vật enzyme có số chuẩn: Escherichia coli, serretia marcescens, Pseudomonas, aeruginosa, aerobacter aerogens Một số nấm mốc, nấm men sản sinh asparaginase Hình 1: cấu trúc 3D enzyme asparaginase  Asparaginase tổng hợp nội bào ngoại bào, hầu hết chủng sản sinh asparaginase ngoại bào thuộc nấm sợi asparaginase sinh từ sinh vật khác có khối lượng phân tử khác nhau: từ 40-200 kDa Tính chiệu nhiệt asparaginas khác thường khác Asparaginase số vi khuẩn P.earuginosa hoạt động tối ưu 370C, asparaginase Chrombacteriaceae có nhiệt độ tối ưu 200C,…  Cơ chế xúc tác asparaginase: Asparaginase giảm lượng acrylamide tạo thành sản xuất bánh quy thủy phân axit amin asparagine Enzyme asparaginase xúc tác thủy phân axit amin asparagine thành axit aspartic amoni, không cho asparagine tham gia vào phản ứng Mailard để hình thành acrylamide Việc bổ sung chế phẩm sinh học mà không làm ảnh hưởng đến tính chất cảm quan bánh quy acid amin khác tham gia phản ứng Mailard để tạo màu cho bánh quy mà không sinh hợp chất gây ung thư acrylamide  Enzym thương mại dựa việc nhân Aspergillus oryzae nhận công nhận 'trạng thái an toàn' Hoa Kỳ đánh giá Ủy ban chung FAO / WHO phụ gia Thực phẩm (JEFCA, 2007) Nó cho phép sử dụng Hoa Kỳ, Úc, New Zealand, Đan mạch Ở Canada, nơi mà enzyme sử dụng ứng dụng thực phẩm coi chất phụ gia thực phẩm, nên Quy định cho phép sử dụng asparaginase chất phụ gia thực phẩm (Health Canada, 2009) Trong năm 2008, Ủy ban Thường vụ Chuỗi Thực phẩm Thú y cho phép sử dụng asparaginase cho sản xuất sản phẩm bánh hai quốc gia thành viên EU, nhà sản xuất tuyên bố enzym bị bất hoạt trình chế biến nhiệt nướng  Các nghiên cứu cho thấy hoạt tính asparaginase bị ảnh hưởng liều enzyme, thời gian phản ứng, nhiệt độ pH mà phản ứng xảy ) Đặc biệt, asparaginase A oryzae cho thấy hoạt động mạnh khoảng pH trung tính nhiệt độ lên tới 60oC Hơn nữa, hoạt tính enzim chịu ảnh hưởng tiếp xúc với chất Trong thực tế, di chuyển hạn chế chất enzyme thủy phân Asparagine không hoàn toàn phần giảm hình thành acrylamide Về mặt việc phân hủy thực phẩm, hàm lượng nước môi trường phản ứng, ảnh hưởng lớn đến hiệu asparaginase việc giảm hình thành acrylamide Trên thực tế, việc giảm hàm lượng acrylamide lớn đạt cách sử dụng nồng độ asparaginase tương đối thấp thức ăn có công thức (lên đến 1000 U / kg), chẳng hạn sản phẩm bánh đồ ăn nhẹ dựa vào khoai tây đạt phân bố enzym tốt hệ thống Ngược lại, cần phải có nồng độ asparaginase cao (> 10,000 U / l dung dịch chiên sơ chiên) để giảm acrylamide khoai tây chiên (Pedreschi, Kaack, & Granby, 2008) Tuy nhiên, trường hợp này, hoạt động công nghệ làm tăng khuếch tán chất tiếp xúc với enzym làm giảm mức độ acrylamide Ngược lại, cần phải có nồng độ asparaginase cao (> 10,000 U / l dung dịch chiên sơ chiên) để giảm acrylamide khoai tây chiên (Pedreschi, Kaack, & Granby, 2008) Tuy nhiên, trường hợp này, hoạt động công nghệ ủng hộ khuếch tán chất tiếp xúc với enzym làm giảm mức độ acrylamide Đây trường hợp miếng khoai tây sau xử lý với asparaginase hoàn toàn  Không có mô hình ảnh hưởng asparaginase động học hình thành acrylamide Do phức tạp mối quan hệ biến môi trường liên quan đến trình enzyme hình thành acrylamide, hoạt tính enzyme hiệu nồng độ acrylamide cuối đạt được, nghiên cứu mối quan hệ cần thiết để tìm điều kiện tốt để giảm thiểu hình thành acrylamide Sự biến thiên tự nhiên trình nướng yếu tố ảnh hưởng hình thành acrylamide thay đổi đáng kể mặt hàng với thành phần tương tự quy trình nấu ăn (Levine & Smith, 2005) Hơn nữa, Bråthen Knutsen (2005) cho thấy độ biến thiên đóng vai trò quan trọng hệ thống tinh bột ảnh hưởng đến giá trị cuối acrylamide sau trình nướng bánh Nếu trình mở rộng, khác biệt cần phải đánh giá, để sai thiết lập phạm vi biến thiên bình thường trình công nghiệp (Aguirre, Frías, Barry-Ryan,Grogan, 2008) Mục đích nghiên cứu để điều tra ảnh hưởng asparaginase việc giảm hình thành acrylamide bánh quy bột ngắn Ảnh hưởng bổ sung asparaginase lên phát triển nâu nghiên cứu Đặc biệt, nồng độ asparaginase, thời gian ủ nhiệt độ điều chế theo ba biến thể, thiết kế trung tâm ba cấp II Vật liệu phƣơng pháp: Chuẩn bị vật liệu: Công thức bao gồm bột, bơ thực vật (Unigrà, Ý), sucrose (Carlo Erba, Milano Italy), nước, glucose (Carlo Erba, Milano, Ý), muối (Carlo Erba, Milano Italy), asparagine (Sigma-Aldrich, Italy) bột nướng (natri hydro cacbonat, disodium diphosphate, tinh bột sấy khô) (Cameo, Ý) Các thành phần bột thêm vào công thức với tỷ lệ tương ứng 40%, 35%, 20%, 5%, 0.7%, 0.1% 0.5% bột Các loại asparaginase khác (Novozymes A / S, Đan Mạch, 3500 U / g), khoảng từ 100 U / kg bột đến 900 U / kg bột, thêm vào công thức theo công thức ba thành phần, (CCD) (Bảng 1) Để đảm bảo phân bố đồng bột, asparaginase phân tán pha nước trước bổ sung vào thành phần khô Nó bổ sung vào thành phần khô Sau trộn thời gian nghỉ 30 phút C, bột làm thành 0,3 cm, cắt thành đường kính cm để lại thiết bị nhiệt nhiệt độ thời gian ủ khác theo CCD (Bảng 1) Đặc biệt, nhiệt độ ủ dao động từ 20 đến 54 C thời gian ủ từ 10 đến 30 phút Theo số liệu nghiên cứu, enzim hoạt động phạm vi biến đổi (Hendriksen cộng sự, 2009) Ngoài ra, nhiệt độ thời gian phản ứng chọn tương ứng với nhiệt độ nghỉ ngơi Và thời gian thường áp dụng cho bột cấp độ công nghiệp Các mẫu nướng lò không khí tuần hoàn (Salvis Thermocenter, Oakton, Vernon Hills, IL, USA) 2000 C đến độ ẩm cuối 2% Bánh quy pha chế mà không bổ sung asparaginase lấy làm kiểm chứng Để đánh giá biến đổi trình này, mô tình hình công nghiệp, trình lặp lại với sáu mẻ bánh quy bột khác Bảng 1: Kết hợp asparaginase, nhiệt độ ủ thời gian chạy khác ba biến, ba cấp độ thiết kế tổng hợp trung ƣơng Phân tích acrylamide: Xác định Acrylamide thực theo phương pháp Anese et al (2009) Tóm lại, 1000 lít dung dịch nước dung dịch 2,3,3 [2H3] acrylamide (d3-acrylamide) (0,20 lg / ml) (Isotec, Sigma-Aldrich, Ý) theo tiêu chuẩn nội 15 ml nước Milli Q Millipore, Ý) thêm vào g bánh quy xay nhỏ xay thành ống ly tâm 100 ml Sau tách 600C 30 phút khuấy từ, hỗn hợp ly tâm 12 000vòng/phút 15 phút 40C (Beckman, Avanti Centrifyge J-25, Palo Alto, CA, USA) Lượng 10 ml dung dịch nước tinh khiết làm phương pháp SPE Isolute Env +, g (Biotage, Thụy Điển) Thể tích giải hấp phụ giảm xuống chân không, khoảng 1,5-2 ml cách sử dụng thiết bị bay quay nhiệt độ 800C lọc qua màng lọc 0,45 µm trước phân tích HPLC-MS LC-ESI-MS-MS, chế độ ion dương, phân tích thực máy đo quang phổ khối Finnigan LXQ (Thermo Electron Corporation, San Josè, CA, USA) kết hợp với máy dò LC Finnigan Surveyor Plus trang bị máy tự động lấy mẫu nhiệt lò nung nhiệt Cột phân tích Waters Spherisorb ODS2 (250 2.0 mm, µm) Tiệt trùng tiến hành tốc độ dòng chảy 0,1 ml / phút, điều kiện đẳng chế, 300C sử dụng pha động, pha với 98,9% nước, 1% methanol 0,1% axit formic (v / v / v) Toàn quét MS / MS thực cách chọn ion m / z 72 m / z 75 ion tiền thân acrylamide d3-acrylamide Diện tích đỉnh sắc ký ion chiết xuất m / z 55, chuyển tiếp 72> 55, m / z 58, chuyển tiếp 75> 58, sử dụng để phân tích định lượng Việc phân tích định lượng tiến hành theo phương pháp tiêu chuẩn nội Hệ số đáp ứng tương đối acrylamide d3-acrylamide tính hàng ngày cách phân tích dung dịch tiêu chuẩn Đối với lần chạy, phân tích thực sáu thí nghiệm nhân rộng Nồng độ Acrylamide biểu diễn ng / g chất khô Phân tích màu sắc: Phân tích màu sắc thực bề mặt mẫu sử dụng máy đo màu Tristimulus (Chromameter-2 Reflectance, Minolta, Osaka, Nhật Bản) trang bị đầu đo CR-300 Dụng cụ chuẩn hóa ngói trắng trước đo Màu sắc thể L * (độ sáng / độ tối), màu đỏ (đỏ / xanh) b * (màu vàng) / xanh xám) Sự thay đổi tổng màu không gian màu L *, a *, b *, DE *, sau tính từ Eq (1) (Clydesdale, 1978): ) ) ) ) ) Trong đó: L *, a *, b * giá trị màu thực tế L*0, a*0 b*0 giá trị màu cho mẫu kiểm soát, tức đạt asparaginase Đối với lần chạy, phân tích thực ba lần ba thí nghiệm nhân rộng Xác định hàm lƣợng chất rắn: Tổng hàm lượng chất rắn xác định phương pháp trọng lượng cách làm khô mẫu buồng chân không (1,32 kPa) 750C có trọng lượng không đổi Phƣơng trình đa thức phân tích thống kê: Mô hình hóa nhằm mô tả thay đổi nồng độ acrylamide liệu màu sắc hàm biến thiết kế tổng hợp trung ương Trong trường hợp phân tích acrylamide, biến mã hóa sử dụng để mô hình hóa thay đổi này: ̅ Trong đó: x biến giải thích bình thường ̅ giá trị trung bình biến ∆x khoảng giá trị cực đại cực tiểu x Các thư viện lme lme4 gói phần mềm R (R Development Core Team, 2009) sử dụng để phù hợp với mô hình hiệu ứng hỗn hợp với thành phần sau: Một thành phần hiệu ứng cố định bao gồm mô hình đa thức bậc hai với biến phụ thuộc Một thành phần hiệu ứng ngẫu nhiên có chứa tác động biến đổi hình thành acrylamide Kết biểu diễn theo: ∑ ∑ ) , ) Trong đó: B0 số Bi, Bii, Bij hệ số hồi quy mô hình xi xj biến độc lập với giá trị mã hoá Các vector b đại diện cho hiệu ứng ngẫu nhiên, nghĩa biến thể tính chất ngẫu nhiên gắn liền với ma trận mô hình Z với ma trận tương quan-hiệp phương sai E có chứa dự đoán ảnh hưởng đến thay đổi nồng độ acrylamide N biểu thị phân bố bình thường đa lượng Để xây dựng mô hình với số lượng tối thiểu thông số hiệu ứng cố định thủ tục sau thực hiện: Một mô hình đa thức bậc hai với tất hiệu ứng cố định xây dựng ý nghĩa tham số đa thức khảo sát (mô hình "đầy đủ") Giảm mô hình mà loại trừ điều khoản không quan trọng từ đa thức trang bị khả họ để dự đoán nồng độ acrylamide nghiên cứu so với mô hình đầy đủ thông qua thử nghiệm tỷ lệ log-likelihood (LRT) Xóa điều khoản khác mô hình tuyến tính theo dõi đạt mô hình với tập thông số cố định (p