Đánh giá bộ kit forenseq trên hệ thống miseq FGx ứng dụng trong định danh cá thể người việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Hồng Nhung ĐÁNH GIÁ BỘ KIT FORENSEQ TRÊN HỆ THỐNG MiSeq FGx ỨNG DỤNG TRONG ĐỊNH DANH CÁ THỂ NGƢỜI VIỆT NAM dẫNLUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Hồng Nhung ĐÁNH GIÁ BỘ KIT FORENSEQ TRÊN HỆ THỐNG MiSeq FGx ỨNG DỤNG TRONG ĐỊNH DANH CÁ THỂ NGƢỜI VIỆT NAM Chuyên ngành : Di truyền học Mã số: 60420121 dẫNLUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Cán hƣớng dẫn: TS Nguyễn Văn Sáng dẫn: TS Võhị Thươn Lan Hà Nội - 2016 Lời cảm ơn Để thực thành công khóa luận tốt nghiệp này, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Đại tá Hà Quốc Khanh nguyên Viện phó Viện Khoa học Hình với thầy Nguyễn Văn Sáng, người hướng dẫn, bảo tận tình suốt thời gian em thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến Thạc sĩ – Trung tá Trịnh Tuấn Toàn Thạc sĩ Nguyễn Quang Vinh, cán giám định viên Phòng giám định Sinh học Pháp lý, nhân viên công ty Cổ phần dịch vụ phân tích di truyền GENTIS, nhân viên công ty Cổ phẩn Khoa học Vật tư BIOMEDIC cung cấp mẫu trường, mẫu quần thể người Việt thông tin cần thiết tạo điều kiện thuận lợi cho em thực tốt đề tài Trong thời gian hoàn thành khóa luận, em nhận quan tâm, giúp đỡ động viên Đại tá Hà Quốc Khanh anh chị bạn Phòng Kỹ thuật Ứng dụng, thuộc công ty BIOMEDIC Em xin chân thành cảm ơn! Cuối em xin gửi lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè thân thiết động viên, bên cạnh em thời gian em thực khóa luận Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2016 Sinh viên Nguyễn Thị Hồng Nhung Luận văn cao học - 2016 Nguyễn Thị Hồng Nhung – K23CH KÝ HIỆU VÀ CHỮ CÁI VIẾT TẮT bp : base pair Cluster : Cụm khuếch đại ADN khuôn gắn bề mặt flowcell Mỗi cụm khuếch đại từ sợi ADN khuôn ban đầu có khoảng 1000 Mỗi cluster tạo trình tự đọc CODIS : Combined DNA Index System cs : cộng DNA : Deoxyribonucleic acid H2O : Nước kb : kilobase = 1000 bp Index : Là trình tự ADN tag gắn vào trình tự đích, cho phép kết hợp nhiều mẫu bể thư viện phân tách liệu sau hoàn thành lần chạy NGS : Next – Generation Sequencing PCR : Polymerase Chain Reaction STR : Short Tandem Repeats SNP : Single Nucleotide Polymorphism SBS : Sequencing by Synthesis stutter : Hiện tượng polymerase bị trượt xuất trình khuếch đại trình tự lặp lại, quy trình chuẩn bị thư viện, tạo cluster Có thể tạo đoạn ADN đích có kích thước bé lớn kích thước trình tự đích RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism Luận văn cao học - 2016 Nguyễn Thị Hồng Nhung – K23CH DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Các kit STRs thương mại phổ biến thị trường Bảng 1.2: So sánh thị STRs SNPs Bảng 3.1: Số alen quan sát STR SNP dải pha loãng đối chứng dương 2800M 28 Bảng 3.2: Kết thí nghiệm kit Identifiler Plus 29 Bảng 3.3: Kết thí nghiệm kit ForenSeq 30 Bảng 3.4: Nồng độ mẫu đo phương pháp qPCR 32 Bảng 3.5: Độ độ bao phủ alen locus khác 38 Bảng 3.6: Bảng khảo sát tần số SNPs quần thể người Việt Nam 38 Bảng 3.7: Tần suất xuất alen locus hệ ForenSeq 40 Bảng 3.8: Số lượng kiểu gen quan sát locus D4S2408 41 Bảng 3.9: Số lượng kiểu gen quan sát locus D6S1043 42 Bảng 3.10: Số lượng kiểu gen quan sát locus D9S1122 43 Bảng 3.11: Số lượng kiểu gen quan sát locus D17S1301 44 Bảng 3.12: Số lượng kiểu gen quan sát locus D20S482 44 Luận văn cao học - 2016 Nguyễn Thị Hồng Nhung – K23CH DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1: Hệ thống CODIS 13 STR loci vị trí nhiễm sắc thể Hình 1.2: Hình ảnh máy điện di mao quản 3130xl với 16 mao quản 11 Hình 1.3: Quy trình giải trình tự hệ Illumina 16 Hình 1.4: Bộ kit chuẩn bị thư viện ForenSeqTM DNA Signature Prep 17 Hình 2.1: Khái quát kit ForenSeqTM DNA Signature Prep 23 Hình 3.1: Số lượng đoạn đọc đại diện mẫu từ dải pha loãng 2800M 28 Hình 3.2: Phân biệt tượng isometric alen 31 Hình 3.3: Kết mẫu chất lượng hai phương pháp 33 Hình 3.4: Hồ sơ ADN hai mẫu cho nhận ngẫu nhiên 15/16 locus 34 Hình 3.5: Hồ sơ ADN hai mẫu A B thực ForenSeq 35 Hình 3.6: Hiện tượng isometric alen alen 29 locus D21S11 hai mẫu A B 36 Hình 3.7: Phân biệt alen kích thước khác trình tự mẫu lẫn 37 Luận văn cao học - 2016 Nguyễn Thị Hồng Nhung – K23CH MỤC LỤC Mở đầu Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử nghiên cứu thị ADN ứng dụng khoa học hình 1.2 Chỉ thị ADN sử dụng khoa học hình 1.2.1 STR – Short Tandem Repeats 1.2.2 SNP – Single Nucleotide Polymorphism 1.3 Các phƣơng pháp phân tích sử dụng thị ADN 1.3.1 Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (RFLP – Retriction Fragment Length Polymorphism) 1.3.2 Phương pháp PCR thị STRs 10 1.3.3 Điện di phát STRs 10 1.3.4 Giải trình tự hệ – Next Generation Sequencing (NGS) 11 1.4 Hệ thống giải trình tự hệ ILLUMINA – MiSeq FGx 14 1.4.1 Công nghệ giải trình tự Illumina 14 1.4.2 Giải pháp NGS cho linh vực hình Illumina 16 1.4.3 Tình hình thực tế Việt Nam 17 Chƣơng 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Nguyên liệu, hóa chất thiết bị 19 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.1.2 Hóa chất 19 2.1.3 Dụng cụ thí nghiệm 19 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 Luận văn cao học - 2016 Nguyễn Thị Hồng Nhung – K23CH 2.2.1 Tách chiết mẫu ADN chelex 20 2.2.2 Tách chiết mẫu ADN giấy FTA 20 2.2.3 Tinh mẫu ADN 21 2.2.4 Định lượng nồng độ ADN sau tách chiết 21 2.2.5 Chuẩn bị thư viện mẫu ADN cho giải trình tự hệ 22 2.2.6 Phương pháp giải trình tự hệ MiSeq FGx 24 2.2.7 Xử lý thống kê số liệu tính tần suất locus gen 24 2.3 Sơ đồ nghiên cứu 26 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Thông tin lần chạy máy MiSeq FGx 27 3.2 Đánh giá độ nhạy 27 3.3 Đánh giá độ tƣơng đồng 29 3.4 Đánh giá độ phân giải 31 3.5 Trƣờng hợp mẫu có chất lƣợng 32 3.6 Trƣờng hợp mẫu cho nhận ngẫu nhiên quần thể 33 3.7 Trƣờng hợp mẫu lẫn 36 3.8 Khảo sát tần suất iSNPs quần thể ngƣời Việt Nam (Kinh) 38 3.9 Khảo sát tần suất locus STR ForenSeq quần thể ngƣời Việt Nam (Kinh) 40 3.9.1 Locus D4S2408 41 3.9.2 Locus D6S1043 42 3.9.3 Locus D9S1122 43 3.9.4 Locus D17S1301 44 Luận văn cao học - 2016 3.9.5 Nguyễn Thị Hồng Nhung – K23CH Locus D20S482 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 Tài liệu tham khảo 48 Luận văn cao học - 2016 Nguyễn Thị Hồng Nhung – K23CH Mở đầu Từ Ray White lần mô tả thị ADN (DNA marker) dựa phương pháp đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphisms – RFLP) vào năm 1980 loạt thị ADN nghiên cứu ứng dụng di truyền học động vật nói chung di truyền người nói riêng Đến năm 1984, Alec J Jeffreys nghiên cứu phát thị minisatellite ông nhận thấy tính đa hình đoạn gen mã hóa cho myoglobin người Ông phát cá thể khác số lượng đoạn lặp khác hay gọi số lượng đa hình đoạn lặp (Variable Number of Tandem Repeat – VNTR) Từ đó, ông cộng phòng thí nghiệm liệt kê ứng dụng thị minisatellite Và ứng dụng quan trọng chị thị Jeffreys nghiên cứu sử dụng giám định ADN hình (DNA Forensic) để phân biệt người người khác Trong khoảng 15 năm phát triển, ứng dụng thị phân tử lĩnh vực hình có tiến vượt bậc đạt nhiều thành tựu Các quy trình xây dựng, hoàn thiện phổ biến sử dụng phân tích mẫu sinh học hình Theo ông Bruce Budowle – Cục điều tra Liên bang Mỹ, lĩnh vực hưởng lợi ích nhiều từ công cụ sinh học phân tử khoa học hình Với công nghệ ADN, nhà khoa học loại bỏ đối tượng tình nghi sai với mẫu thu nhận được, từ khoanh vùng, định hướng điều tra Những chứng phạm tội chứng mạnh mẽ để kết luận tội phạm Công nghệ giải trình tự phương pháp điện di mao quản tiêu chuẩn vàng để thực phân tích ADN hình Tuy nhiên, công nghệ bị giới hạn với khó khăn đặc thù mẫu án hình hàm lượng mẫu ít, độ đứt gãy cao, nhiều tạp chất, chí lẫn từ nhiều nguồn khác nhau,… Hệ thống giải trình tự hệ (Next Generation Sequencing – NGS) Illumina – Luận văn cao học - 2016 Nguyễn Thị Hồng Nhung – K23CH giúp khẳng định kết luận hai mẫu A B quan hệ huyết thống trực hệ Ngoài ra, nhược điểm phương pháp điện di mao quản độ phân giải không cao, gọi tên xác định alen dựa vào chiều dài Vì vậy, sâu phân tích trình tự alen giống hai mẫu 16 locus Identifiler Plus Điều đặc biệt nhận thấy locus D21S11 có tượng isometric alen, hai mẫu nghi ngờ có xuất alen 29 trình tự khác phát sử dụng phương pháp giải trình tự hệ Điều nói lên rằng: “Trong 16 locus Identifiler Plus, hai mẫu A B có 14 locus cho nhận Do loại bỏ trường hợp hai mẫu có quan hệ huyết thống trực hệ” Hình 3.6 Hiện tượng isometric alen alen 29 locus D21S11 hai mẫu A B 3.7 Trƣờng hợp mẫu lẫn 36 Luận văn cao học - 2016 Nguyễn Thị Hồng Nhung – K23CH Ứng dụng kit ForenSeqTM DNA Signature Prep hệ thống giải trình tự hệ MiSeq® FGx để giải trường hợp mẫu lẫn thu trường, thu kết mang hướng tích cực giúp định hướng trình điều tra Hệ thống MiSeq® FGx với phần mềm phân tích ForenSeq Universal Analysis Software tự động nhận biết mẫu có tượng lẫn từ nhiều nguồn Phần mềm tự động báo cho người sử dụng có tượng mẫu lẫn có lớn locus thị STR có lớn 10 locus thị SNPs có tượng thêm số lượng alen, cân Hình 3.7 Phân biệt alen kích thước khác trình tự mẫu lẫn Kết Hình 3.7, nhận thấy với độ phân giải cao, hệ thống MiSeq FGx phân biệt xác định mức độ đóng góp nguồn ADN khác dựa vào độ bao phủ alen xuất locus 37 Luận văn cao học - 2016 Nguyễn Thị Hồng Nhung – K23CH Bảng 3.5 Độ bao phủ alen locus khác Locus Alen Cường độ Trình tự 979 [ATCT]8 1404 ATCTATCT[ATCT]7 1506 ATCTGTCT[ATCT]7 10 920 [ATCT]10 13 1150 [AGAT]13 14 842 [AGAT]14 18 1141 [AGAT]18 19 641 [AGAT]19 D4S208 D6S1043 Kết Bảng 3.5 cho phân tích kỹ vào cường độ alen có mặt locus mẫu lẫn Từ giúp nhận định mẫu lẫn có nguồn đóng góp ADN khác Trong đó, nguồn ADN đóng góp có alen (8,10) locus D4S208 alen (14,19) locus D6S1043 Và nguồn ADN đóng góp lớn có alen (9,9) locus D4S208 alen (13,18) locus D6S1043 3.8 Khảo sát tần số SNPs quần thể ngƣời Việt Nam Chúng khảo sát tần số SNPs 104 mẫu quan hệ huyết thống Do chưa có công bố Việt Nam nghiên cứu tần số SNP quần thể người Việt Vì vậy, nghiên cứu khảo sát bước đầu ứng dụng SNP định danh cá thể người Việt Bảng 3.6 Bảng khảo sát tần số SNPs quần thể người Việt Nam Locus Kiểu gen Locus Kiểu gen rs1490413 G/A 0,41/0,59 rs737681 C/T rs560681 G/A 0,39/0,61 rs763869 C/T rs1294331 G/A 0,68/0,32 rs10092491 C/T Tần số 38 Kiểu gen Tần số 0,82/0,18 rs1821380 C/G 0,45/0,55 0,45/0,55 rs8037429 C/T 0,68/0,32 C/T 0,3/0,7 Tần số 0,6/0,4 Locus rs1528460 Luận văn cao học - 2016 Nguyễn Thị Hồng Nhung – K23CH rs10495407 G/A 0,62/0,38 rs2056277 C/T 0,84/0,16 rs729172 A/C 0,15/0,85 rs891700 G/A 0,52/0,48 rs4606077 C/T 0,71/0,29 rs2342747 G/A 0,74/0,26 rs1413212 G/A 0,58/0,42 rs1015250 C/G 0,45/0,55 rs430046 C/T 0,71/0,29 rs876724 C/T 0,63/0,37 rs7041158 C/T 0,65/0,35 rs1382387 G/T 0,3/0,7 rs1109037 G/A 0,57/0,43 rs1463729 G/A 0,52/0,48 rs9905977 G/A 0,6/0,4 rs993934 C/T 0,49/0,51 rs1360288 C/T 0,67/0,33 rs740910 G/A 0,06/0,94 rs12997453 G/A 0,66/0,34 rs10776839 G/T 0,59/0,41 rs938283 C/T 0,19/0,81 rs907100 C/G 0,55/0,45 rs826472 C/T 0,87/0,13 rs8078417 C/T 0,62/0,38 rs1357617 A/T 0,82/0,18 rs735155 G/A 0,15/0,85 rs1493232 A/C 0,38/0,62 rs4364205 G/T 0,57/0,43 rs3780962 C/T rs9951171 G/A 0,63/0,37 rs2399332 A/C 0,37/0,63 rs740598 G/A 0,49/0,51 rs1736442 G/A 0,58/0,42 rs1355366 G/A 0,13/0,87 rs964681 C/T 0,34/0,66 rs1024116 G/A 0,91/0,09 rs6444724 C/T 0,46/0,54 rs1498553 C/T 0,55/0,45 rs719366 C/T 0,32/0,68 rs2046361 A/T 0,57/0,43 rs901398 C/T 0,25/0,75 rs576261 A/C 0,57/0,43 rs279844 A/T 0,43/0,57 rs10488710 C/G 0,61/0,39 rs1031825 A/C 0,54/0,46 rs6811238 G/T 0,61/0,39 rs2076848 A/T 0,36/0,64 rs445251 C/G 0,4/0,6 rs1979255 C/G 0,5/0,5 rs2107612 G/A 0,17/0,83 rs1005533 G/A 0,71/0,29 rs717302 G/A 0,2/0,8 rs2269355 C/G 0,46/0,54 rs1523537 C/T 0,42/0,58 rs159606 G/A 0,67/0,33 rs2920816 C/T 0,31/0,69 rs722098 G/A 0,45/0,55 rs13182883 G/A 0,51/0,49 rs2111980 G/A 0,41/0,59 rs2830795 G/A 0,55/0,45 rs251934 C/T 0,14/0,86 rs10773760 G/A 0,32/0,68 rs2831700 G/A 0,55/0,45 rs338882 C/T 0,41/0,59 rs1335873 A/T 0,39/0,61 rs914165 G/A 0,76/0,24 rs13218440 G/A 0,58/0,42 rs1886510 C/T 0,87/0,13 rs221956 C/T 0,62/0,38 rs1336071 G/A 0,56/0,44 rs1058083 G/A 0,59/0,41 rs733164 G/A 0,82/0,18 rs214955 G/A 0,48/0,52 rs354439 A/T 0,43/0,57 rs987640 A/T 0,44/0,56 rs727811 A/C 0,63/0,37 rs1454361 A/T 0,57/0,43 rs2040411 G/A 0,7/0,3 rs6955448 C/T 0,69/0,31 rs722290 C/G 0,56/0,44 rs1028528 G/A 0,37/0,63 rs917118 C/T 0,76/0,24 rs873196 C/T 0,14/0,86 rs321198 C/T 0,62/0,38 rs4530059 G/A 0,72/0,28 39 0,6/0,4 Luận văn cao học - 2016 Nguyễn Thị Hồng Nhung – K23CH Từ kết khảo sát số SNP quần thể người Việt Nam, nhận thấy có locus rs740910 rs1024116 có tần số tương ứng G/A – 0,06/0,94 G/ - 0,91/0,09 có khả phân biệt nhận dạng cá thể cao Trong đó, theo khảo sát ban đầu, quần thể người Việt Nam locus rs1979255 có tần số alen quan sát 104 mẫu không quan hệ huyết thống 0,5/0,5 Điều locus rs1979255 ý nghĩa việc nhận dạng cá thể Khi so sánh tần số ban đầu khảo sát với kết nghiên cứu tần số 52 SNPs quần thể người Châu Phi, người Châu Á, người Châu Âu, người Thái Lan, người Đài Loan, người Trung Quốc người Nhật Bản, thấy quần thể người có tần số alen khác biệt [11] Các quần thể có khu vực phân bố tương đối gần (Thái, Nhật Bản, Đài Loan, Trung Quốc Việt Nam) có tần số alen tương đối soát có khác biệt rõ ràng với quần thể phân bố khu vực địa lý khác 3.9 Khảo sát tần suất locus STR ForenSeqTM DNA Signature Prep quần thể ngƣời Việt Nam (Kinh) Bảng 3.7 Tần suất xuất alen locus hệ ForenSeq Locus Alen D4S2408 D6S1043 D9S1122 D17S1301 D20S482 0.004808 0.004807692 0.115385 0.274038 0.038461538 10 0.4375 0.038834951 0.043269231 0.076923077 0.048077 11 0.129808 0.145631068 0.173076923 0.153846154 0.004808 12 0.033654 0.150485437 0.341346154 0.485576923 0.052885 12.3 13 0.389423077 0.004808 0.116504854 0.004807692 0.182692308 0.350962 14 0.126213592 0.038461538 0.048076923 0.375 15 0.029126214 0.004807692 0.009615385 0.144231 40 Luận văn cao học - 2016 Nguyễn Thị Hồng Nhung – K23CH 16 17 0.067961165 18 0.184466019 18.2 0.004854369 19 0.097087379 20 0.038834951 0.004807692 0.019231 0.004808 Quan sát đếm kiểu gen locus cá thể người Việt nghiên cứu khảo sát, thu số lượng kiểu gen sau 3.9.1 Locus D4S2408 Bảng 3.8 Số lượng kiểu gen quan sát locus D4S2408 Alen 10 11 12 13 0 0 15 0 26 17 12 1 0 0 10 11 12 13 - Trong tổng số 104 mẫu nghiên cứu có 27 cá thể có kiểu gen đồng hợp tử 87 cá thể có kiểu gen dị hợp tử - Tần số dị hợp tử quan sát (Hob) = 0,837 - Tần số dị hợp tử lý thuyết (Hexp) = 0,702 - Khả phân biệt (PD) = 0,859 - Kiểm định χ2 ta tính χ2 = 4,678195 - Khi tra bảng phân phối χ2 ứng với P=0,05 bậc tự ta tìm giá trị số χ2 = 7,82 41 Luận văn cao học - 2016 - Nguyễn Thị Hồng Nhung – K23CH Kết luận : trị số thực tế nhỏ trị số lý thuyết chứng tỏ số liệu quan sát lý thuyết trùng khớp nhau, nghĩa là, quần thể trạng thái cân H-W 3.9.2 Locus D6S1043 Bảng 3.9 Số lượng kiểu gen quan sát locus D6S1043 Alen 10 11 12 13 14 15 17 18 18.2 19 20 10 1 0 0 0 2 4 2 2 1 0 2 2 0 11 12 13 14 15 17 18 18.2 19 20 - Trong tổng số 103 mẫu nghiên cứu có 16 cá thể có kiểu gen đồng hợp tử 87 cá thể có kiểu gen dị hợp tử - Tần số dị hợp tử quan sát (Hob) = 0,84466 - Tần số dị hợp tử lý thuyết (Hexp) = 0,874682 - Khả phân biệt (PD) = 0,962579 - Kiểm định χ2 ta tính χ2 = 2,457501 - Khi tra bảng phân phối χ2 ứng với P=0,05 bậc tự ta tìm giá trị số χ2 = 7,82 42 Luận văn cao học - 2016 - Nguyễn Thị Hồng Nhung – K23CH Kết luận : trị số thực tế nhỏ trị số lý thuyết chứng tỏ số liệu quan sát lý thuyết trùng khớp nhau, nghĩa là, quần thể trạng thái cân H-W 3.9.3 Locus D9S1122 Bảng 3.10 Số lượng kiểu gen quan sát locus D9S1122 Alen 10 11 12 12.3 13 14 15 16 10 1 0 12 17 0 13 26 0 0 15 0 0 0 11 12 12.3 13 14 15 16 - Trong tổng số 104 mẫu nghiên cứu có 32 cá thể có kiểu gen đồng hợp tử 72 cá thể có kiểu gen dị hợp tử - Tần số dị hợp tử quan sát (Hob) = 0,69230 - Tần số dị hợp tử lý thuyết (Hexp) = 0,698456 - Khả phân biệt (PD) = 0,918639 - Kiểm định χ2 ta tính χ2 = 1,043 - Khi tra bảng phân phối χ2 ứng với P=0,05 bậc tự ta tìm giá trị số χ2 = 7,82 - Kết luận : trị số thực tế nhỏ trị số lý thuyết chứng tỏ số liệu quan sát lý thuyết trùng khớp nhau, nghĩa là, quần thể trạng thái cân H-W 43 Luận văn cao học - 2016 Nguyễn Thị Hồng Nhung – K23CH 3.9.4 Locus D17S1301 Bảng 3.11 Số lượng kiểu gen quan sát locus D17S1301 Alen 10 11 12 13 14 15 0 0 0 0 2 1 0 13 25 22 3 1 10 11 12 13 14 15 - Trong tổng số 104 mẫu nghiên cứu có 33 cá thể có kiểu gen đồng hợp tử 71 cá thể có kiểu gen dị hợp tử - Tần số dị hợp tử quan sát (Hob) = 0,682692 - Tần số dị hợp tử lý thuyết (Hexp) = 0,697347 - Khả phân biệt (PD) = 0,867049 - Kiểm định χ2 ta tính χ2 = 0,953249 - Khi tra bảng phân phối χ2 ứng với P=0,05 bậc tự ta tìm giá trị số χ2 = 3,84 - Kết luận : trị số thực tế nhỏ trị số lý thuyết chứng tỏ số liệu quan sát lý thuyết trùng khớp nhau, nghĩa là, quần thể trạng thái cân H-W 3.9.5 Locus D20S482 Bảng 3.12 Số lượng kiểu gen quan sát locus D20S482 Alen 10 11 12 13 14 15 16 17 10 0 0 0 0 11 44 Luận văn cao học - 2016 12 Nguyễn Thị Hồng Nhung – K23CH 13 0 16 26 10 12 14 1 0 14 15 16 17 - Trong tổng số 104 mẫu nghiên cứu có 29 cá thể có kiểu gen đồng hợp tử 75 cá thể có kiểu gen dị hợp tử - Tần số dị hợp tử quan sát (Hob) = 0,721154 - Tần số dị hợp tử lý thuyết (Hexp) = 0,709874 - Khả phân biệt (PD) = 0,87426 - Kiểm định χ2 ta tính χ2 = 2,89272 - Khi tra bảng phân phối χ2 ứng với P=0,05 bậc tự ta tìm giá trị số χ2 = 7,82 - Kết luận : trị số thực tế nhỏ trị số lý thuyết chứng tỏ số liệu quan sát lý thuyết trùng khớp nhau, nghĩa là, quần thể trạng thái cân H-W 45 Luận văn cao học - 2016 Nguyễn Thị Hồng Nhung – K23CH KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Với kết thu được, đưa kết luận sau: Kết hồ sơ ADN thu sử dụng kit ForenSeq TM DNA Signature Prep hoàn toàn có độ tương đồng với kết kit thương mại Identifiler Plus Trong nghiên cứu này, bước đầu đánh giá độ nhạy kit nồng độ thấp 50 pg khả phục hồi liệu ghi nhận 80,7% (với thị STR) 42,3% (với thị SNP) Bước đầu, áp dụng hệ thống MiSeq FGx kit ForenSeq vào trường hợp mẫu trường, mẫu khó mẫu lẫn thu nhận thông tin xác hơn, tin cậy hơn, giúp giám định viên có kết luận xác việc điều tra hình Khảo sát tần suất STR D4S2408, D6S1043, D9S1122, D17S1301 D20S482 bước đầu xây dựng bảng khảo sát tần suất 94 iSNP có ForenSeq quần thể người Việt Nam 46 Luận văn cao học - 2016 Nguyễn Thị Hồng Nhung – K23CH KIẾN NGHỊ Hướng nghiên cứu chúng tôi: Tăng số lượng mẫu nghiên cứu để tính toán tần suất SNP có tính đại diện người Việt Nam Ứng dụng mẫu án, thử nghiệm loại mẫu khó, bị đứt gãy nhiều touch ADN, mẫu dính đầu mẩu thuốc lá, mẫu xương,… Tính số PI thị STR SNP kit ForenSeq TM DNA Signature Prep 47 Luận văn cao học - 2016 Nguyễn Thị Hồng Nhung – K23CH Tài liệu tham khảo Tiếng Việt Nguyễn Văn Đức (2002), Phương pháp kiểm tra thống kê Sinh học, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà Nội Phạm Xuân Kiều (2005), Giáo trình Xác suất thống kê, NXB GD, Hà Nội Tiếng Anh Bentley D R (2006), “Whole-genome resequencing”, Current Opinion in Genetics & Development, 16 (6), pp 545-552 Buckleton J., Triggs C M., Walsh S J (2005), “Forensic DNA evidence interpretation”, CRC Press, USA Butler J M (2011), “Advanced Topics in Forensic DNA Typing: Methodology”, Academic Press, China Butler J M., Coble M D., Vallone P M (2007), “STRs vs SNPs: thought on the future of forensic DNA testing”, Forensic Sci Med Pathol, 3, pp 200-205 ILLUMINA (2015), ForenSeqTM DNA Signature Prep Reference Guide, Illumina, San Diego ILLUMINA (2015), MiSeq FGxTM Instrument Reference Guide, Illumina, San Diego ILLUMINA (2011), CASAVA v1.8.2 User Guide, Illumina, San Diego 10 Jennifer D C (2016), “Evaluation of the Illumina® Beta Version ForenSeqTM DNA Signature Prep Kit for use in genetic profiling”, Forensic Science International: Genetics, 20, pp 20-29 11 Juan J S (2006), “A multiplex assay with 52 single nucleotide polymorphisms for human identification”, Electrophoresis, 27, pp 17131724 48 Luận văn cao học - 2016 Nguyễn Thị Hồng Nhung – K23CH 12 Kobilinsky L., Levine L.; Margolis – Nunno H (2007), “Forensic DNA Analysis”, Chelsea House, USA 13 Mardis E R (2008), “The impact of nextgeneration sequencing technology on genetics”, Trends in Genetics, 24 (3), pp 133-141 14 Martin P D., Schmitter H., Schneider P.M (2001), “A brief history of the formation of DNA databases in forensic science within Europe”, Forensic Science International, 119 (2), pp 225-231 15 Patel J (2014), “Forensic Conception: DNA typing of FTA Spotted Samples”, Journal of Applied Biology & Biotechnology, 2(10), pp 021-029 16 Rothberg J M., Hinz W., Rearick T M., Schultz J et al (2011), “An integrated semiconductor device enabling non – optical genome sequencing”, Nature, 475 (7356), pp 348-352 17 Stefano C (2015), “MiSeq FGx sequencing system: A new platform for forensic genetics, Forensic Science International: Genetics Supplement Series 5, pp 98-100 18 Walsh P S (1991), “Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR – based typing from forensic material”, BioTechniques,10(4), pp 506-513 19 Wing Kam Fung, Yue – Qing Hu (2008), Statistical DNA Forensic: Theory, Methods and Computation, John Wiley & Sons, Hong Kong 20 Yang Y., Xie B., Yan (2014), “Application of Next – Generation Sequencing Technology in Forensic Science”, Genomicis Proteomics Bioinformatics, 12 (5), pp 190-197 21 Zagorski N (2006), “Profile of Alec J Jeffreys”, PNAS, 103 (24), pp 89188920 22 http://www.illumina.com/documents/products/techspotlights/techspotlight_s equencing.pdf 49 Luận văn cao học - 2016 Nguyễn Thị Hồng Nhung – K23CH 23 http://www.illumina.com/content/dam/illuminamarketing/documents/products/datasheets/miseq-fgx-system-spec-sheet1470-2014-004.pdf 50 ... MiSeq FGx giới Vì vậy, thực đề tài: Đánh giá kit ForenSeq hệ thống MiSeq FGx ứng dụng định danh cá thể ngƣời Việt Nam Trước đây, chưa có nghiên cứu đánh giá khả ứng dụng hệ thống MiSeq FGx phân... cài đặt hệ thống máy MiSeq FGx Illumina Để đánh giá thực tế lợi máy MiSeq FGx mang lại, tiến hành đề tài: Đánh giá kit ForenSeq hệ thống MiSeq FGx ứng dụng định danh cá thể ngƣời Việt Nam Đề... Hồng Nhung ĐÁNH GIÁ BỘ KIT FORENSEQ TRÊN HỆ THỐNG MiSeq FGx ỨNG DỤNG TRONG ĐỊNH DANH CÁ THỂ NGƢỜI VIỆT NAM Chuyên ngành : Di truyền học Mã số: 60420121 dẫNLUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Cán hƣớng dẫn: