Khóa luận biểu hiện β xylosidase

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC oOo PHẠM HẢI NHƯ NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA XYLAN 1,4-β-XYLOSIDASE TRONG ESCHERICHIA COLI Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ quy Ngành Công nghệ Sinh học Hệ đào tạo chuẩn Hà Nội - 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC oOo PHẠM HẢI NHƯ NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA XYLAN 1,4-β-XYLOSIDASE TRONG ESCHERICHIA COLI Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ quy Ngành Công nghệ Sinh học Hệ đào tạo chuẩn Cán hướng dẫn: TS Đỗ Thị Huyền Đồng hướng dẫn: TS Đinh Nho Thái Hà Nội - 2016 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đỗ Thị Huyền, Trưởng phòng Kỹ thuật Di truyền, Viện Công nghệ sinh học, người hướng dẫn quan tâm, giúp đỡ, tận tình bảo tạo điều kiện cho hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Với tình cảm chân thành, xin cảm ơn bảo giúp đỡ toàn thể cán phòng Kỹ thuật Di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, đặc biệt NCS Nguyễn Minh Giang, KS Nguyễn Thị Minh Thu, người hướng dẫn, hỗ trợ bảo nhiệt tình chuyên môn kĩ suốt trình thực tập hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến TS Đinh Nho Thái, Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội toàn thể thầy cô Khoa Sinh học truyền đạt cho kiến thức quý báu tạo điều kiện thuận lợi cho suốt bốn năm học tập trường Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình bạn bè chia sẻ, động viên suốt trình học tập hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 30 tháng năm 2016 Sinh viên Phạm Hải Như CÁC TỪ VIẾT TẮT APS Ammonium persulfate Bp Base pair DNA Deoxyribonucleic acid dH2O Nước khử ion E coli Escheriachia coli EtBr Ethydium bromide ETDA Axit etylen diamin tetra acetic IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Kb Kilo base LB Luria-bertani OD Optical density ORF Opean Reading Frame – Khung đọc mở RNA Ribonucleic acid SDS Sodium dodexyl dulfate TAE Tris acetate EDTA TEMED Tetramethylethylenediamine pNPX p-nitropheny-β-xylopyranoside Gen xbx Gen mã hóa cho xylan 1,4-β-xylosidase, có nguồn gốc từ vi sinh vật cộng sinh ruột mối Coptotermes gestroi pET22xbx Vector biểu pET22b(+) gắn gen xylan 1,4-βxylosidase có nguồn gốc từ vi khuẩn cộng sinh ruột mối MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương xylan 1,4-β-xylosidase 1.1.1 Phân giải sinh khối thực vật 1.1.1.1 Thành phần sinh khối thực vật .3 1.1.1.2 Enzym phân giải sinh khối thực vật 1.1.2 Nguồn thu nhận xylan 1,4-β-xylosidase tự nhiên .5 1.1.3 Phân loại xylan 1,4-β-xylosidase 1.1.3.1 Cấu trúc enzym .6 1.1.3.2 Mô hình hoạt động thủy phân 1.1.4 Hoạt tính xylan 1,4-β-xylosidase 1.1.5 Ứng dụng xylan 1,4-β-xylosidase 1.2 Đại cương biểu gen 1.2.1 Hệ biểu gen E coli 1.2.1.1 Chủng tách dòng E coli DH10B 1.2.1.2 Chủng biểu E coli BL21 (DE3) 1.2.1.3 Chủng biểu E coli SoluBL21 (DE3) 10 1.2.1.4 Chủng biểu E coli Rosetta (DE3) .10 1.2.1.5 Chủng biểu E coli JM109 (DE3) .10 1.2.2 Vector biểu 11 1.2.3 Vector biểu pET22b(+) 13 1.2.3 Vector biểu pET22xbx 13 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 14 2.1 Vật liệu 14 2.1.1 Chủng vi sinh vật plasmid 14 2.1.2 Môi trường nuôi cấy 14 2.1.3 Hóa chất dung dịch sử dụng 14 2.1.4 Các thiết bị sử dụng 16 2.2 Phương pháp nghiên cứu 16 2.2.1 Tách DNA plasmid từ E coli .16 2.2.2 Điện di gel agarose 18 2.2.3 Xử lý DNA plasmid enzym cắt hạn chế 19 2.2.4 Biến nạp plasmid vào tế bào E coli sốc nhiệt 20 2.2.5 Biểu gen xbx tế bào E coli 21 2.2.6 Điện di protein gel polyacrylamide - SDS 22 2.2.7 Thử hoạt tính xylan 1,4-β-xylosidase 24 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Kiểm tra có mặt gen xbx vector tái tổ hợp pET22xbx 26 3.1.1 Biến nạp pET22xbx vào E coli DH10B để nhân dòng 26 3.1.2 Tách DNA plasmid từ dòng E coli DH10B ngẫu nhiên 26 3.1.3 Kiểm tra dòng plasmid tách enzym cắt hạn chế 27 3.2 Biểu gen xbx 29 2.2.1 Khảo sát chủng biểu 30 2.2.2 Kiểm tra hoạt tính xylan 1,4-β-xylosidase biểu .33 2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ 33 2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng IPTG 35 2.2.5 Khảo sát thời gian thu mẫu .37 KẾT LUẬN 40 ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 DANH MỤC HÌNH Hình Vị trí tác dụng enzym xylan .4 Hình Cơ chế giữ nguyên cấu hình vòng sau thủy phân glycoside hydrolase Hình Cơ chế nghịch chuyển cấu hình vòng sau thủy phân glycoside hydrolase Hình Vị trí cắt xylan 1,4-β-xylosidase chuỗi xylan Hình Xylan 1,4-β-xylosidase thủy phân (1,4)-β-D-xylans Hình Cấu trúc vector pET-22b(+) .12 Hình Trình tự ORF GL0112518 trình tự axit amin mà ORF mã hóa 13 Hình Cấu trúc phân tử p-nitropheny-β-xylopyranoside (pNPX) 24 Hình Các dòng E coli DH10B biến nạp với plasmid pET22xbx cấy trải đĩa LBA 26 Hình 10 Điện di đồ kiểm tra DNA plasmid từ dòng E coli DH10B tái tổ hợp 27 Hình 11 Vị trí cắt enzym HincII, XhoI NcoI vector pET22xbx 28 Hình 12 Điện di đồ kiểm tra sản phẩm kết cắt plasmid tái tổ hợp enzym XhoI + NcoI HincII 28 Hình 13 Điện di đồ kiểm tra biểu gen xbx tế bào biểu E coli Rosetta, JM109, BL21 SoluBL21 gel polyacrylamide 12,6% 30 Hình 14 Biểu đồ mô tả giá trị OD 600 thời điểm thu mẫu chủng biểu 31 Hình 15 Điện di đồ kiểm tra tính tan xylan 1,4-β-xylosidase E coli BL21 E coli Rosetta gel polyacrylamide 12,6% .32 Hình 16 Kết thử hoạt tính xylan 1,4-β-xylosidase biểu 33 Hình 17 Điện di đồ kiểm tra biểu gen xbx tế bào E coli Rosetta, biểu nhiệt độ khác nhau, gel polyacrylamide 12,6% 34 Hình 18 Biểu đồ mô tả giá trị OD 600 thu mẫu dòng biểu nhiệt độ khác 35 Hình 19 Điện di đồ kiểm tra biểu gen xbx tế bào E coli Rosetta, cảm ứng nồng độ IPTG khác nhau, gel polyacrylamide 12,6% 36 Hình 20 Biểu đồ mô tả giá trị OD 600 thu mẫu dòng cảm ứng với nồng độ IPTG khác .37 Hình 21 Điện di đồ kiểm tra biểu củaa gen xbx theo thời gian thu mẫu, tế bào E coli Rosetta (DE3) gel polyacrylamide 12,6% 38 Hình 22 Biểu đồ mô tả giá trị OD600 thu mẫu dòng biểu thời gian thu mẫu khác 38 MỞ ĐẦU Sinh khối thực vật nguồn nguyên liệu tái tạo có nhiều tiềm sử dụng Cùng với phát triển khoa học kỹ thuật, nguồn sinh khối này, đặc biệt sinh khối phế phụ phẩm nông nghiệp ngày tận dụng có hiệu để chuyển hóa thành sản phẩm ứng dụng vào thực tiễn sống, đó, phải kể đến ứng dụng chế biến thức ăn chăn nuôi, sản xuất giấy, sợi, hóa chất tái chế rác thải thành lượng sinh học [10] Đứng trước thực trạng cạn kiệt dần tài nguyên yêu cầu bảo vệ môi trường để phát triển bền vững, việc tận dụng sinh khối thực vật đề cao hết, đặc biệt nước nông nghiệp Việt Nam Việc sử dụng hữu hiệu sinh khối thực vật phụ thuộc chủ yếu vào khả chuyển hóa hiệu kinh tế polyme chúng thành monome Để giải toán này, sau bước phân giải vật lý, hóa học, nhóm enzym thủy phân lignocellulose áp dụng để chuyển hóa sinh khối thành đường đơn Tuy nhiên thời điểm tại, giá thành sản phẩm từ phế phụ phẩm nông nghiệp cao, chưa thể cạnh tranh nguyên nhân nguồn enzym chưa thực thủy phân nhanh chóng hiệu sinh khối thành đường Vì vậy, năm gần đây, nhà nghiên cứu nước tìm cách để thu enzym có hoạt tính mạnh có tốc độ chuyển hóa nhanh sinh khối thành đường theo ba hướng chính: (1) phân lập, sàng lọc chủng tự nhiên sinh enzym có hoạt tính tốt Đây phương pháp truyền thống nhiều phòng thí nghiệm giới tiến hành thu nhiều kết khả quan; (2) tìm kiếm, phân lập gen mã hóa enzym thủy phân lignocellulose từ vi sinh vật kỹ thuật Metagenomics Hướng cho phép nhà sinh học khai thác gen quý từ vi sinh vật không nuôi cấy vốn chiếm 99-99,9% vi sinh vật có môi trường sinh thái; (3) Gây đột biến định hướng số gen mã hóa enzym nghiên cứu để làm tăng hoạt tính enzym Trong số enzym tham gia chuyển hóa sinh khối, xylan 1,4-β-xylosidase enzym chìa khóa Enzym có khả cắt (1,4)-β-D- xylan từ đầu không khử để giải phóng gốc đường D-xylose [3] Xylan 1,4-βxylosidase có mặt động vật, thực vật, vi khuẩn, nấm Tuy nhiên, vi sinh vật cung cấp lượng lớn xylan 1,4-β-xylosidase đáp ứng cho sản xuất, đem lại giá trị thương mại cao Do đó, xylan 1,4-β-xylosidase có nguồn gốc vi sinh vật đối tượng nhiên cứu ứng dụng nhiều sản xuất Từ năm 2012, phòng Kỹ thuật di truyền sử dụng kỹ thuật Metagenomics để phân tích toàn DNA đa hệ gen vi sinh vật ruột mối Coptotermes gestroi Trong số 125431 ORFs thu được, phần mềm tin sinh học, 41 ORFs ước đoán mã hóa cho enzym xylan 1,4-β-xylosidase Bằng mẫu dò phòng Kỹ thuật di truyền thiết kế, gen mang mã số GL0112518 mã hóa xylan 1,4-β-xylosidase lựa chọn cho nghiên cứu biểu hiện, tinh chế đánh giá đặc điểm enzym - bước khởi đầu cho nghiên cứu ứng dụng enzyme vào giải vấn đề thực tiễn Khóa luận “Biểu gen mã hóa xylan 1,4-β-xylosidase chủng Escherichia coli” phần nhỏ nghiên cứu Các thí nghiệm tiến hành phòng Kỹ thuật di truyền – Viện Công nghệ sinh học Thời gian thực khóa luận từ tháng 8/2015 đến tháng 5/2016 Mục tiêu đề tài biểu thành công gen mã hóa xylan 1,4-β-xylosidase tế bào vi khuẩn E coli , tạo sở cho việc nghiên cứu sản xuất enzym phân giải sinh khối thực vật 3.2.1 Khảo sát chủng biểu Chủng biểu máy tổng hợp nên protein tái tổ hợp Chúng đóng vai trò định đến khả năng, chất lượng biểu gen mong muốn Do đó, chọn chủng biểu phổ biến E coli BL21; biến thể E coli cải biến để tăng khả tổng hợp protein ngoại lai dạng tan có hoạt tính sinh học chủng Rosetta, JM109 SoluBL21 để thử nghiệm biểu gen Sau chủng có khả biểu xylan 1,4-β-xylosidase tốt lựa chọn cho nghiên cứu Sau nuôi cấy 37oC để OD600 đạt 0,4-0,6, mẫu chia thành hai phần Một phần cảm ứng với IPTG mM phần không cảm ứng nuôi cấy tiếp 25oC 8h Dung dịch nuôi cấy sau biểu ly tâm 6000 vòng/phút, phút để thu tế bào, sau sinh khối tế bào đưa OD 600 = 10 dH2O để tiện so sánh khả biểu gen chủng gel điện di Trong thí nghiệm này, dịch tế bào sau xử lý trực tiếp với đệm xử lý mẫu (sample buffer) (đã đề cập phần “2.1.3 Hóa chất dung dịch sử dụng”) để kiểm tra có mặt xylan 1,4-β-xylosidase protein tổng số điện di gel polyacrylamide 12,6% Rosetta kDa 1- 1+ 2- 2+ 3- JM109 3+ 1- 1+ 2- 2+ M 3- 3+ BL21 1- 1+ 2- 2+ 3- SoluBL21 3+ 1- 1+ 2- 2+ 3- 3+ 116.0 66 45 35 25 xbx (≈40kDa) 18 14 Hình 13 Điện di đồ kiểm tra biểu gen xbx tế bào biểu E coli Rosetta, JM109, BL21 SoluBL21 gel polyacrylamide 12,6% M: Thang protein chuẩn (Fermentas) 1-, 2-, 3- : Dòng không cảm ứng IPTG (đối chứng) 1+, 2+, 3+: Dòng cảm ứng 1mM IPTG 36 Từ kết hình 13, thấy mẫu cảm ứng không cảm ứng IPTG chủng E coli SoluBL21 cho protein Do đó, kết luận chủng không khả biểu gen xbx Xylan 1,4-β-xylosidase bị protease nội bào cắt bỏ, không tồn đến 4h sau cho biểu Nhưng chủng Rosetta, BL21 có đột biến protease (lon, ompT) giống với SoluBL21 lại biểu tốt xylan 1,4-β-xylosidase; nên có khả xylan 1,4-βxylosidase không biểu SoluBL21 lớn khả enzym biểu bị protease cắt Ở mẫu cảm ứng chủng E coli Rosetta, JM109 BL21 xuất băng protein khác với mẫu không cảm ứng Băng lại có kích thước xấp xỉ kích thước dự đoán xylan 1,4-β-xylosidase khoảng 39 kDa Do đó, kết luận ba chủng E coli kể có khả biểu gen xbx Hình 14 Biểu đồ mô tả giá trị OD600 thời điểm thu mẫu chủng biểu Từ ảnh điện di hình 13 kết OD 600 thu mẫu chủng, nhận thấy E coli Rosetta BL21 có khả biểu protein xylan 1,4-βxylosidase tốt Bởi chủng cho lượng sinh khối thu (được đánh giá thông qua giá trị OD 600 thu mẫu) hàm lượng protein biểu (kích thước băng protein điện di) lớn Vì vậy, định xử lý tế bào biểu hai chủng phương pháp siêu âm, ly tâm để thu protein tan pha protein không tan tủa Dịch protein tổng số, tan, không tan điện di gel polyacrylamide 12,6% để kiểm tra tính tan xylan 1,4-β-xylosidase tái tổ hợp 37 Rosetta M (-) TS Tan Tủa (-) BL21 TS Tan Tủa kDa 116 66.2 45 35 xbx (≈40kDa) 25 18.4 14.4 Hình 15 Điện di đồ kiểm tra tính tan xylan 1,4-β-xylosidase E coli BL21 E coli Rosetta gel polyacrylamide 12,6% M: Thang protein chuẩn (Fermentas) (-): Dòng không cảm ứng IPTG TS: Protein tổng số, thu mẫu siêu âm Tan: Protein tan, thu pha sau ly tâm mẫu siêu âm Tủa: Protein tủa, thu tủa sau ly tâm mẫu siêu âm Kết điện di trình bày hình 15 cho thấy, protein pha tan, pha tủa E coli Rosetta chứa enzym xylan 1,4-β-xylosidase thước khoảng 39 kDa (khác với dòng đối chứng (-) dòng không cảm ứng IPTG) Còn E coli BL21, protein xylan 1,4-β-xylosidase biểu hiện, xong tồn dạng không tan – dạng không mong muốn Với thí nghiệm biểu enzym, dạng enzym biểu mong muốn dạng tan Do dạng tan, khả protein cuộn xoắn cấu trúc cao hơn, vùng trung tâm hoạt tính có khả cuộn xoắn xác Tuy xylan 1,4-βxylosidase biểu được, chủ yếu dạng không tan, phần nhỏ (dưới 10%) enzym biểu dạng tan Do đó, tiến hành thử hoạt 38 tính protein tái tổ hợp biểu chất pNPX, để định hướng nghiên cứu 3.2.2 Kiểm tra hoạt tính xylan 1,4-β-xylosidase biểu Kết thử hoạt tính cho thấy, mẫu xylan 1,4-β-xylosidase dạng tan thu được, ủ với chất pNPX 37 oC giờ, chuyển sang màu vàng đặc trưng dung dịch chứa nitrophenyl Trong mẫu đối chứng (ĐC1) có thành phần (cơ chất pNPX, đệm, xylan 1,4-β-xylosidase) ủ riêng rẽ 37oC tương tự mẫu kiểm tra hoạt tính trộn vào với trước ngừng phản ứng enzym giữ nguyên màu trắng Kết tương tự ghi nhận mẫu đối chứng (ĐC2), mẫu thực với điều kiện giống mẫu XBX, enzym xylan 1,4-β-xylosidase thay protein thu từ dòng mang pET22 (đối chứng) Hình 16 Kết thử hoạt tính xylan 1,4-β-xylosidase biểu Ống ĐC1 : Ống chứa enzym xylan 1,4-β-xylosidase ủ riêng rẽ trộn với chất ủ riêng trước ngừng phản ứng Ống XBX : Ống chứa enzym xylan 1,4-β-xylosidase ủ chung chất Ống ĐC2 : Ống chứa protein thu từ dòng mang pET22 (đối chứng) Bởi vậy, kết luận hỗn hợp dung dịch thử hoạt tính (cơ chất pNPX, đệm, protein khác dung dịch enzym xylan 1,4-β-xylosidase thô) không tạo màu vàng dung dịch Sự đổi màu từ trắng sang vàng dung dịch hoạt động enzym xylan 1,4-β-xylosidase Khi enzym cắt liên kết β(1→4) glycoside pNPX, nitrophenyl giải phóng môi trường, tạo màu vàng đặc trưng nitrophenyl 39 Với mong muốn biểu lượng xylan 1,4-β-xylosidase dạng tan lớn Chúng tiến hành khảo sát thêm điều kiện ảnh hưởng đến chất lượng biểu hiện, IPTG, nhiệt độ thời gian thu mẫu 3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ Nhiệt độ yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới sinh trưởng vi sinh vật Trong giới hạn chịu nhiệt vi khuẩn, nhiệt độ nuôi cấy thay đổi (tăng hay giảm) làm cho chuyển động phân tử tế bào thay đổi theo (tăng hay giảm), làm thay đổi tốc độ phản ứng hóa sinh trình trao đổi chất tế bào phản ứng tổng hợp protein Vì vậy, tiến hành nuôi cấy biểu chủng E coli Rosetta mang plasmid tái tổ hợp pET22xbx nhiệt độ khác là: 16 oC, 20oC, 28oC, 37oC để xác định nhiệt độ tối ưu, thu lượng xylan 1,4-β-xylosidase tái tổ hợp nhiều Sau ngày nuôi cấy với IPTG mM, phần dịch nuôi cấy giữ lại để kiểm tra protein tổng số Phần tế bào lại thu lại cách ly tâm 6000 vòng/phút 10 phút Tiếp theo, tế bào xử lý phương pháp siêu âm để thu protein pha tan protein pha không tan tủa lại Dịch protein tổng số, tan, không tan thu điện di gel polyacrylamide 12,6% để kiểm tra có mặt xylan 1,4-β-xylosidase tái tổ hợp (-) 16oC 20oC TS Tan Tủa TS Tan Tủa 28oC TS Tan Tủa 37oC TS Tan Tủa M kDa 116.0 66.2 45 xbx (≈40kDa) 35 25 18 14 Hình 17 Điện di đồ kiểm tra biểu gen xbx tế bào E coli Rosetta, biểu nhiệt độ khác nhau, gel polyacrylamide 12,6% 40 M: Thang protein chuẩn (Fermentas) (-): Dòng chứa pET22 (đối chứng) TS: Protein tổng số, thu mẫu siêu âm Tan: Protein tan, thu pha sau ly tâm mẫu siêu âm Tủa: Protein tủa, thu tủa sau ly tâm mẫu siêu âm Quan sát điện di, nhận thấy dịch protein tổng số tất nhiệt độ, xuất băng protein có kích thước tương với kích thước lý thuyết xylan 1,4-β-xylosidase (≈39 kDa) khác với dòng đối chứng Điều chứng tỏ xylan 1,4-β-xylosidase biểu hành công nhiệt độ Tuy nhiên, có protein pha tan tổng hợp nhiệt độ 16 oC 20oC xuất băng protein xylan 1,4-β-xylosidase (≈39 kDa) Do đó, kết luận, 28oC 37oC, xylan 1,4-β-xylosidase biểu dạng không tan Dạng tan xylan 1,4-β-xylosidase biểu thành công 16 oC 20oC, với mức tan 30% Bên cạnh đó, sinh khối thu (đánh giá dựa giá trị OD 600 thu mẫu) 20oC lớn hơn, đồng nghĩa với hàm lượng protein thu lớn Nên nhận định 20oC nhiệt độ thích hợp cho thí nghiệm biểu xylan 1,4β-xylosidase, định thực thí nghiệm biểu sau nhiệt độ Hình 18 Biểu đồ mô tả giá trị OD600 thu mẫu dòng biểu nhiệt độ khác Để giải thích cho kết này, đề xuất nhiệt độ cao dẫn tới mức độ tổng hợp protein nhanh vi khuẩn Điều khiến cho xylan 1,4β-xylosidase tái tổ hợp đủ thời gian để hoàn thiện cải biến sau dịch mã gấp, đóng xoắn; làm giảm tính tan protein 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng IPTG 41 IPTG chất cảm ứng cho hoạt động gen xbx điều khiển promoter T7 vector pET22xbx Đây chất cảm ứng đắt tiền ảnh hướng lớn đến mức độ biểu gen xbx, nên tiến hành khảo sát để tìm nồng độ IPTG tối ưu cho thí nghiệm biểu gen xbx E coli Rosetta Mười ba nồng độ IPTG khác tiến hành khảo sát là: mM; 0,05 mM; 0,2 mM; 0,4 mM; 0,6 mM; 0,8 mM; mM; 1,2 mM; 1,4 mM; 1,6 mM; 1,8 mM; mM; 2,5 mM mM Chủng E coli Rosetta tái tổ hợp nuôi cấy điều kiện 20oC, lắc 200 vòng/phút Sau ngày nuôi cấy, phần dịch nuôi cấy giữ lại để kiểm tra protein tổng số Dịch protein tổng số thu điện di gel polyacrylamide 12,6% để kiểm tra sinh khối đạt được, biểu xylan 1,4-β-xylosidase Nồng độ IPTG (mM) kDa M 0,05 0,2 0,4 0,6 0,8 1,2 1,4 1,6 1,8 2,5 116.0 66 45 35 xbx (≈40kDa) 25 18 14 Hình 19 Điện di đồ kiểm tra biểu gen xbx tế bào E coli Rosetta, cảm ứng nồng độ IPTG khác nhau, gel polyacrylamide 12,6% M: Thang protein chuẩn (Fermentas) 0; 0,05; … 2,5; 3: Tương ứng với dòng E coli Rosetta mang gen xbx tái tổ hợp, biểu nồng độ IPTG khác Từ kết hình 19, thấy rằng, thể biến nạp E.coli Rosetta mang gen xbx Khi cảm ứng IPTG, E.coli Rosetta có khả tổng hợp protein có kích thước khoảng 39 kDa tương đương với kích thước lý thuyết xylan 1,4-β-xylosidase 42 Quan sát đường chạy - dòng đối chứng không cảm ứng IPTG, nhận thấy có băng protein tương đương với kích thước lý thuyết xylan 1,4-βxylosidase (≈39 kDa), giống với dòng có cảm ứng IPTG Tuy nhiên băng có kích thước nhỏ so với băng dòng có cảm ứng IPTG Hàm lượng xylan 1,4β-xylosidase tổng hợp nồng độ IPTG khác tương đương Nhìn vào biểu đồ sinh trưởng dòng tế bào nuôi cấy với nồng độ IPTG khác nhận thấy, sau cảm ứng IPTG sinh khối tế bào bị sụt giảm nghiêm trọng Ngay với nồng độ IPTG thấp, 0,05 mM, sinh khối tế bào giảm gần nửa Điều chứng tỏ biểu gen làm ảnh hưởng tới trình trao đổi chất chủng chủ Tuy nhiên, tăng nồng độ chất cảm ứng sinh khối tế bào không tiếp tục giảm, đồng thời khả sinh tổng hợp enzym tái tổ hợp trì tương tự cảm ứng với mức IPTG thấp Nhìn ảnh điện di (hình 19), dòng cảm ứng với nồng độ IPTG 0,6 mM cho băng protein tái tổ hợp có kích thước lớn chút so với dòng khác Bởi vậy, lựa chọn nồng độ IPTG 0,6 mM cho thí nghiệm biểu xylan 1,4-β-xylosidase, định sử dụng nồng độ cho thí nghiệm biểu sau Hình 20 Biểu đồ mô tả giá trị OD600 thu mẫu dòng cảm ứng với nồng độ IPTG khác 3.2.5 Khảo sát thời gian thu mẫu Thời gian cảm ứng có liên quan chặt chẽ đến số lượng chất lượng protein tái tổ hợp biểu Thông thường, thời gian dài, hàm lượng 43 protein tái tổ hợp tổng hợp nhiều Song, thời gian dài chất dinh dưỡng môi trường bị cạn kiệt, trình tổng hợp protein bị hạn chế protein tái tổ hợp bị cắt protease nội bào Do đó, tiến hành khảo sát thời điểm thu mẫu khác là: 12h, 18h, 36h, 48h, với nồng độ IPTG 0,6mM, 20 oC Dịch protein tổng số thu nhận điện di gel polyacrylamide 12,6%, để kiểm tra mức độ biểu xylan 1,4-β-xylosidase (-) kDa 12h TS Tan Tủa 18h TS Tan Tủa 36h TS Tan Tủa 48h TS M Tan Tủa 116.0 66 45 xbx (≈40kDa) 35 25 18 14 Hình 21 Điện di đồ kiểm tra biểu gen xbx theo thời gian thu mẫu, tế bào E coli Rosetta (DE3) gel polyacrylamide 12,6% M: Thang protein chuẩn (Fermentas) (-): Dòng chứa pET22 (đối chứng) TS: Protein tổng số, thu mẫu siêu âm Tan: Protein tan, thu pha sau ly tâm mẫu siêu âm Tủa: Protein tủa, thu tủa sau ly tâm mẫu siêu âm Quan sát điện di, nhận thấy đường chạy tất thu mẫu, xuất băng protein có kích thước tương với kích thước lý thuyết xylan 1,4-β-xylosidase (≈39 kDa) khác với dòng đối không mang gen xbx Điều chứng tỏ xylan 1,4-β-xylosidase biểu khoảng 12-48h nuôi cấy 20oC, với nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,6mM 44 Hình 22 Biểu đồ mô tả giá trị OD600 thu mẫu dòng biểu thời gian thu mẫu khác Theo quan sát điện di, nhận thấy băng protein xylan 1,4-βxylosidase thời điểm thu mẫu khác Song, sinh khối thu (đánh giá dựa giá trị OD 600 thu mẫu) 48h lớn nhất, đồng nghĩa với việc hàm lượng protein tái tổ hợp thu lớn Do đó, định chọn 48h thời gian thu mẫu thích hợp 45 KẾT LUẬN Gen xbx có nguồn gốc từ vi sinh ruột mối, mã hóa xylan 1,4-β-xylosidase biểu thành công dạng tan tế bào E coli Rosetta (DE3) Enzym xylan 1,4-β-xylosidase tái tổ hợp có hoạt tính sinh học, có khả phân cắt liên kết β(1→4) glycoside chất pNPX (tương tự với liên kết mà xylan 1,4-β-xylosidase có khả cắt mạch xylan) Điều kiện thích hợp cho việc biểu XBX chủng E coli Rosetta (DE3) là: nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,6 mM, 20oC, ngày 46 ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU Để đạt lượng xylan 1,4-β-xylosidase dạng tan lớn hơn, đề xuất khảo sát thêm điều kiện ảnh hưởng đến biểu là: môi trường nuôi cấy, mức OD bắt đầu cảm ứng, ; khả khác ó thể tăng tính tan protein là: thực phương pháp sốc nhiệt nuôi cấy để tăng lượng chaperon đóng gói protein; thử phá tế bào đệm khác PBS, HCl 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải and Lê Quang Huấn (2003), Áp dụng kỹ thuật phân tử nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Trần Phương Hiền (2009), Tách dòng biểu gen lipA mã hóa cho lipase A từ chủng Bacilius subtilis FS2, Đồ án tốt nghiệp, Đại học Bách Khoa TÀI LIỆU TIẾNG ANH Biely P (1985), “Microbial xylanolytic systems”, Trends in Biotechnology, (11), pp.286–290 Chinchetru M.A., Cabezas J.A and Calvo P (1989), “Purification and characterization of a broad specificity beta-glucosidase from sheep liver”, The International Journal of Biochemistry, 21 (5), pp.469–476 Ebringerová A., Kardosová A., Hromádková Z., Malovíková A and Hríbalová V (2002), “Immunomodulatory activity of acidic xylans in relation to their structural and molecular properties”, International Journal of Biological Macromolecules, 30 (1), pp.1–6 Fariha Salma (2008), Investigation of β-xylosidase, α-L-arabinofuranosidase and acetylesterase from Thermotoga hypogea, Master Thesis, University of Waterloo, Ontario, Canada Gatenholm P and Tenkanen M (2003), Hemicelluloses: Science and Technology, American Chemical Society, Washington, DC Ghoneum M (1998), “Anti-HIV activity in vitro of MGN-3, an activated arabinoxylane from rice bran”, Biochemical and Biophysical Research Communications, 243 (1), pp.25–29 Howard B.H., Jones G and Purdom M.R (1960), “The pentosanases of some rumen bacteria”, Biochemical Journal, 74 (1), pp.173–180 10 Howard R.L., Abotsi E., Jansen van R.E.L and Howard S (2003), “Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzym production”, African Journal of Biotechnology, (12), pp.602–619 11 Hrubá P., Honys D., Twell D., Capková V and Tupý J (2005), “Expression of betagalactosidase and beta-xylosidase genes during microspore and pollen development”, Planta, 220 (6), pp.931–940 48 12 Keogh G.F., Cooper G.J., Mulvey T.B., McArdle B.H., Coles G.D., Monro J.A and Poppitt S.D (2003), “Randomized controlled crossover study of the effect of a highly β-glucan–enriched barley on cardiovascular disease risk factors in mildly hypercholesterolemic men”, The American Journal of Clinical Nutrition, 78 (4), pp.711–718 13 Masood Sadiq Butt, Muhammad Tahir-Nadeem, Zulfiqar Ahmad and Muhammad Tauseef Sultan (2008), “Xylanases and Their Applications in Baking Industry”, 46 (1), pp.22–31 14 Nanmori T., Watanabe T., Shinke R., Kohno A and Kawamura Y (1990), “Purification and properties of thermostable xylanase and beta-xylosidase produced by a newly isolated Bacillus stearothermophilus strain”, Journal of Bacteriology, 172 (12), pp.6669–6672 15 N Casali and A Preston (2003), Methods in Molecular Biology, Humana Press Inc, Totowa, NJ 16 Novagen (2005), pET Manual System, 11th ed, EMD Biosciences, Inc 17 Novagen (2005), pET22b(+) map, TB038, EMD Biosciences, Inc 18 Saha B.C (2003), “Purification and properties of an extracellular β-xylosidase from a newly isolated Fusarium proliferatum”, Bioresource Technology, 90 (1), pp.33–38 19 Shao W and Wiegel J (1992), “Purification and characterization of a thermostable beta-xylosidase from Thermoanaerobacter ethanolicus”, Journal of Bacteriology, 174 (18), pp.5848–5853 20 Sunna A and Antranikian G (1997), “Xylanolytic enzyms from fungi and bacteria”, Critical Reviews in Biotechnology, 17 (1), pp.39–67 21 Teng C., Jia H., Yan Q., Zhou P and Jiang Z (2011), “High-level expression of extracellular secretion of a β-xylosidase gene from Paecilomyces thermophila in Escherichia coli”, Bioresource Technology, 102 (2), pp.1822–1830 22 Wakiyama M., Yoshihara K., Hayashi S and Ohta K (2008), “Purification and properties of an extracellular beta-xylosidase from Aspergillus japonicus and sequence analysis of the encoding gene”, Journal of Bioscience and Bioengineering, 106 (4), pp.398–404 23 Wong K.K., Tan L.U and Saddler J.N (1988), “Multiplicity of beta-1,4-xylanase in microorganisms: functions and applications.”, Microbiological Reviews, 52 (3), pp.305–317 24 Zimbardi A.L.R.L., Sehn C., Meleiro L.P., Souza F.H.M., Masui D.C., Nozawa M.S.F., Guimarães L.H.S., Jorge J.A and Furriel R.P.M (2013), “Optimization of βglucosidase, β-xylosidase and xylanase production by Colletotrichum graminicola under solid-state fermentation and application in raw sugarcane trash saccharification”, International Journal of Molecular Sciences, 14 (2), pp.2875–2902 49 CÁC TRANG MẠNG 25 https://en.wikipedia.org/wiki/Xylan_1,4-b-xylosidase 26 http://www.cazy.org/Glycoside-Hydrolases.html 27 https://www.cazypedia.org/index.php/Glycoside_hydrolases 28 http://biocyc.org/ 29 http://bitesizebio.com/180/the-basics-how-alkaline-lysis-works/ 30 http://www.restrictionmapper.org/ 50 ... xylan 1,4 -β- xylosidase tên thường gọi xylosidase, enzym có số tên gọi khác là: xylobiase exo-1,4-xylan 1, 4β- xylosidase, β- D-xylopyranosidase, exo-1,4 -xylosidase, exo-1,4 -β- D -xylosidase 1,4 -β- D-xylan... Khóa luận Biểu gen mã hóa xylan 1,4 -β- xylosidase chủng Escherichia coli” phần nhỏ nghiên cứu Các thí nghiệm tiến hành phòng Kỹ thuật di truyền – Viện Công nghệ sinh học Thời gian thực khóa luận. .. tìm thấy gan cừu [4] 13 Hình Xylan 1,4 -β- xylosidase thủy phân (1,4) -β- D-xylan [28] 1.1.5 Ứng dụng xylan 1,4 -β- xylosidase Bởi đặc tính trên, xylan 1,4 -β- xylosidase đóng vai trò quan trọng phân