Tổng quan các phương pháp đánh giá sinh trưởng vi tảo trong PTN

Với yêu cầu cụ thể là đánh giá nhanh sinh trưởng của VSV, phòng thí nghiệm thường sử dụng một số phương pháp như: đếm trực tiếp trong buồng đếm đếm tế bào, đo độ đục mật độ quang – OD, đ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐẠO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

KHOA HÓA HỌC

BÀI TẬP MÔN HỌC

ĐỀ TÀI: CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ NHANH SINH TRƯỞNG CỦA VI TẢO TRONG ĐIỀU KIỆN

PHÒNG THÍ NGHIỆM

Chuyên ngành: Hóa Công nghệ - Môi trường

Người hướng dẫn khoa học : Cô Phạm Thanh Nga Sinh viên : Phạm Đăng Tuyên Lớp : K63B

Hà Nội - 2016

Trang

Nghiên cứu các phương pháp đánh giá nhanh sinh trưởng

của vi tảo trong điều kiện phòng thí nghiệm

Trong quá trình nuôi cấy, nghiên cứu vi sinh vật, việc đánh giá sinh trưởng của VSV là một công đoạn cần thiết Có nhiều phương pháp giúp chúng ta ghi nhận các thông số của quá trình sinh trưởng ở VSV, với nguyên tắc chung nhất là dựa vào sự biến đổi số lượng, chất lượng VSV trong điều kiện nuôi cấy Với yêu cầu cụ thể là đánh giá nhanh sinh trưởng của VSV, phòng thí nghiệm thường sử dụng một số phương pháp như: đếm trực tiếp trong buồng đếm (đếm tế bào), đo

độ đục (mật độ quang – OD), đo sinh khối tế bào, đo gián tiếp nồng độ một số chất trong môi trường nuôi cấy, …v.v Mỗi phương pháp có nhưng ưu nhược điểm riêng, phù hợp với từng điều kiện, từng trường hợp cụ thể

I. Chuẩn bị mẫu:

Trước khi tiến hành các phương pháp định lượng VSV thông thường phải thực hiện việc chuẩn bị mẫu: gồm thao tác lấy mẫu và pha loãng mẫu:

1. Lấy mẫu:

Việc lấy mẫu có một số yêu cầu về khối lượng và số lượng để đảm bảo phù hợp với mục đích:

− Lấy mẫu có tính chất đại diện

− Lấy mẫu với lượng vừa phải, đủ để thực hiện phân tích các đặc tính lý hóa sinh

− Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu phải vô trùng

− Lấy mẫu xong cần phân tích ngay, nếu ở nhiệt độ thường không để quá 30’, nếu hạ nhiệt độ xuống 0-5oC có thể để lâu hơn nhưng không để quá 24h

− Mẫu phải có nhãn ghi vào sổ đặc điểm của mẫu cũng như nơi thu mẫu Trên nhãn cần ghi thông tin sau:

• Mã số mẫu

• Loại và mục đích lấy mẫu

• Tên và chức năng người lấy mẫu

• Yêu câu phân tích

2. Pha loãng mẫu:

Chuẩn bị một số bình tam giác chứa 90ml nước cất vô trùng, một số ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng và một số ống hút (1ml) vô trùng

− Mẫu ở trạng thái lỏng :

Pha loãng mẫu theo dãy thập phân:

 Dùng pipet lấy 1ml dung dịch từ ống nuôi cấy gốc ban đầu cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất, ta được dung dịch có nồng độ bằng 10-1 dung dịch gốc (hay dung dịch có độ pha loãng 101 hoặc hệ số pha loãng 10-1)

 Dùng pipet lấy 1ml dung dịch có độ pha loãng 101 cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất ta được dung dịch có độ pha loãng 102 (hoặc hệ số pha loãng 10-2) Tiếp tục như vậy ta được các dung dịch có độ pha loãng cao hơn

− Nếu mẫu nghiên cứu ở trạng thái đặc (như đất, lương thực, thực phẩm)

− Chuẩn bị 2 bình hình nón có dung tích 250 ml

+ Bình 1 chứa 90ml nước cất vô trùng + Bình 2 đã vô trùng và không chứa gì

− Khử trùng cối chày sứ bằng cách cho một ít cồn vào và đốt lên Sau đó để nguội

− Cân 1 g đất (hoặc mẫu) cho vào cối sứ và nghiền nát mẫu

− Dùng toàn bộ nước ở bình 1 để chuyển toàn bộ mẫu sang bình 2

− Lắc 5 phút, để lắng 30 giây rồi tiếp tục pha loãng mẫu như mẫu ở trạng thái lỏng

− Tuỳ theo sự ước đoán số lượng vi sinh vật trong mẫu mà pha loãng nhiều hay ít

Sau khi có mẫu, bắt đầu tiến hành các phương pháp phân tích lí hóa sinh

II Phương pháp định lượng vi sinh vật:

1. Phương pháp đếm trực tiếp:

a. Nguyên tắc:

− Sử dụng kính hiển vi quan sát mẫu VSV trên các buồng đếm, đếm trực tiếp số lượng tế bào vi khuẩn trong một thể tích phòng đếm, kết hợp với

độ pha loãng để tính toán được mật độ tế bào trong dung dịch ban đầu Đối với tế bào động vật nguyên sinh ta có thể dùng phòng đếm Petroff-Hausser, còn với các tế bào sinh vật nhân nguyên thủy và nhân chuẩn ta thường dùng phòng đếm Neubauer-Thomas (phòng đếm hồng cầu) để đếm Với các tế bào sinh vật nhân sơ thường có thể nhuộm màu hoặc sử dụng kính hiển vi tương phản pha hay kính hiển vi huỳnh quang (phase-constrast or fluoresence microscope) để dễ quan sát

− Có thể đếm số lượng tế bào VSV theo phương pháp đếm trực tiếp trên lam phết kính (Breed) Nguyên tắc đếm trực tiếp số tế bào trên một vi trường, lặp lại nhiều lần để có được số tế bào trung bình, kết hợp với diện tích một

vi trường cùng độ pha loãng để tính toán ra mật độ VSV trong mẫu gốc

− Ngoài ra có thể sử dụng máy đếm điện tử Coulter Counter Nguyên lý là hai bên mỗi lỗ nhỏ có điện cực và nối điện Khi tế bào trong dịch huyền phù đi qua lỗ nhỏ thi cứ mỗi tế bào đi qua thì điện trở lại tăng lên (hoặc tinh dẫn điện giảm xuống) và sinh ra một tin hiệu điện, máy đếm sẽ tự động ghi số

b. Phương pháp tiến hành:

∗ Phương pháp đếm trực tiếp trên lam phết kính:

Tiêu bản VSV đã được nhuộm màu (nhuộm đơn)

− Phết kính:

+ Dùng lam sạch và bút chì mỡ (bút lông kim), kẻ một hình vuông S = 400

mm2, ở mặt trên lam Mục đích không cho vi sinh vật lan ra khỏi diện tích đếm

+ Hút 0.02-0.2 ml dung dịch pha loãng , nhỏ vào giữa hình vuông, ở mặt trên lam

+ Đốt que cấy, để nguội, dùng cạnh vòng cấy ở đầu que dàn đều giọt mẫu

ra xung quanh, vừa chạm vào cạnh hình vuông

+ Cố định tiêu bản, nhuộm đơn bằng thuốc nhuộm blue methylen

+ Nhỏ một giọt dầu soi, xem ở vật kính x100

− Cách đếm:

+ Đếm số tế bào VSV trên 1 đơn vị vi trường (VT)

+ Đếm hết tất cả 30 – 50 VT/ hình vuông phết kính

Sơ đồ di chuyển vật kính trong hình vuông phết kính để đếm số VSV/1VT

Số tế bào/1ml mẫu = Trong đó: X là số vi khuẩn đếm được trong một V

S là diện tích hình vuông phết kính (400mm2)

S là diện tích 1 vi trường, πR2=0.0004mm2

=> số lượng vi trường có trong S

V là thể tích giọt vi khuẩn phết kính

H là hệ số pha loãng mẫu

∗ Phương pháp đếm trực tiếp trong buồng đếm:

Để quan sát vi tảo thông thường sẽ sử dụng buồng đếm hồng ngoại

− Cấu tạo buồng đếm:

+ Buồng đếm là một phiến kính trong, dày từ 2-3mm, hình chữ nhật

+ Giữa phiến kính là một phần lõm phẳng làm đĩa đếm, có kẻ một hoặc hai khung đếm gồm 400 ô nhỏ, xung quanh có một rãnh nhỏ Đĩa đếm thấp hơn bề mặt phiến kính khoảng 1/10mm, có hình tròn vì thế khi phủ lên bằng một lá kính thì độ sâu của đĩa đếm sẽ đồng đều nhau Vùng đĩa đếm có diện tích 1mm2 Bên ngoài buồng đếm có ghi tên loại buồng đếm

và một số thông số kĩ thuật đặc trưng:

Cấu tạo buồng đếm

− Cấu tạo khung đếm đĩa đếm: khung đếm thường có cấu tạo

+ Trường hợp 1: khung đếm có 16 ô lớn, mỗi ô lớn có 25 ô nhỏ Một khung do đó có 400 ô nhỏ

+ Trường hợp 2: khung đếm có 25 ô lớn, mỗi ô lớn có 16 ô nhỏ Một khung do đó có 400 ô nhỏ

+ Diện tích 1 ô nhỏ là 1/400mm2

Vậy thể tích 1 ô nhỏ là V= 0.1mm x 1/400mm2 = 1/4000mm3

Cấu tạo khung đếm

− Cách tiến hành:

+ Trước khi tiến hành quan sát cần cho thêm vài giọt fomalin vào trong mẫu, trộn đều

+ Đặt lammen sạch phủ lên khung đếm

+ Lắc mạnh dịch huyền phù đã pha loãng, sau đó dùng pipet hút dung dịch mẫu đã pha loãng, bỏ đi vài giọt đầu

+ Dùng đầu pipet đặt vào cạnh buồng đếm tiếp giáp lammen kính, dịch huyền phù sẽ đi vào buồng đếm nhờ cơ chế mao dẫn Buồng đếm được

chuẩn bị đúng khi chỉ có vùng không gian nằm giữa lá kính và buồng đếm được phủ bởi dịch huyền phù tế bào, còn các rãnh chung quanh thì không

bị dính ướt

+ Di chuyển nhẹ nhàng khung đếm để dịch huyền phù tràn sang các khoang Khi đó dịch trong khoang có độ dày 0.1mm

+ Đặt buồng đếm lên bàn kẹp của kính hiển vi, dùng kẹp cố định buồng đếm

+ Thao tác, điều chỉnh kính hiển vi, ban đầu dùng vật kính x10 để điều chỉnh sơ bộ trước, sau đó sử dụng vật kính x40 để quan sát và đếm Chú ý bắt đầu đếm sau khi nhỏ giọt dung dịch từ 3-5’

+ Đếm số tế bào có trong 5 ô lớn (4 ô ở cạnh và 1 ô ở giữa), đếm lần lượt từng ô nhỏ trong 1 ô lớn Trong tất cả các ô nhỏ cần đếm số tế bào nằm hẳn trong ô trước, sau đó đếm các tế bào ở cạnh bên trên và bên phải ô + Đếm tất cả 80 ô nhỏ trong 5 ô lớn (TH1: 1 ô lớn có 16 ô nhỏ)

+ Đếm tất cả 125 ô nhỏ trong 5 ô lớn (TH2: 1 ô lớn có 25 ô nhỏ)

Thao tác thực hiện đếm số tế bào

− Công thức tính:

Số tế bào/1ml mẫu = Trong đó: a là số tế bào trung bình có trong 1 ô nhỏ

V là thể tích của 1 ô nhỏ (tính theo ml)

H là hệ số pha loãng

− Một số chú ý:

+ Nên tiến hành nhuộm màu tiêu bản (methylen blue) để dễ quan sát và đếm chính xác

+ Nồng độ dịch huyền phù pha loãng thích hợp sao cho mật độ trong mỗi

ô nhỏ không úa 10 tế bào

+ Sử dụng buồng đếm xong phải rửa buồng đếm ngay và lau khô

+ Để đạt độ chính xác cao, mật độ trung bình của tế bào đếm được trong 1

ô nhỏ vào khoảng 2.5 < a < 10

c. Ưu – nhược điểm:

− Ưu điểm: phương pháp đếm trực tiếp có ưu điểm là có thể nhanh chóng xác định được nhanh chóng mật độ VSV trong mẫu, thao tác đơn giản

− Nhược điểm:

+ Không nhận biết được tế bào VSV sống và các tế bào chết

+ Dễ nhầm lẫn tế bào VSV với các dị thể trong mẫu

+ Độ chính xác ở mức tương đối

+ Không phù hợp với huyền phù VSV có mật độ thấp

2. Phương pháp đo mật độ quang

a. Nguyên tắc:

Số lượng VSV có trong mẫu có thể được xác định gián tiếp thông qua phương pháp đo độ đục hay đo mật độ quang Nguyên tắc chung của phương pháp này là sự tương quan giữa nồng độ, hay mật độ tế bào VSV và số lượng photon trong ánh sáng bị phân tán (thông thường với các mẫu không quá đậm đặc thì mật độ VSV tỉ lệ thuận với số photon bị phân tán) Việc đo độ đục có thể

tiến hành theo 3 cách đó là: đo bằng quang phổ kế, dùng máy đếm điện tử và sử dụng ống nghiệm có độ đục khác nhau

− Với việc đo bằng quang phổ kế:

+ Sử dụng chùm sáng đơn sắc chiếu xuyên qua huyền phù chứa VSV cần

đo Các tế bào VSV trong huyền phù sẽ làm phân tán bớt chùm tia sáng, tùy theo số lượng nhiều hay ít của chúng trong mẫu Số tia sáng còn lại đi qua mẫu sẽ kích thích một tế bào quang điện Cường độ chùm sáng đi qua sẽ làm dịch chuyển cây kim trên thước đo, cho ta biết phần trăm ánh sáng bị phân tán trên bảng chỉ thị Từ kết quả thu được ta mang đối chiếu với một bảng chuẩn và kết hợp với độ pha loãng để biết được mật độ VSV trong mẫu

+ Lượng ánh sáng truyền qua mấu sinh khối tỉ lệ thuận với lượng tế bào

và có thể tính theo công thức sau:

T = Trong đó:

+ Để có được đơn vị đo thích hợp, người ta sử dụng đơn vị hấp thụ ánh sáng của vật chất A (Absorance) thay cho đơn vị truyền ánh sáng T Ta

có mối liên hệ:

+ Độ hấp thụ tăng tỉ lệ thuận với mật độ tế bào Thuật ngữ độ hấp thụ (A) còn được gọi là mật độ quang (OD)

− Cách đo thứ 2 là sử dụng máy đếm điện tử, có thể đo được hàng ngàn tế bào trong vòng vài giây Nguyên tắc của phép đo này là tế bào được đưa

qua tia sáng của máy điện tử, VSV cản tia sáng và ghi dấu hiệu trên bộ đếm của máy

− Cách thứ 3 là sử dụng ống nghiệm có độ đục khác nhau (dãy ống nghiệm Macfaland) Một dãy ống nghiệm chứa BaSO4 có độ pha loãng khác nhau tương ứng với độ pha loãng có bảng đối chiếu của nồng độ vi khuẩn tương ứng Đối chiếu độ đục của ống nghiệm chứa mẫu cần đo với dãy ống nghiệm Macfaland, sau đó đối chiếu với bảng ta sẽ biết được nồng độ của

vi khuẩn tương ứng

b. Cách tiến hành:

∗ Phương pháp đo bằng quang phổ kế:

Tế bào VSV có chứa nhiều phân tử có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng khác nhau (AND từ 254-260nm; protein 280nm; xitocrom 400-500nm…) Khi đo độ đục tế bào người ta thường chọn các bước sóng có độ hấp thụ nhỏ, hay dùng nhất là bước sóng 600-620nm Tùy vào đối tượng mang đo mà ta chọn bước sóng cho phù hợp Bên cạnh đó, do sự ảnh hưởng của thành phần bên trong

tế bào đối với sự khuếch tán hay hấp thụ ánh sáng mà phương pháp này có tính đặc thù riêng với mỗi loại VSV

Tiến hành đo:

− Lấy 1 ống nghiệm chứa mẫu VSV cần đo và 4 ống nghiệm vô trùng, tiến hành pha loãng theo dãy thập phân

− Chuẩn bị máy quang phổ đo độ đục, có thể sử dụng máy quang phổ đơn giản hoặc máy quang phổ UV-vis

− Tiến hành đo độ đục của các mẫu đã pha loãng trên quang phổ kế ở 620nm, ứng với mỗi độ pha loãng mẫu sẽ thu được một giá trị OD Theo định luật Lambert thì độ hấp thụ chỉ tỉ lệ thuận với mật độ VSV trong khoảng giá trị từ 0.1-0.8 Nếu lớn hơn 0.8 thì mật độ vật chất cao, các VSV sẽ tạo ra các bóng che khuất nhau làm cho sai lệch kết quả

− Song song với việc đo độ đục cần tiến hành nuôi cấy và đếm số lượng tế bào ở các độ pha loãng tương ứng trên môi trường thạch, từ đó thiết lập hàm tương quan giữa độ hấp thụ và số lượng tế bào sống Hàm có dạng bậc nhất:

A = a + b Trong đó:

− Sau khi xây dựng được hàm tương quan, các lần đo tiếp theo ta chỉ cần đo giá trị mật độ quang (OD) rồi sau đó dựa vào hàm tương quan để tính toán

ra mật độ VSV trong mẫu

∗ Phương pháp dãy ống nghiệm có độ đục khác nhau (dãy ống nghiệm Macfaland)

− Dùng 10 ống nghiệm sạch, trong, có kích thước bằng nhau Nhỏ vào mỗi ống một lượng dung dịch BaCl2 theo thứ tự từ ống 1 đến ống 10, ống 1 nhỏ 0,1ml, ống 2 nhỏ 0,2ml, cứ thế đến ống 10 là 1ml Tiếp theo cho vào mỗi ống vừa đủ 10ml dung dịch H2SO4 và hàn kín miệng ống

− Lấy ống nghiệm chứa mẫu cần đo cho vào máy li tâm, gạn rửa Cho nước cất vào tiếp tục li tâm, gạn rửa 2-3 lần nữa Cuối cùng cho nước cất vào một lượng ngang với lượng dung dịch nuôi cấy

− Đặt ống nghiệm chứa VSV đã gạn rửa vào giữa 2 ống Macfaland áng chừng có màu tương tự Số lượng VSV có trong 1ml dung dịch sẽ nằm trong khoảng 2 mức chuẩn của ống Macfaland

c. Ưu – nhược điểm:

− Ưu điểm: phương pháp đo mật độ quang cho kết quả nhanh chóng, dễ dàng, phương pháp đo với máy quang phổ thường được ứng dụng để theo dõi, nghiên cứu sự sinh trưởng của VSV trong PTN hoặc trong sản xuất Việc đo độ đục với máy quang phổ có thể phân biệt được tế bào sống và tế bào chết

− Nhược điểm:

+ Phương pháp đo với máy quang phổ dễ bị sai số do thao tác và sai số của máy đo

+ Phương pháp dãy ống nghiệm Macfaland cho kết quả rơi vào một khoảng, không phải mật độ cụ thể

+ Cần lưu ý khi pha loãng mẫu để đo trên máy quang phổ cần pha sao cho

OD rơi vào khoảng <0.8

3. Phương pháp đo sinh khối:

Sự tăng trưởng của vi sinh vật là sự gia tăng về số lượng cá thể trong quần thể, khi số lượng tăng lên sẽ đi kèm với sự tăng lên của sinh khối Mặt khác, hàm lượng độc tố có liên quan mật thiết với lượng chất khô trong mẫu hơn là số lượng cá thể, nên số lượng cá thể chưa phải là thước đo lý tưởng để đánh giá kích thước quần thể hay độc tính tiềm tàng Do đó, trong nghiên cứu thường sử dụng phương pháp đo sinh khối vi sinh vật

Có 2 phương pháp đo sinh khối là đếm số lượng tế bào và xác định hàm lượng sắc tố

3.1. Phương pháp đếm và xác định thể tích tế bào:

Nguyên tắc:

− Thể tích sinh học (biovolume) có thể đạt được từ số lượng tế bào bằng cách xác định thể tích trung bình của tế bào từng loài hay đơn vị đếm rồi nhân với số lượng tế bào hiện có trong mẫu Kết quả là tổng thể tích của mỗi loài

− Với tế bào phù du thì 1mm3 được coi là 1mg, thể tích sinh học tương ứng với sinh khối

− Thể tích trung bình xác định bằng cách giả dịnh một kiểu hình học cho mỗi loài (đối với tế bào Microcystis được coi là hình cầu), đo độ dài hình học của 20-30 tế bào (phụ thuộc độ biến động) của loài và tính toán thể tích trung bình tương ứng

Ví dụ: để xác định 20 tế bào Microcystis, có đường kính trung bình là 5μm Với giả định dạng hình học của tế bào là hình cầu ta sẽ tính được thể tích tế bào trung bình là 4/3πr3 = 65,4μm3 Theo thống kê có khoảng 1 triệu tế bào trong 1mL như vậy tổng thể tích sinh học là 65,4.106μm3mL-1

Xét ví dụ 2: Đo 30 tế bào hình sợi Planktothrix cho kết quả chiều dài trung bình là 225μm và đường kính trung bình là 6μm Giả định tế bào có hình trụ, khi

đó thể tích trung bình là 2πr2.L=6,359μm3 Thống kê cho thấy có khoảng 10000