NGHIÊN CỨU HẠT NANO CHITOSAN LÀM TÁ CHẤT CHO VACXIN CÚM AH1N1 VÀ THỬ NGHIỆM ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG (MUS MUSCUỈUS Swiss)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN NGUYỄN THỊ NGỌC HÀ NGHIÊN CỨU HẠT NANO CHITOSAN LÀM TÁ CHẤT CHO VACXIN CÚM A/H1N1 VÀ THỬ NGHIỆM ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG (Mus muscuỉus Swiss) LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011 NGUYỄN THỊ NGỌC HÀ NGHIÊN CỨU HẠT NANO CHITOSAN LÀM TÁ CHẤT CHO VACXIN CÚM A/H1N1 VÀ THỬ NGHIỆM ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG (Mus muscuỉus Swiss) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số : 604230 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS TS Lê Văn Hiệp PGS TS Nguyễn Anh Dũng Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình khác Người cam đoan Nguyễn Thị Ngọc Hà Đe hoàn thành luận văn này, xin chân thành cảm ơn: GS.TS Lê Văn Hiệp - Viện Vacxin Sinh phẩm Y tế Nha Trang, Người thầy trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt, truyền đạt kiến thức cho trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Viện Vacxin Nha Trang PGS.TS Nguyễn Anh Dũng - Trường Đại học Tây Nguyên, Người thầy trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt, truyền đạt kiến thức đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho suốt trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Lãnh đạo Trường Đại học Tây Nguyên, tập thể Thầy Cô giáo Phòng Đào tạo Sau đại học, Khoa KHTN CN Các thầy Cô giáo tận tâm giảng dạy, truyền thụ kiến thức quý báu trình học tập Các cán nhân viên Phòng Nghiên cứu Phòng Kiểm định Viện Vacxin Nha Trang Lãnh đạo tập thể cán giáo viên trường Trường THPT Trần Phú, TP Buôn Ma Thuột Cuối xin gửi tình cảm thân thương tới gia đình, bạn bè đồng nghiệp giúp đỡ động viên hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn! CÁC CHỮ VIẾT TẮT APC : Antigen- presenting cell (Tế bào trình diện kháng nguyên) CS : Chitosan DNA FCA : Deoxyribo nucleic Acid : Freund’s complete adjuvant FIA : Freund’s incomplete adjuvant HA: : Haemagglutinin HAU : Haemagglutination Unit (Đơn vị kháng nguyên) HI test : Haemagglutination Inhibition test (Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu) HIU : Haemagglutination Inhibition Unit (Đơn vị hiệu giá kháng thể kháng HA) IgG IVAC : Immunoglobulin : Viện Vacxin Sinh phẩm Y tế Nha Trang kDa : Kilo Dalton KN MIC : Kháng Nguyên : Nồng độ ức chế tối thiểu RNA : Ribonucleic Acid TPP : Tripolyphosphate WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế giới) Hình 3.6: Kết tăng trọng chuột nhóm vacxin có tá chất nao chitosan khác 55 PHẦN MỞ ĐẦU Những năm 1918-1919, giới xảy đại dịch cúm “Tây Ban Nha” virus cúm týp A/H1N1 gây Đây thực ác mộng cho loài người vài tháng có tỉ người mắc bệnh (chiếm 1/2 dân số giới thời kì giờ) cướp sinh mạng 20 triệu người, gấp đôi số tử vong chiến tranh giới thứ Mới đại dịch cúm 2009 dịch cúm loại virus thuộc chủng A/H1N1, lần quan y tế phát vào tháng năm 2009 Sự bùng phát bệnh giống bệnh cúm phát lần đầu ba khu vực thuộc Mexico lây lan nhanh Theo tổ chức Y tế giới, tính đến ngày 12 tháng năm 2009 có 29669 trường hợp xác định nhiễm cúm A/H1N1 74 quốc gia có hàng trăm người chết Tính đến ngày 10/02/2010, Việt Nam ghi nhận 11.186 trường hợp dương tính với cúm A/H1N1 58 trường hợp tử vong Đại dịch cúm xảy tác động lớn đến kinh tế, sức khoẻ, tính mạng người hoạt động xã hội khác nên việc nghiên cứu, sản xuất vacxin thuốc kháng virus hai mục tiêu lớn mà nhiều quốc gia hướng tới Vacxin biện pháp hữu hiệu để phòng ngừa, kiểm soát đẩy lùi bệnh dịch nói chung bệnh cúm nói riêng Hiện nay, giới lực sản xuất vacxin phòng cúm đáp ứng 10% dân số đại dịch xảy Vì mục tiêu nghiên cứu sản xuất loại vacxin có hiệu giá cao, rẻ an toàn sử dụng Hiệu miễn dịch giá thành vacxin lại phụ thuộc lớn vào tá chất Một số tá chất thường sử dụng cho người Al(OH) 3, MF59, chitosan, Vì vậy, việc nghiên cứu loại tá chất cho vacxin cần thiết sản xuất vacxin Hạt nano chitosan an toàn sinh học, tương hợp sinh học, có kích thước nanomet, mang điện tích dương dễ dàng qua màng tế bào nên mang vacxin, vacxin qua niêm mạc mũi với tính an toàn, hiệu đáp ứng miễn dịch cao, kéo dài Hạt nano chitosan với đặc tính ưu việt như: khả tương hợp sinh học, hỗ trợ điều hoà miễn dịch, enzyme thể phân hủy Vì y học, hạt nano chitosan sử dụng phổ biến để mang thuốc, protein, vacxin, kháng khuẩn, làm vector chuyển gen Xuất phát từ thực tế đó, sử dụng hạt nano chitosan làm đối tượng nghiên cứu với tên đề tài “Nghiên cứu hạt nano chitosan làm tá chất cho vacxin cúm A/H1N1 thử nghiệm đáp ứng miễn dịch chuột nhắt trắng (Mus musculus Swiss)” Mục tiêu đề tài Nghiên cứu ảnh hưởng khối lượng phân tử hạt nano chitosan đến khả hấp phụ kháng nguyên cúm A/H1N1 Đánh giá tính an toàn đáp ứng miễn dịch chuột nhắt trắng vacxin cúm A/H1N1 có tá chất nano chitosan PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan chitosan Hình 1.1: Công thức cấu tạo nano chitosan Chitosan biopolymer (polyglucosamine), sản phẩm deacetyl chitin, polysaccharide có thành phần cấu trúc loài giáp xác tôm, cua, côn trùng vách tế bào nấm Chitin có cấu tạo tương tự cellulose, có khác biệt đơn vị cấu tạo nên chitin N-acetyl-D-glucosamine, đơn vị nối với liên kết P-1-4-glycoside Tính chất hoạt tính sinh học chitin chitosan phụ thuộc nhiều vào khối lượng phân tử (Mw) mức độ deacetyl hóa (DD: degree of deacetyllation) Mức độ deacetyl hóa dùng để % số nhóm acetyl phân tử chitin, chitosan bị khử Mức độ deacetyl hóa tỉ lệ thuận với mật độ nhóm NH3+ phân tử ảnh hưởng tới tính chất đa điện độ tan chitin, chitosan Mức độ deacetyl trung bình chitin nằm khoảng 10-15% Có sản phẩm chitin deacetyl hóa phần (partially deacetyl chitin) có mức độ deacetyl hóa từ 30-40% Trong chitosan phải có mức độ deacetyl hóa >50% Nhờ chitosan dễ tan số axit hữu loãng axit acetic, axit lactic, axit glutamic, axit chlohydric Khi hoà tan chitosan môi trường axit, nhóm amine chuỗi nhận proton chuyển sang mang điện tích dương Khối lượng phân tử chitin, chitosan xác định HPLC Tuy nhiên phương pháp nhanh đơn giản đo độ nhớt dựa vào số K phương trình Mark- Houwink: [n] = KM a = 1.81x10-3M0'93 Trong đó: n độ nhớt biểu kiến chitin, M khối lượng phân tử Chitosan có trọng lượng phân tử khác từ 50-2000kDa, độ nhớt khác (1% chitosan axit acetic 1% có độ nhớt