Giá trị sử dụng của bộ kít nhuộm hóa học tế bào HICYTEC trong phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho theo tiêu chuẩn FAB

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu hoàn toàn trung thực đề tài không trùng với đề tài công bố Nếu sai xin hoàn toàn chịu trách nhiệm LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô hướng dẫn TS Trần Văn Tính ThS Ngô Thị Thảo giao đề tài tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cán bộ nhân viên Viện Huyết học- Truyền máu Trung ương, Trung tâm Huyết học- Truyền máu Lãnh đạo Bệnh viện 19-8 Bộ Công an giúp đỡ tạo điều kiện để em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô, bạn bè, những người thân gia đình động viên, giúp đỡ em suốt quá trình làm đề tài Em xin chân thành cảm ơn Sinh viên Vũ Thị Thủy MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ii PHỤ LỤC CÁC BẢNG iii PHỤ LỤC CÁC HÌNH VẼ iv ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Quá trình sinh máu 1.1.1 Cơ quan sinh máu .3 1.1.2 Quá trình sinh máu .3 1.2 Bệnh bạch cầu cấp 1.2.1 Khái niệm chung 1.2.2 Dịch tễ học 1.2.3 Các nguyên nhân gây bệnh 1.2.4 Cơ chế bệnh sinh 1.2.5 Phân loại .5 1.2.6 Đặc điểm lâm sàng .6 1.2.7 Đặc điểm xét nghiệm 1.3 Tình hình nghiên cứu thế giới nhuộm hóa học tế bào 1.3.1 Kỹ thuật nhuộm Periodic-Axít Schiff (PAS) .8 1.3.2 Kỹ thuật nhuộm Peroxidaza (PER) 10 1.3.3 Kỹ thuật nhuộm Sudan B 10 1.3.4 Kỹ thuật nhuộm Esteraza 11 1.3.5 Kỹ thuật nhuộm Photphataza 12 1.4 Ứng dụng phương pháp nhuộm hóa học tế bào y học 13 1.5 Nghiên cứu nước nhuộm hóa học tế bào 17 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 i 2.1 Đối tượng nghiên cứu 22 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn 22 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 22 2.2 Phương pháp nghiên cứu .22 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 22 2.2.2 Phương pháp thu thập mẫu số liệu 22 2.2.3 Kỹ thuật nghiên cứu 23 2.2.4 Xử lý số liệu .24 2.2.5 Biện pháp hạn chế sai số 24 2.2.6 Thời gian địa điểm nghiên cứu 24 2.2.7 Đạo đức nghiên cứu 24 2.3 Thực nghiệm 24 2.3.1 Bệnh phẩm, dụng cụ, máy móc hóa chất nghiên cứu 24 2.3.2 Quy trình nhuộm hóa học tế bào 26 2.3.3 Đánh giá kết .30 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32 3.1 Đặc điểm chung nhóm nghiên cứu 32 3.2 Nhóm bạch cầu cấp dòng lympho 34 3.2.1 Đặc điểm chung giới tuổi 34 3.2.2 Phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho 35 3.3 Kết nhuộm photphataza kiềm bạch cầu bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho 36 3.4 Kết nhuộm Perls bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho 36 CHƯƠNG BÀN LUẬN 37 4.1 Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu 37 4.2 Nhóm bạch cầu cấp dòng lympho 39 4.2.1 Đặc điểm chung nhóm bạch cầu cấp dòng lympho 39 4.2.2 Phân loại thể bệnh bạch cầu cấp bộ kít nhuộm HICYTEC 40 i 4.2.3 Đánh giá mức độ phù hợp phân loại thể bệnh kít nhuộm đồng bộ HICYTEC so với kết chẩn đoán xác định Viện Huyết học-Truyền máu trung ương 49 4.3 Kết nhuộm photphataza axit phân loại dòng tế bào lympho B T 49 4.4 Nhuộm photphataza kiềm bệnh nhân bạch cầu cấp 51 4.5 Nhuộm Perls bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho 52 KẾT LUẬN 53 KIẾN NGHỊ 54 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TT Tên viết tắt Tên Tiếng Việt Tên Tiếng Anh BCC Bạch cầu cấp Leukemia CE Esteraza đặc hiệu CarboxylEsterase CS Cộng Et al CD Dấu ấn miễn dịch Cluster of Differenciation FAB Hội các nhà huyết học French-American-British Pháp –Anh – Mỹ HHTB Nhuộm hóa học tế bào Cytochemistry L1 Bệnh bạch cầu cấp dòng lympho Acute lymphoblastic biệt hóa L2 Bệnh bạch cầu cấp dòng lympho Acute lymphoblastic chưa biệt hóa L3 Bệnh bạch cầu cấp dòng lympho Acute lymphoblastic loại Burkitt 10 11 12 M0 M1 M2 Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy biệt Minimally differentiated hóa tối thiểu acute myeloid Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy Acute myeloid without không có tế bào trưởng thành maturation Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy có Acute myeloblastic with tế bào trưởng thành maturation ii 13 M3 Bệnh bạch cầu cấp dòng tiền tủy Acute promyelocytic bào 14 M4 Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy- Acute myelomonocytic monoxit 15 M5 Bệnh bạch cầu cấp dòng Acute monocytic monoxit 16 M6 Bệnh bạch cầu cấp dòng hồng Erythroleukemia cầu 17 M7 Bệnh bạch cầu cấp dòng tiểu cầu Acute megakaryoblastic 18 NE Esteraza không đặc hiệu Noncharacteristic Esterase 19 NE-NaF Esteraza không đặc hiệu ức chế Noncharacteristic Esterase- Naphtol Natri Florua 20 PA Photphataza axit Phosphatase acid 21 PAL Photphataza kiềm Phosphatase alkaline 22 PAS Periodic-Axit Schiff Periodic-Acid Schiff 23 PER Peroxydaza Peroxydase 24 SD Sudan đen Sudan Black 26 WHO Tổ chức y tế thế giới World Heath Organization ii PHỤ LỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Biến đổi di truyền tiên lượng bạch cầu cấp dòng lympho Bảng 1.2: Xếp loại bạch cầu cấp cấp dòng lympho theo FAB Bảng 1.3: Phân loại tế bào lympho thể bệnh theo FAB có bổ sung thêm Marker di truyền 15 Bảng 1.4: Quy trình kỹ thuật các bước nhuộm đơn 18 Bảng 2.1: Thành phần bộ kít nhuộm hóa học tế bào 25 Bảng 2.2: Nhuộm chất cần phát 27 Bảng 2.3: Nhuộm cố định màu 28 Bảng 2.4: Nhuộm nhân 29 Bảng 2.5: Nhuộm tăng màu 30 Bảng 2.6: Đánh giá kết định tính .31 Bảng 2.7: Đánh giá kết bán định lượng .31 Bảng 3.1: Tỷ lệ mắc bệnh bạch cầu cấp 32 Bảng 3.2: Bảng phân loạibạch cầu cấp theo giới tính 32 Bảng 3.3: Bảng phân loại bạch cầu cấp theo độ tuổi giới tính 33 Bảng 3.4: Bảng phân loại bạch cầu cấp 33 Bảng 3.5: Bảng phân loại bạch cầu cấp dòng lympho theo giới tính .34 Bảng 3.6: Bảng phân loại bạch cầu cấp dòng lympho theo độ tuổi 34 Bảng 3.7: Kết phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho 35 Bảng 3.8: Kết phân loại thể bệnh bạch cầu cấp lai lympho-tủy .35 Bảng 3.9: Kết nhuộm photphataza axit .35 Bảng 3.10: Kết nhuộm photphataza kiềm 36 Bảng 3.11: Kết nhuộm Perls 36 iii PHỤ LỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 4.1: Biểu đồ phân loại bạch cầu cấp theo độ tuổi giới tính 38 Hình 4.2: Biểu đồ phân loại bệnh bạch cầu cấp 39 Hình 4.3: Biểu đồ phân loại bệnh bạch cầu cấp dòng lympho theo độ tuổi 40 Hình 4.4: Ảnh nhuộm Giemsa 42 Hình 4.5: Ảnh nhuộm Giemsa 42 Hình 4.6: Ảnh nhuộm PAS 43 Hình 4.7: Ảnh nhuộm PAS 43 Hình 4.8: Ảnh nhuộm PER 44 Hình 4.9: Ảnh nhuộm PER 44 Hình 4.10: Ảnh nhuộm SD .44 Hình 4.11: Ảnh nhuộm SD .44 Hình 4.12: Ảnh nhuộm Giemsa 45 Hình 4.13: Ảnh nhuộm Giemsa 45 Hình 4.14: Ảnh nhuộm PAS 46 Hình 4.15: Ảnh nhuộm PAS 46 Hình 4.16: Ảnh nhuộm PER 46 Hình 4.17: Ảnh nhuộm PER 46 Hình 4.18: Ảnh nhuộm Sudan B 47 Hình 4.19: Ảnh nhuộm Sudan B 47 Hình 4.20: Ảnh nhuộm Esteraza 48 Hình 4.21: Ảnh nhuộm Esteraza 48 Hình 4.22: Ảnh nhuộm Esteraza không đặc hiệu ức chế NaF Trương Thị T 48 Hình 4.23: Ảnh nhuộm Esteraza không đặc hiệu bệnh nhân Trần Văn C .48 Hình 4.24: Ảnh nhuộm photphataza axít 50 Hình 4.25: Ảnh nhuộm photphataza kiềm .51 Hình 4.26: Ảnh nhuộm Perls tế bào lưới nội mô sắt 52 iv ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh bạch cầu cấp nhóm bệnh máu ác tính hệ thống tạo máu với đặc trưng bởi tăng sinh tích tụ tế bào non máu tủy xương Bạch cầu cấp được chia thành nhóm bạch cầu cấp dòng tủy bạch cầu cấp dòng lympho Bạch cầu cấp dòng lympho bệnh tăng sinh ác tính quá trình tạo máu dòng lympho, theo phân loại nhà Huyết học Anh-Pháp-Mỹ (FAB) năm 1976 thì bạch cầu cấp dòng lympho gồm thể chính: L1, L2, L3 Trên thế giới năm có thêm khoảng 100.000 bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho mới, đó 70% ở trẻ em Tại Việt Nam, chưa có nhiều nghiên cứu tiến hành đầy đủ dịch tễ học bệnh bạch cầu cấp toàn quốc theo thống kê tại viện Huyết học Truyền máu trung ương, Bệnh viện Bạch mai bạch cầu cấp chiếm tỷ lệ cao (32,1%) số bệnh máu đến khám điều trị tại bệnh viện Bạch Mai [6] Theo tiêu chuẩn WHO FAB việc phân loại dòng tế bào thể bệnh dựa hình thái học - nhuộm hóa học tế bào, miễn dịch di truyền [20, 21] Ưu điểm phương pháp nhuộm hóa học tế bào: rẻ tiền, giá thành 1/4 so với phương pháp marker 1/10 so với phương pháp di truyền, không cần máy móc đại, dễ triển khai Hiện nay, bộ kít nhuộm có bán thị trường kít đơn, giá thành cao có những nhược điểm: kỹ thuật nhuộm nằm nên có nhiều cặn, quy trình nhuộm khác thời gian, số bước nhuộm, hóa chất cố định khác nhau, bước tẩy màu kỹ thuật nhuộm Sudan PAS khó đồng nhất, nhuộm thiếu tương phản, chất màu dễ hòa tan dầu soi kính nên khó hội chẩn tiêu nhiều lần Tại Việt Nam, thuốc thử hầu hết tự pha kết hợp với yếu điểm nên độ nhạy, độ đặc hiệu thấp Theo Trần Ngọc Vũ cộng (2014) tỷ lệ phù hợp chẩn đoán giữa hình thái học-hóa học tế bào miễn dịch 89,1%, giá trị dự báo bệnh bạch cầu cấp dòng lympho 88,88% độ đặc hiệu 73,77% [19] Theo tác giả Nguyễn Hữu Toàn việc phân loại dòng tế bào theo tiêu chuẩn FAB dựa phương pháp nhuộm hóa học cần phải có điều chỉnh tới 29,7% nhờ vào kỹ thuật miễn dịch di truyền [15] Hiện nay, Trần Văn Tính, Trung tâm Huyết học - Truyền máu, Bộ Công an nghiên cứu chế tạo thành công kít nhuộm hóa học tế bào đồng bộ HICYTEC gồm 10 kỹ thuật: Giemsa, Periodic-Axit Schiff (PAS), Peroxidaza, Sudan B, Esteraza đặc hiệu, Esteraza không đặc hiệu, Esteraza không đặc hiệu ức chế NaF, Photphataza kiềm, Photphataza axít, Perls Bộ kít khắc phục được yếu điểm ở trên, để đánh giá giá trị sử dụng bộ kít một việc làm cần thiết, tiến tới có thể thay thế hàng nhập ngoại giả túc tế bào, 40% tế bào định hướng dòng tủy dương tính lan tỏa nhân hồng cầu màu xanh Hình 4.14: Ảnh nhuộm PAS Hình 4.15: Ảnh nhuộm PAS bệnh nhân Trương Thị T bệnh nhân Trần Văn C Phản ứng nhuộm Peroxidaza phản ứng xác định có mặt enzym Peroxidaza Peroxidaza có tính chất oxy hóa – khử mạnh, khử nước oxy già thành nước oxy nguyên tử Oxy nguyên tử có tính oxy hóa mạnh oxy hóa benzidin thành 2-diimin diphenyl có màu vàng nâu Phản ứng dương tính với tế bào dòng tủy, mono dòng lympho, hồng cầu, tiểu cầu âm tính [22, 40] Hình 4.16 4.17 ảnh nhuộm PER bệnh nhân bạch cầu cấp thể lai lympho-tủy Các tế bào dương tính mạnh có màu vàng nâu bào tương được xác định dòng tủy Các tế bào âm tính với Peroxydaza không bắt màu vàng nâu nguyên sinh chất được xác định dòng lympho Hình 4.16: Ảnh nhuộm PER bệnh nhân Trương Thị T Hình 4.17: Ảnh nhuộm PER bệnh nhân Trần Văn C Nhuộm Sudan đen cũng cho kết tương tự nhuộm Peroxydaza Cơ chế phản ứng nhuộm Sudan khác bao gồm khuếch tán vật lý đơn liên kết hóa học trực tiếp Trong loại thuốc nhuộm, Sudan đen một nhóm phẩm nhuộm được ưa chuộng, có tính chấthòa tan lipit; lợi dụng tính 46 chất để phát thành phần lipit có tế bào Trong tủy xương bình thường tế bào dòng tủy dương tính với Sudan từ tiền tủy bào đến tế bào trưởng thành, dòng mono dương tính nhẹ, mẫu tiểu cầu, tiểu cầu,dòng lympho hồng cầu âm tính ở các giai đoạn Kết dương tính Sudan mẫu bệnh phẩm thường cũng cho kết dương tính với Peroxidaza Vì vậy nhuộm Sudan một tiêu chuẩn được dùng để phân loại thể bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB [21, 36] Hình 4.18 4.19 ảnh nhuộm Sudan bệnh nhân bạch cầu cấp lai lympho – tủy Hình 4.18, khoảng 45% tế bào blast cho kết dương tính mạnh, có nhiều hạt cục màu đen bào tương, chườm lên che kín tế bào được xác định dòng tủy, 55% tế bào blast được xác định dòng lympho cho kết âm tính Hình 4.19, tế bào blast cho phản ứng dương tính với Sudan yếu so với tế bào Hình 4.18 Các hạt dương tính bắt màu đen nhạt không che kín nhân tế bào Trên tiêu có tỷ lện lớn tế bào âm tính với Sudan, điều hoàn toàn phù hợp với định hướng ban đầu cho các tế bào dòng lympho Hình 4.18: Ảnh nhuộm Sudan B bệnh nhân Trương Thị T Hình 4.19: Ảnh nhuộm Sudan B bệnh nhân Trần Văn C Cùng với kỹ thuật nhuộm PAS, Peroxydaza, Sudan B, kỹ thuật nhuộm Esteraza có giá trị cao việc phân biệt tế bào blast dòng tủy dòng lympho Enzim Esteraza nguyên sinh chất tế bào bạch cầu người thủy phân chất este tạo thành dẫn xuất naphtol Naphtol tác dụng với muối điazo thành phẩm màu azo Phản ứng dương tính có màu đỏ nguyên sinh chất tế bào [31, 41, 46] Dưới một số ảnh nhuộm Esteraza bệnh nhân thể lai lympho-tủy: Hình 4.20 4.21, tế bào thể lai dương tính với Esteraza đặc hiệu bắt màu đỏ tế bào dòng tủy Các tế bào lai âm tính mang tính chất dòng lympho 47 Hình 4.20: Ảnh nhuộm Esteraza đặc hiệu bệnh nhân Trương Thị T Hình 4.21: Ảnh nhuộm Esteraza đặc hiệu bệnh nhân Trần Văn C Qua phản ứng nhuộm ở trên, một tiêu tủy vừa có tế bào blast nhuộm dương tính với dòng lympho (PAS) tế bào blast nhuộm dương tính với dòng tủy (Peroxidaza, SudanB Esteraza đặc hiệu), điều chứng tỏ mẫu tủy xuất tế bào blast hai dòng tủy lympho thế được gọi thể lai lympho-tủy Phản ứng esteraza không đặc hiệu không đặc hiệu ức chế NaF để phân định dòng mono dòng hạt Hình 4.22 4.23 hình ảnh nhuộm bệnh nhân bạch cầu cấp thể lai lympho – tủy Các tế bào thể lai lympho-tủy không bị ức chế bởi chất chứa NaF Hình 4.22: Ảnh nhuộm Esteraza không đặc hiệu ức chế NaF Trương Thị T Hình 4.23: Ảnh nhuộm Esteraza không đặc hiệu bệnh nhân Trần Văn C 48 4.2.3 Đánh giá mức độ phù hợp phân loại thể bệnh kít nhuộm đồng HICYTEC so với kết quả chẩn đoán xác định Viện Huyết học-Truyền máu trung ương Kết phân loại thể bệnh tại Viện Huyết học-Truyền máu trung ương dựa phương pháp: hình thái học-hóa học tế bào, miễn dịch học di truyền học cho thấy thể bạch cầu cấp dòng lympho, thể bệnh L2 chiếm tỷ lệ cao (92%) không gặp trường hợp thể L3 Mức độ phù hợp phân loại thể bệnh theo phương pháp hình thái học-hóa học tế bào kít nhuộm đồng bộ HICYTEC so với kết chẩn đoán xác định Viện Huyết học-Truyền máu trung ương dựa phương pháp: miễn dịch, di truyền hình thái học-hóa học tế bào đạt 100% đối thể từ L1-L3 theo tiêu chuẩn FAB 100% trường hợp thể lai lympho-tủy (xem bảng 3.7 - 3.8) Tính chung thì độ phù hợp đạt 100% so với kết luận bệnh Viện Huyết học-Truyền máu trung ương Kết cao so với nghiên cứu Trần Ngọc Vũ cộng (2014) sử dụng phương pháp nhuộm: Peroxidaza, sudan B, PAS esteraza không đặc hiệu tự pha thì độ nhạy dòng tủy 94,34% độ đặc hiệu 66,67% giá trị dự báo phân loại dòng tủy 89,29% Đối với bệnh bạch cấu cấp dòng lympho thì độ nhạy 100%, độ đặc hiệu 73,77%, giá trị dự báo phân loại dòng lympho 88,88% Sự phù hợp chẩn đoán giữa hình thái-hóa học tế bào miễn dịch tế bào 89,10% [19] 4.3 Kết quả nhuộm photphataza axit phân loại dòng tế bào lympho B và T Photphataza axit bạch cầu (Naphtol AS-BI acid phosphatase-NAP) enzym xúc tác cho phản ứng thủy phân nhóm photphat NAP có mặt nhiều lysosom nhiều loại tế bào máu dòng tủy, lympho, tương bào, dòng tiểu cầu, dòng mono [36] Đối với dòng bạch cầu lympho T dương tính với nhuộm NAP cao lympho B Hoạt tính NAP tăng tế bào lympho chuyển dạng kích thích Kỹ thuật giúp phân loại tế bào B đặc biệt dạng Hairy cell [21] Phophataza axit dương tính mạnh bệnh bạch cầu cấp dòng lympho loại hairy cell, tế bào liên võng, hủy cốt bào nguyên mẫu tiểu cầu Dòng hồng cầu, mono, lympho dòng tủy từ nguyên tủy bào đến tiền tủy bào cho kết âm tính [31, 33] Hình 4.24 ảnh chụp qua kính hiển vi với độ phóng đại 1.000 lần bệnh cho thấy tế bào lympho T bắt màu dương tính mạnh nhuộm photphataza axit 49 bạch cầu ở điều kiện nhuộm tối ưu với nồng độ chất naphtol AS-BI photphat 0,35mg/ml, muối fast blue BB 0,30mg/ml ở pH=5,2 [14] Hình 4.24: Ảnh nhuộm photphataza axít Các tế bào bạch cầu lympho có photphataza axít dương tính không thấy hạt giả túc dạng tế bào tóc được xác định thuộc dòng tế bào lympho T, tế bào dương tính với Photphataza dạng giả túc được xác định tạo cốt bào- tế bào tham gia vào trình liền xương[48] (xem hình 4.24) Bảng 3.9 cho thấy, tỷ lệ bệnh bạch cầu cấp lympho dòng B (80%) cao so với dòng T (20%) Kết tương tự so với công bố tác giả C H Pui [43], cao so với nghiên cứu Bùi Ngọc Lan (2007) tỷ lệ dòng lympho B chiếm 70,1%, dòng lympho T chiếm 25,8% [8] Theo phân loại hình thái học, ghi nhận có ba nhóm: Bạch cầu cấp dòng tủy (52,6%), bạch cầu cấp dòng lympho (39,5%), bạch cầu cấp lai lympho - tủy (7,9%) Tủy đồ có hạn chế không thể phân biệt được dòng B T kỹ thuật miễn dịch tế bào Trong đó dựa vào hóa học tế bào nhuộm photphataza axit bạch cầu có thể phân loại được dòng tế bào lympho B T Điều có ý nghĩa lớn cần thiết cho các bác sĩ việc chẩn đoán, tiên lượng bệnh lựa chọn phác đồ điều trị 50 4.4 Nhuộm photphataza kiềm bệnh nhân bạch cầu cấp Photphataza kiềm bạch cầu dương tính dòng tủy từ hậu tủy bào đến bạch cầu hạt Tế bào trưởng thành mức độ dương tính mạnh Ngoài tế bào tạo cốt bào cũng cho phản ứng dương tính kỹ thuật nhuộm Trong bệnh bạch cầu kinh dòng tủy, thiếu máu tan máu hoạt tính photphataza kiềm bạch cầu giảm; tăng nhiễm khuẩn cấp, lách to sinh tủy, phản ứng giả bạch cầu [3, 25, 31, 36, 37] Dưới ảnh nhuộm Photphataza kiềm bạch cầu người: Hình 4.25: Ảnh nhuộm photphataza kiềm Hình 4.25 ảnh chụp qua kính hiển vi với độ phóng đại 1.000 lần nhuộm photphataza kiềm cho thấy bạch cầu dương tính bắt màu đỏ trên nhân lympho màu xanh Ở điều kiện nhuộm tối ưu pH=8,6; Naphtol AS-BI photphat: 0,10 mg; muối điazo: 0,17 mg Kết ở Bảng 3.10 cho thấy trường hợp bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho có điểm nhuộm photphataza kiềm bạch cầu 146, tiên lượng tượng nhiễm trùng Photphataza kiềm dùng để phân biệt bệnh bạch cầu tủy cấp mạn tính đánh giá mức độ nhiễm trùng Theo tác giả Hayhoe, Hammouda Tanzer, hầu hết các trường hợp bệnh nhân bạch cầu kinh dòng tủy thì điểm nhuộm photphataza kiềm bạch cầu giảm mạnh [31] Điều có ý nghĩa lớn cho bác sỹ lâm sàng việc tiên lượng theo dõi tiến triển bệnh để đưa phác đồ điều trị 51 4.5 Nhuộm Perls bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho Sắt một vi chất quan trọng tham gia cấu tạo hemoglobin Tuy nhiên, nhiều sắt thể dẫn đến tình trạng tải sắt-một tích tụ sắt nếu không điều trị kịp thời có thể phá hủy quan gan, tim, tuyến tụy, tuyến nội tiết khớp Hạt sắt có thể thấy ở nguyên hồng cầu tủy xương người bình thường lượng sắt thừa, chưa không kết hợp để tạo nên Hem, song không bao giờ thấy ở hồng cầu trưởng thành ở máu ngoại vi người lành Tuy nhiên, bệnh thiếu máu ứ sắt sau cắt lách lại thấy nhiều hồng cầu chứa hạt sắt ở máu ngoại vi xuất nguyên hồng cầu sắt, tế bào lưới nội mô sắt tủy xương Nhuộm Perls có thể phát nguyên hồng cầu sắt tế bào lưới nội mô sắt [41, 46] Hồng cầu chứa hạt sắt cho phản ứng dương tính với thuốc thử gắn màu bởi Kali Feroxianua, biểu hạt bắt màu ưa kiềm (xem hình 4.26) Qua bảng 3.11 cho thấy chọc tủy lần đầu bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho gặp 3,3% có tế bào lưới nội mô sắt Theo Elisabeth Rybo cs tế bào lưới nội mô sắt có giá trị theo dõi tình trạng ứ sắt tốt so với nguyên hồng cầu sắt [28] Hình 4.26: Ảnh nhuộm Perls tế bào lưới nội mô sắt 52 KẾT LUẬN Sử dụng bộ kít nhuộm hóa học tế bào HICYTEC đồng bộ 10 kỹ thuật để phân loại thể bệnh chẩn đoán bệnh bạch cầu cấp dòng lympho 202 mẫu tủy bệnh nhân chọc tủy lần đầu chưa điều trị có triệu chứng nằm tiêu chuẩn mặt lâm sàng được chẩn đoán bệnh bạch cầu cấp, đề tài thu được kết sau:  Tỷ lệ mắc bệnh bạch cầu cấp 31,2%, đó cao bạch cầu cấp dòng tủy chiếm 52,4%, bạch cầu cấp dòng lympho chiếm 39,7% ( đó 20% mẫu tủy photphataza axit dương tính định hướng dòng lympho T, 80% định hướng lympho B) thấp bạch cầu cấp lai lympho - tủy chiếm 7,9% Bạch cầu cấp dòng lympho chủ yếu ở trẻ em chiếm 60% có tỷ lệ nam giới mắc bệnh cao nữ giới, nam/nữ = 1,3  Đã đánh giá được giá trị sử dụng bộ kít phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho theo tiêu chuẩn FAB đạt được phù hợp 100% so với kết chẩn đoán Viện Huyết học - Truyền máu trung ương phương pháp hình thái học, miễn dịch di truyền Có trường hợp bạch cầu cấp thể lai lympho-tủy, mức độ phù hợp chẩn đoán cũng đạt 100%  Đã đánh giá được giá trị gia tăng thêm cho mục đích chẩn đoán khác Không có trường hợp bệnh bạch cầu cấp dòng lympho có điểm nhuộm photphataza kiềm tăng 146; gặp 3,3% mẫu tủy có tế bào lưới liên võng sắt Bộ kít nhuộm đồng bộ HICYTEC 10 kỹ thuật một lúc giờ rút ngắn được thời gian chẩn đoán, vừa dễ triển khai vừa đảm bảo chất lượng nhuộm Với giá thành khoảng 300.000 đ giá marker (CD) 1/10 giá xét nghiệm gen (3.200.000 đ) tiết kiệm chi phí chữa bệnh cho bệnh nhân 53 KIẾN NGHỊ Bộ kít nhuộm đồng bộ bước thời gian giờ nên tiết kiệm chi phí, dễ triển khai, lúc có thể cho nhiều mục đích chẩn đoán khác Nên đưa bộ kít nhuộm hóa học tế bào HICYTEC thức phục vụ chẩn đoán dòng tế bào thể bệnh ở bệnh viện tuyến tỉnh điều kiện làm xét nghiệm marker di truyền để giảm tải cho bệnh viện tuyến trung ương 54 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Trần Văn Tính, Vũ Thị Thủy, Lê Thị Thanh Thủy, Ngô Thị Thảo, Đoàn Văn Thuyết, Bùi Phương Thuận (2015), “Đánh giá kết bộ kít nhuộm HICYTEC chẩn đoán các bệnh bạch cầu bệnh nhân chọc tủy lần đầu tại viện Huyết học-Truyền máu trung ương”, Đã được nhận đăng Tạp chí y học thành phố Hồ Chí Minh, tập 19 (4) - (có phản biện kèm theo) 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Thị Minh An, Phạm Quang Vinh, Vũ Thị Minh Châu cộng (1995), “Tình hình bệnh lơ xê mi cấp ở một số bệnh viện địa phương bệnh viện bạch mai”, Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học, Đại học Y Hà Nội, tr 185-192 Đỗ Thị Vinh An, Phạm Quang Vinh, Phan Văn Chi, Nguyễn Thị Bích Nhi (2010), “Bước đầu tìm hiểu một số biến đổi protein ở bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng lympho tại khoa Huyết học Truyền máu bệnh viện Bạch Mai”, Tạp chí Y học Việt Nam tập 373, tr 267-270 Bộ môn Huyết học-Truyền máu (1984), Kỹ thuật xét nghiệm huyết học truyền máu, NXB Y học, Hà Nội Nguyễn Trọng Biểu, Từ Văn Mặc (1978), Thuốc thử hữu cơ, NXB KHKT, Hà Nội Trần Thị Hồng Hà (2004), “Nghiên cứu đặc điểm, giá trị số yếu tố sinh học lâm sàng trẻ em bị lơ xê mi cấp dòng lympho bệnh viện nhi Trung ương”, Luận án tiến sỹ Y học, Đại học Y Hà Nội Trần Thị Minh Hương, Đỗ Trung Phấn (2002), “Tình hình bệnh máu tại Viện Huyết học truyền máu, bệnh viện Bạch Mai”, Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học Huyết học Truyền máu 1999-2000, Nhà xuất Y học, tr 1524 Nguyễn Công Khanh, Dương Bá Trực, Đỗ thị Minh Cầm cộng (1987), “Phân loại bệnh lơ xê mi cấp ở trẻ em”, Y học Việt Nam, số 140, tr 28-32 Bùi Ngọc Lan (2007), “Nghiên cứu lâm sàng, cận lâm sàng bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho điều trị thể nguy không cao trẻ em”, Luận án tiến sỹ Y học, Đại học Y Hà Nội Lâm Thị Mỹ, Trần Thái Bình, Nguyễn Thanh Hưng, Huỳnh Nghĩa (2004), “Đặc điểm bệnh bạch cầu cấp ở khu vực phía Nam năm 2002-2003”, Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh, 1(8), tr 98-102 10 Đỗ Trung Phấn (2008), Tế bào gốc bệnh lý tế bào gốc tạo máu, NXBYH, Hà Nội 11 Đỗ Trung Phấn (2008), “Lơ xê mi cấp”, Bệnh lí tế bào nguồn, NXB Y học, tr 96 - 107 12 Đỗ Trung Phấn (2008), “Sinh máu”, Bệnh lí tế bào nguồn, NXB Y học, tr 13-17 13 Trần Văn Tính, Phan Thị Trang, Nguyễn Anh Trí, Lưu Văn Bôi (2011), “Tổng hợp nghiên cứu ảnh hưởng hiệu ứng không gian phản ứng 56 nhuộm esteraza đặc hiệu tế bào bạch cầu người N-thế-3cacbamoylnaphthalen-2-yl α-clocacboxylat”, Tạp chí Hóa học tập 49 (6), tr 725-732 14 Trần Văn Tính (2014), “Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ chất, pH, muối điazo phản ứng nhuộm photphataza axit”, Tạp chí Y học thực hành, số 05, tr.29-30 15 Nguyễn Hữu Toàn (1999), Nghiên cứu phân loại leukemia cấp người lớn, rối loạn tạo máu tế bào miễn dịch thể M1, M2, M3, Luận án tiến sĩ y dược, Học viện Quân y 16 Nguyễn Triệu Vân, Nguyễn Quang Tùng, Nguyễn Anh Trí, Đỗ Trung Phấn cộng (2004), “Giá trị một số dấu ấn miễn dịch (marker) chẩn đoán phân loại lơ xê mi cấp dòng lympho người lớn tại Viện Huyết học truyền máu”, Y học Thực hành, số 497, tr 27-29 17 Phan Nguyễn Thanh Vân, Nguyễn Tấn Bỉnh (2006) “Triển khai kỹ thuật FISH RT-PCR nhằm phát bất thường nhiễm sắc thể gen bệnh lý huyết học tại bệnh viện Truyền máu Huyết học thành phố Hồ Chí Minh” Tạp Chí Y Học Thực Hành, tập 545, tr 73-79 18 Phạm Quang Vinh (2003), “Các biến đổi nhiễm sắc thể bệnh nhân lơ xê mi cấp Viện Huyết học- Truyền máu, bệnh viện Bạch Mai”, Luận án Tiến sỹ Y học 19 Trần Ngọc Vũ, Nguyễn Duy Thăng, Phan Thị Thu Hoa, Trần Thị Phương Túy, Phan Hoàng Duy, Ngô Tứ Cương, Hoàng Thị Thanh Trang, Tôn Nữ Trà Mai (2014), “Nghiên cứu ứng dụng hóa học tế bào giá trị bổ sung dấu ấn miễn dịch chẩn đoán, phân loại lơ xê mi cấp”, Tạp chí Y học Việt Nam, tập 423, tr 189-195 20 Asa Barnes (1994), Acute leukemias: The F.A.B classification and more, Resource exchange intern'l-Vietnam 21 Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT, et al (1976), "Proposals for the classification of the acute leukaemias French-American-British (FAB) cooperative group", Br J Haematol 33 (4), pp.451–458 22 Brennan ML, Penn MS, Van Lente F, Nambi V, Shishehbor MH, Aviles RJ, Goormastic M, Pepoy ML, McErlean ES, Topol EJ, Nissen SE, Hazen SL (2003), "Prognostic value of myeloPeroxidaza in patients with chest pain", 57 N Engl J Med 349 (17), pp 1595–604 23 Burstone, M S (1957), “Esteraza activity of developing bones and teeth”, A M A Arch Path Vol 60, pp 164 – 167 24 Craig F E., Foon K A (2008) "Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms" Blood, 111 (8), pp 3941-67 25 David Swirsky and Barbara J Bain (2006), Practical Haematology, Churchill Livingstone, Hong kong 26 Dissing J, Svensmark O (1990), "Human red cell acid photphataza: purification and properties of A, B and C isozymes", Biochim Biophys Acta vol 1041, pp 232–42 27 Drexler HG (1987) "Classification of acute myeloid leukemias-a comparison of FAB and immunophenotyping" Leukemia, (10), pp 697705 28 Elisabeth Rybo and Calle Bengtsson (1985), "Sideroblast count and examination of bone marrow reticuloendothelial iron in the diagnosis of iron deficiency", Scandinavian Journal of Haematology, Vol 34(S43), pp 77–85 29 Estey E, Dohner H (2006) "Acute myeloid leukaemia" Lancet, 368 (9550), pp 1894-907 30 Gignac SM, Hu ZB, Denkmann SA, Uphoff CC, Drexler HG (1996), “Esteraza isoenzyme profiles of 255 leukemia-lymphoma cell lines from all hematopoietic cell lineages”, Leuk lymphoxítsm Vol 22, pp 143-151 31 Hayhoe FGJ, Quaglino D (1994), Haematological cytochemistry, Edinburgh Churchill Livingstone, London 32 Ian M Hann; Owen P Smith (2006), Pediatric hematology, WileyBlackwell, USA 33 Janice R Connor, Robert A Dodds, Ian E James, Maxine Gowen (1995), “Human osteoclast and giant cell differentiation, The apparent switch from nonspecific esteraza to tartrate resistant acid photphataza activity coincides with the in situ expression of osteopontin mRNA”, J Histochemistry and Cytochemistry Vol 43 (12), pp 1193-1201 34 Jeanette E Stok, Andrey Goloshchapov, Cheng Song, Craig E Wheelock, 58 Maher B.H Derbel, Christophe Morisseau, Bruce D Hammock (2004), “Investigation of the role of a second conserved serine in carboxylesterazas via site-directed mutagenesis”, Archives of Biochemistry and Biophysics Vol 430, pp 247–255 35 John P Greer, John Foerster, George M Rodgers, Frixos Paraskevas, Bertil Glader, Daniel A Arber, Robert T Means, Jr (2009), Wintrobe’s clinical hematology Vol 1, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, USA 36 John V Dacie; S.M Lewis (1994), Practical Haematology, Longman Group Ltd, Hong Kong 37 Joseph Chayen, Lucille Bitensky (1994), Practical histochemistry, Wiley, London 38 Kantarjian HM., Deisseroth A., Kurzrock R., Estrov Z., Talpaz M (1993) "Chronic myelogenous leukemia: a concise update" Blood, 82, pp 691-703 39 Leong A S-Y, Cooper K, Leong, FJ W-M (2003), Manual of Diagnostic Antibodies for Immunohistology, Greenwich Medical Media, London, pp 325–326 40 Mathy-Hartert M, Bourgeois E, Grülke S, Deby-Dupont G, Caudron I, Deby C, Lamy M, Serteyn D (1998), "Purification of myeloPeroxidaza from equine polymorphonuclear leucocytes", Can J Vet Res, vol 62 (2), pp 127–132 41 Merck (1995), Enzyme cytochemistry Leucognost/HematoGnost Fe; Working intructions for simpified cytochemical staining for differentiation of leukaemias and myelodysplastic syndromes, E.Merck, D-64271 Darmstadt 42 Moe W., Kazutaka K., Yasushi M et al (2008), “Diagnosis of acute myeloid leukemia according to the WHO classification in the Japan adult leukemia study group AML-97 protocol”, International Journal of Hematology Vol 87 (2), pp 144-151 43 Pui C.H., Robinson L.L., Look A.T., (2008) “Acute lymphoblastic leukemia”, Lancet, 371(9617), pp 1030-1072 44 Pui C.H., Sallan S., Relling M.V., Masera G., Evans W.E (2001), “International Childhood Acute Lymphoblastic Leukemia”, Leukemia, 15, 59 pp 707-715 45 Rebecca Siegel MPH, Deepa Naishadham MA, MS and AhmedinJemal DVM, PhD (2015), Cancer statistics, CA Cancer J Clin, vol 65(1), pp 5–29 46 Sigma (2006), Accustain iron stain, Procedure No HT20, Revised 2014-09, United Kingdom 47 Sigma-Aldrich (2008), Hematology & Histiology, Product guide, USA 48 Sigma (2014), Lymphocyte enzyme, Procedure No 181, Revised 2014-09, USA 49 William H Emig (1941), Stain technique, The Science press printing company lancaster 60 ... học -hóa học tế bào, marker CD, di truyền để phân loại dòng tế bào lympho thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho theo tiêu chuẩn FAB 14 Bảng 1.3: Phân loại tế bào lympho thể bệnh theo FAB. .. tiêu đề tài là: Đánh giá giá trị sử dụng bộ kít nhuộm hóa học tế bào đồng bộ HICYTEC 10 kỹ thuật phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho theo tiêu chuẩn FAB Nội dung nghiên cứu:... Bảng phân loại bạch cầu cấp dòng lympho theo độ tuổi 34 Bảng 3.7: Kết phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho 35 Bảng 3.8: Kết phân loại thể bệnh bạch cầu cấp lai lympho- tủy