Tinh chế albumin trứng sử dụng trong dược phẩm

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Thành phần và tỷ lệ phần trăm khối lượng một số protein Bảng 2.2 Công thức chuẩn bị mẫu điện di 23 Bảng 3.1 Kết quả khảo sát các phương pháp tinh chế

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

Khóa: QH.2012.Y

Người hướng dẫn:

1 PGS.TS Nguyễn Thanh Hải

2 ThS Nguyễn Văn Khanh

Hà nội – 2017

LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với PGS.TS Nguyễn Thanh Hải và Ths Nguyễn Văn Khanh, hai người thầy đã hết lòng hướng dẫn

và giúp đỡ tôi thực hiện và hoàn thành khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các anh chị kĩ thuật viên thuộc

bộ môn Bào chế và Công nghệ dược phẩm đã nhiệt tình giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong quá trình học tập và thực nghiệm tại bộ môn

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, phòng Đào tạo, bộ môn Bào chế và Công nghệ dược phẩm, các bộ môn, ban phòng liên quan trong nhà trường, các anh chị ở viện Dược liệu, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ đã tạo điều kiện về cơ sở vật chất, trang thiết bị và hóa chất thí nghiệm trong quá trình tôi thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè, những người đã luôn giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập cũng như hoàn thành khóa luận

Hà Nội, tháng 5 năm 2017 Sinh viên

Trần Thị Thúy

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

ABS Aqueous Biphasis System (Hệ 2 pha thân nước)

ACE Angiotensin I Converting Enzym (Enzym chuyển hóa

angiotensin I)

UF Ultra Filtration (Siêu lọc)

BCA Bicinchoninic Acid

BMBC Bộ môn bào chế

dd Dung dịch

EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid

HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc kí lỏng hiệu

năng cao) NSX Nhà sản xuất

OVA Ovalbumin

PEG Polyethylen Glycol

SDS Sodium Dodecyl Sulfat

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfat Polyacrylamid gel elecphoresis (Điện di

trên gel polyacrylamid sử dụng natri dodecyl sulfat) v/v Thể tích/Thể tích

w/v Khối lượng/Thể tích

WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Thành phần và tỷ lệ phần trăm khối lượng một số protein

Bảng 2.2 Công thức chuẩn bị mẫu điện di 23

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát các phương pháp tinh chế ovalbumin

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất tinh chế

Bảng 3.3 Kết quả đánh giá độ tinh khiết của ovalbumin 31

Bảng 3.4 Hiệu suất tinh chế và độ tinh khiết của ovalbumin với

quy mô tinh chế 300 g lòng trắng trứng 34

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 2.1 Sơ đồ tinh chế albumin trứng bằng phương pháp điều

Hình 2.4 SDS phá vỡ cấu trúc dạng cuộn xoắn của protein 22

Hình 2.5 DDT đóng vai trò phá vỡ các liên kết disulfid 23

Hình 3.1 Sản phẩm đông khô thu được từ các phương pháp tinh

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ biến tính lên hiệu suất tách và

Hình 3.5 Hoàn thiện quy trình tinh chế ovalbumin từ lòng trắng

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ……… ……… 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN……… 2

1.1 Sơ lược về lòng trắng trứng……… 2

1.1.1 Thành phần……… ……… … …… 2

1.1.2 Các protein chính trong lòng trắng trứng.….………….……….… 3

1.1.3 Vai trò sinh học và giá trị của các thành phần lòng trắng trứng đối với sức khỏe con người……… …… ………… 5

1.2 Ovalbumin……… 8

1.2.1 Cấu trúc và một số tính chất đặc trưng của ovalbum… ………… 8

1.2.2 Một số đặc tính của ovalbumin có tiềm năng nghiên cứu sử dụng trong Dược phẩm……… …….………….………… … … ………… … 9

1.2.3 Các phương pháp đánh giá ovalbumin……….… … 10

1.2.4 Các nghiên cứu tinh chế ovalbumin từ lòng trắng trứng …… … 11

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 14

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị……… 14

2.1.1 Nguyên vật liệu………….……….…….……… 14

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu………… ………….……… …… 14

2.2 Nội dung nghiên cứu……… 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu……… 15

2.3.1 Phương pháp tinh chế albumin trứng……….…….….…15

2.3.2 Phương pháp đánh giá……….……… 20

2.3.3 Phương pháp xử lí số liệu……… ………… 24

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN…… ……… 25

3.1 Khảo sát các phương pháp tinh chế albumin trứng……… 25

3.2 Tinh chế ovalbumin bằng cách loại từng bước các protein có trong lòng trắng trứng và đánh giá một số chỉ tiêu của ovalbumin tinh chế được……… 27

3.2.1 Định tính sản phẩm tinh chế……… ……… 27

3.2.2 Hiệu suất tinh chế ovalbumin……….……… 29

3.2.3 Độ tinh khiết của ovalbumin………… ……… 30

3.3 Nâng cấp quy mô……… ………… ……… 34

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trứng từ lâu đã trở thành một phần thiết yếu trong chế độ ăn của con người, là một trong số những thực phẩm được sử dụng phổ biến trên toàn thế giới Mặc dù chứa đến 74% là nước, trứng vẫn là nguồn nguyên liệu dồi dào cung cấp protein, acid béo, sắt, phospho, khoáng chất và các vitamin quan trọng cho cơ thể Lòng trắng trứng chứa khoảng 9,7-11% protein, gồm các protein chính như ovalbumin, ovotransferrin, lysozym và ovomucin Ngoài ra, các protein lòng trắng trứng còn chứa những đặc tính chức năng quan trọng như tạo gel, tạo bọt, nhũ hóa, và đông tụ bởi nhiệt, khiến chúng trở thành một phụ gia hữu ích đối với nền công nghiệp thực phẩm [2,18,21-24]

Là protein chính chiếm hơn một nửa lượng protein khô của lòng trắng trứng, ovalbumin có hầu hết các tính chất và đặc tính chức năng của lòng trắng trứng Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu cho thấy một vài hoạt tính sinh học có liên quan đến albumin trứng như hoạt tính kháng vi sinh vật, điều hòa miễn dịch, và tiềm năng ứng dụng như một chất mang thuốc, cho thấy sự cần thiết trong việc phân lập và tinh chế ovalbumin từ phức hệ các protein của lòng trắng trứng [18,23]

Albumin trứng (ovalbumin) được phân tách đầu tiên từ lòng trắng trứng bằng phương pháp sử dụng amoni sulfat nồng độ cao Trong nhiều thập kỉ qua, nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng để tinh chế ovalbumin như công nghệ màng lọc UF, sắc kí trao đổi ion, sắc kí rây phân tử, hệ ABS… [2,28] Các phương pháp này yêu cầu các thiết bị kĩ thuật đắt tiền đồng thời một số phương pháp phải được tiến hành qua nhiều giai đoạn phức tạp Do vậy, chúng tôi thực

hiện đề tài “Tinh chế albumin trứng sử dụng trong dược phẩm” với 2 mục tiêu

chính:

- Tinh chế ovalbumin từ lòng trắng trứng

- Đánh giá một số chỉ tiêu của ovalbumin tinh chế được

2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Sơ lược về lòng trắng trứng

1.1.1 Thành phần

Trứng bao gồm khoảng 9,5% vỏ trứng (bao gồm màng vỏ), 63% albumen (lòng trắng) và 27,5% lòng đỏ [21] Thành phần chính của trứng là nước (75%), protein (12%), lipid (12%), còn lại là carbohydrat, khoáng chất và một số vitamin (A, E, K và B) [18,23]

Protein phân bố ở cả lòng đỏ và lòng trắng trứng, trong khi đó lipid phân

bố chủ yếu ở lòng đỏ Một vài khoáng chất được tìm thấy trong vỏ trứng [22] Carbohydrat và các thành phần thứ yếu khác phân bố khắp các bộ phận của quả trứng, tồn tại ở cả dạng tự do và dạng liên hợp, liên kết với protein và lipid [23]

Lòng trắng trứng chiếm hơn một nửa (khoảng 60-63%) tổng khối lượng quả trứng Hai thành phần chính cấu tạo nên lòng trắng trứng bao gồm nước (chiếm khoảng 88%) và protein (khoảng 9,7-11%) Carbohydrat chiếm khoảng 0,5-0,6%, lượng lipid có trong lòng trắng trứng chỉ chiếm khoảng 0,01%, không đáng kể so với lượng lipid có trong lòng đỏ [21]

Protein là thành phần chính quyết định các đặc tính lý hóa và sinh học của lòng trắng trứng Trong nhiều thập kỉ qua, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành

để nhận biết, phân tách và định lượng các protein có trong lòng trắng trứng Protein chiếm khối lượng lớn nhất trong tổng số protein lòng trắng trứng là ovalbumin (54%) Cùng với ovalbumin, ovotransferrin (12%), ovomucoid (11%), ovomucin (3,5%) và lysozym (3,4%) được xem là những protein chính của lòng trắng trứng Các protein khác cũng đã được nhận biết và định lượng bao gồm ovoinhibitor, ovoglycoprotein, ovoflavoprotein, ovomacroglobulin (ovostatin), cystatin, avidin… [18]

1.1.2 Các protein chính trong lòng trắng trứng

Lòng trắng trứng chứa từ 9,7-11% protein, được xem như một hệ thống các protein hình cầu trong dung dịch thân nước Các protein chiếm thành phần nhiều nhất và tạo nên các tính chất đặc trưng của lòng trắng trứng bao gồm: ovalbumin, ovotransferrin, ovomucoid, ovomucin và lysozym

Ovalbumin là một mono phosphoglycoprotein hình cầu, khối lượng phân

tử 45 kDa, điểm đẳng điện pI = 4,5, được cấu tạo từ 386 amino acid Nghiên cứu của Osuga và Feeney năm 1977 và Zabik năm 1992 cho thấy ovalbumin tồn tại ở

4

3 dạng A1, A2, A3 với tỷ lệ 85:12:3, chứa số nhóm phosphoryl tương ứng là 2, 1

và 0 Ovalbumin bị biến tính tại nhiệt độ 84oC [2,5]

Ovotransferrin là một mono glycoprotein cấu tạo từ 686 amino acid với trọng lượng phân tử 77,7 kDa, điểm đẳng điện pI = 6,1 và biến tính ở nhiệt độ

61oC [21] Ovotransferrin có chuỗi amino acid giống với glucoprotein vận chuyển sắt trong huyết tương người và chiếm 12 % lượng protein của lòng trắng trứng Ovotransferrin tồn tại ở hai dạng cấu trúc chính: dạng apo- (không liên kết với kim loại) và dạng holo- có khả năng liên kết với kim loại Cấu trúc dạng holo- của ovotransferrin bền hơn với các tác nhân vật lý và hóa học Trước đây protein này được gọi tên là conalbumin nhưng đã được đổi thành ovotransferrin sau khi phát hiện thấy khả năng liên kết với sắt và tăng đề kháng với nhiệt, áp suất cũng như enzym thủy phân protein và các tác nhân biến tính khác [2]

Ovomucoid là một glycoprotein có khối lượng phân tử 28 kDa, điểm đẳng điện pI = 4,1 Ovomucoid chứa từ 20-25% carbohydrat và có khả năng chống chịu cao với nhiệt độ (nhiệt độ biến tính là 77oC) [21] Ovomucoid có hoạt tính

ức chế trypsin và được xem như một chất gây dị ứng có trong thực phẩm Tuy nhiên nghiên cứu của Osuga và Feeny cho thấy ovomucoid trong trứng ức chế trypsin bò nhưng không có hoạt tính ức chế đối với trypsin người [2,5]

Ovomucin là một glycoprotein, đây là protein đóng vai trò tạo nên đặc tính nhớt của lòng trắng trứng Khác với các protein khác, ovomucin có khối lượng phân tử lớn, trong khoảng 5,5-8,8 x 103 kDa và chứa một lượng lớn cystin nối với nhau bởi các liên kết liên phân tử Ovomucin chiếm 1,5-3,5% lượng protein lòng trắng trứng và có điểm đặng điện pI = 4,5-5,0 [5,21] Ovomucin tồn tại ở 2 dạng: α-ovomucin và β-ovomucin trong đó α-ovomucin có số nhóm carbohydrat

ít hơn dạng β do đó có khả năng hòa tan tốt hơn Ovomucin cũng chứa một lượng lớn nhóm disulfid và chứa tới 33% carbohydrat [5]

Lysozym là một enzym cấu tạo từ 129 amino acid với khối lượng lượng phân tử 14,2 kDa và điểm đẳng điện 10,7 Lysozym chứa 4 cầu nối disulfid dẫn đến khả năng đề kháng tốt với nhiệt, lysozym biến tính ở 75oC [15,29]

Điểm đẳng điện (pI)

Khối lượng phân tử (kDa)

Nhiệt độ biến tính (T d c ) ( o C)

1.1.3 Vai trò sinh học và giá trị của các thành phần lòng trắng trứng đối với

sức khỏe con người

Trứng từ lâu đã trở thành một phần quan trọng cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết trong chế độ ăn của con người Mặc dù chiếm đến 74% là nước, trứng vẫn là nguồn cung cấp các protein, acid béo, chất khoáng và các vitamin cần thiết cho cơ thể [34]

Quá trình chế biến, nấu chín thức ăn có liên quan đến đặc tính đông lại bởi nhiệt của protein trứng Các tính chất đặc trưng của các protein có trong lòng trắng như tạo gel, tạo bọt khiến chúng trở thành một thành phần hữu ích trong nhiều loại thực phẩm như mỳ phở, may-on-ne, các loại bánh, sản phẩm thịt chế biến sẵn và mứt, kẹo Đặc tính tạo gel khi đun nóng của các protein lòng trắng trứng được ứng dụng trong chế biến nhiều loại sản phẩm như các món tráng miệng, bánh pudding, thịt hộp, đậu phụ và surimi Khả năng tạo bọt cũng được

được tìm thấy trong lòng trắng trứng, có tác dụng ức chế Listeria monocytogens

và Clostridium botulinum, hai nguồn bệnh gây ra các vấn đề chính trong công

nghiệp thực phẩm [29] Ngoài ra, protein này có tác dụng kháng virus, kháng viêm và có nhiều hiệu quả chữa bệnh [18] WHO và nhiều quốc gia cho phép sử dụng lysozym như một chất bảo quản trong các loại thực phẩm như giấm kimuchi, sushi, pho mát và rượt vang Ovotransferrin được biết đến với hoạt tính kháng vi sinh vật mạnh, do đó có thể được sử dụng để tăng độ an toàn của thực phẩm Nghiên cứu của Babini và Livermore (2000) chỉ ra rằng ovotransferrin có

khả năng tăng cường hoạt động của pipercillintazobactam chống lại Escherichia coli và Streptococcus mutans [6] Ovomucin cho thấy hoạt tính ức chế tốt một số

vi khuẩn như E coli, Bacillus sp và Pseudomonas sp [33] Do đó cũng được sử

dụng như một phụ gia bảo quản trong thực phẩm Bên cạnh đó, nhờ có đặc tính nhũ hóa và tạo bọt, ovomucin còn được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp làm bánh [2]

Ngày nay, trứng là nguồn nguyên liệu được sử dụng trong rất nhiều lĩnh vực bao gồm cung cấp thực phẩm, sản xuất Dược phẩm và ứng dụng trong Y học Nhiều hoạt tính sinh học đã được phát hiện có liên quan đến các thành phần protein cấu tạo nên trứng, bao gồm khả năng kháng vi khuẩn và virus, khả năng điều chỉnh miễn dịch, chống ung thư, hạ huyết áp [23]

7

Bảng 1.3 Hoạt tính sinh học của các protein lòng trắng trứng [18,23]

Protein Hoạt tính sinh

Hoạt tính sinh học

Ovalbumin.)

Ovoinhibitor

Ức chế serin protease

Chống virus

Ovotransferrin

Kháng vi sinh vật

Kháng khuẩn của peptid OTAP-92

Điều hòa miễn dịch

Ovomacroglobulin

Ức chế các enzym serin, cystein, thiol, metallo protease

Kháng vi sinh vật

Ovomucoid

Ức chế serin protease

Điều hòa miễn dịch

Chất mang thuốc

Phối tử sinh học

Cystatin

Ức chế cystein protease

Kháng vi sinh vật Phòng ngừa khối

Kích thích miễn dịch

Phòng ngừa khối

u

8

1.2 Ovalbumin

1.2.1 Cấu trúc và một số tính chất đặc trưng của ovalbumin

Ovalbumin là một mono phosphoglycoprotein có khối lượng phân tử 45 kDa, cấu tạo từ 386 amino acid, điểm đẳng điện pI = 4,5 Ovalbumin được tổng hợp tại vòi trứng và cấu thành nên 54% tổng khối lượng khô của protein lòng trắng trứng [2] Đây là một protein dự trữ và là nguồn cung cấp acid amin chủ yếu cho phôi trứng đang phát triển [24]

Ovalbumin chứa 3,5% carbohydrat, có 4 nhóm Sulfhydric tự do và một cầu nối disulfid (Cys74-Cys121) [5] Cấu trúc bậc 2 của ovalbumin gồm 41% xoắn α, 34% phiến β và 12% nếp gấp β [26]

Cấu trúc 3-D của ovalbumin với một mạch xoắn ốc phản ứng α (màu vàng) và các phiến βA (màu đỏ) được mô tả trong hình 1.1

Hình 1.1 Cấu trúc 3-D của ovalbumin [17]

Trong quá trình bảo quản, ovalbumin dần chuyển thành S-ovalbumin là một dạng cấu trúc bền hơn với nhiệt và thường được xem là ovalbumin “bền”

Sự có mặt của S-ovalbumin đã được chứng minh bởi sự khác nhau về nhiệt độ

9

biến tính của 2 dạng cấu trúc này (92,5oC đối với S-ovalbumin và 84,5oC đối với ovalbumin gốc) S-ovalbumin đồng thời cũng cho thấy tính kị nước bề mặt cao hơn Lượng S-ovalbumin trong trứng tăng dần theo thời gian bảo quản, từ 5% ở trứng mới đẻ đến 81% sau 6 tháng bảo quản lạnh ở nhiệt độ 2oC Cấu trúc tinh thể của S-ovalbumin đã được xác định là không có sự khác biệt với cấu trúc bậc

2 của ovalbumin [5,15]

Các nghiên cứu cũng đã chỉ ra sự ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên sự chuyển đổi cấu trúc ovalbumin sang dạng S-ovalbumin Nghiên cứu của Alleoni năm 1977 cho thấy phần trăm S-ovalbumin khi bảo quản ở 8oC sau thời gian 7,

14 và 21 ngày lần lượt là 18, 26 và 24%; ở nhiệt độ bảo quản 25oC, lượng ovalbumin tương ứng sau 7 và 14 ngày là 56% và 60% Smith và Back nghiên cứu ảnh hưởng của pH lên sự chuyển đổi cấu trúc của ovalbumin và cho thấy 95% ovalbumin chuyển thành dạng S-ovalbumin ở pH 10, nhiệt độ 55oC trong

S-20 giờ Lượng S-ovalbumin chiếm tỷ lệ nhiều nhất ở pH 9,2 và ít nhất ở pH 7,9 [5]

1.2.2 Một số đặc tính của ovalbumin có tiềm năng nghiên cứu sử dụng trong

Các peptid tạo ra trong quá trình thủy phân ovalbumin nhờ các enzym tiêu

hóa được phát hiện là có hoạt tính chống lại Bacillus subtilus, E coli, Bordetella bronchiseptica, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens cũng như Candida albicans [23]

Ovalbumin cũng có tiềm năng là một chất điều hòa miễn dịch, ovalbumin cho thấy khả năng gây ra sự giải phóng yếu tố hoại tử u TNF-α trong nghiên cứu

in vitro, đồng thời các peptid có hoạt tính miễn dịch của ovalbumin được sử

dụng để tăng cường đáp ứng miễn dịch trong miễn dịch trị liệu ung thư Hoạt

10

động thực bào của đại thực bào cũng được tăng cường khi thêm peptid OVA

77-78 và OVA 126-134 [23]

Ovokinin, một peptid tách ra từ ovalbumin (OVA 358-365) và OV

359-364 cho thấy tác dụng làm giảm mạnh huyết áp tâm thu trong tăng huyết áp tự phát ở chuột Hai peptid ức chế enzym chuyển hóa angiotensin I (ACE) cũng được tìm thấy trong ovalbumin là peptic (OVA 183-184) và tryptic (OVA 200-218) [22,23] Nghiên cứu của Fujita và cộng sự năm 2000 tiến hành thủy phân ovalbumin với pepsin, trypsin và α-chymotrypsin cũng tạo ra 7 peptid ức chế ACE bao gồm LKA, LKP, LAP, IKW, FQKPKR, FKGRYYP và IVGRRHQG, trong đó một vài peptid đồng thời có tác dụng làm giảm nồng độ lipid trong máu [2]

So với các polyme protein khác, ovalbumin được lựa chọn là một công cụ dẫn truyền thuốc, đặc biệt trong kiểm soát phân bố thuốc nhờ tính chất dễ kiếm,

có nguồn gốc sinh học, giá thành rẻ, khả năng tạo gel, làm ổn định nhũ tương và nhạy cảm với pH, nhiệt độ [31]

1.2.3 Các phương pháp đánh giá ovalbumin

Phương pháp định lượng: Phương pháp đơn giản nhất để đo nồng độ

ovalbumin trong dung dịch là đo độ hấp thụ quang của protein này tại bước sóng hấp thụ cực đại Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp cũng thường được sử dụng để định lượng ovalbumin nhờ hiệu quả và tính chính xác cao Bên cạnh đó, ovalbumin cũng được định lượng bằng các phương pháp định lượng protein bao gồm: Phương pháp so màu (Biuret, Lowry, Bradford), phương pháp dùng acid bicinchoninic (BCA), phương pháp phân tích amino acid sau khi thủy phân protein, phương pháp định lượng nito Kjeldahl [32]

Phương pháp định tính: Để định tính ovalbumin, các phương pháp thường

được sử dụng là: HPLC, phương pháp điện di trên gel polyacrylamid, kĩ thuật miễn dịch ELISA [3,10,11,13,28]

11

Phương pháp đánh giá độ tinh khiết: HPLC, điện di SDS-PAGE

[3-4,10,13,28]

1.2.4 Các nghiên cứu tinh chế ovalbumin từ lòng trắng trứng

Ovalbumin là một trong những protein đầu tiên được tách ra từ lòng trắng trứng Nó được phân tách lần đầu tiên vào những năm 1900 bằng phương pháp

sử dụng dung dịch muối amoni sulfat nồng độ cao [8,14] Mặc dù được phân lập nhưng lượng muối sử dụng quá cao và độ tinh khiết của protein không được báo cáo Amoni sulfat bão hòa tiếp tục được sử dụng để tách ovalbumin bởi Warner

và Weber (1951) và Warner (1954) tuy nhiên độ tinh khiết của protein tách được

Năm 2009, Datta và cộng sự đã sử dụng công nghệ màng siêu lọc để tách ovalbumin từ lòng trứng gà Trong nghiên cứu này, hệ thống lọc 2 giai đoạn gồm một màng lọc polyether sulfon (PES) 30 kDa và một màng lọc PES 50 kDa được

sử dụng, đồng thời dung dịch lòng trắng trứng được pha loãng bằng dung dịch

Trong vài thập kỉ gần đây, phương pháp sử dụng hệ hai pha thân nước ABS (Aqueous Biphasic Systems) được nhiều nhà nghiên cứu thử nghiệm để tinh chế protein Saravan cùng cộng sự đã nghiên phân tách ovalbumin bằng hệ ABS poly(ethylenglycol) (PEG)-poly(acrylic acid) Kết quả cho thấy có 87,4% ovalbumin phân lập được [30] Năm 2016, Pereira cùng các cộng sự đã nghiên cứu tinh chế ovalbumin từ lòng trắng trứng sử dụng hệ ABS gồm một pha polyme là polyethylen glycol và pha dung dịch đệm kali citrat/acid citric, thu hồi 65% ovalbumin từ pha polyme [28] Nerli cùng cộng sự nghiên cứu nhiệt động học liên quan đến sự phân tách của ovalbumin trên một vài hệ hai pha thân nước khác nhau (được cấu tạo từ các PEG có khối lượng phân tử khác nhau và dextran), chỉ ra rằng quá trình chuyển ovalbumin lên pha trên là quá trình tỏa nhiệt, cho thấy có tương tác tĩnh điện giữa nhóm hydroxyl của PEG và chuỗi bên thân nước của protein [25] Hệ ABS gồm 16% (w/v) PEG 1000 và 17% (w/v) kali phosphat cũng đã được Zhi cùng các cộng sự sử dụng để tinh chế ovotransferrin, ovalbumin và lysozym từ lòng trắng trứng Nghiên cứu cho kết quả ovalbumin có độ tinh khiết cao (trên 95%) [35]

Abeyrathne cùng cộng sự đã tiến hành tách đồng thời ovalbumin, ovotransferrin, ovomucin và lysozym bằng các phương pháp khác nhau Lysozym được tách trong bước đầu tiên nhờ sử dụng nhựa trao đổi ion FPC3500 Phần dịch sau khi loại lysozym tiếp tục được điều chỉnh pH thích hợp để loại ovomucin Ovalbumin và ovotransferrin được tách khỏi dung dịch lòng trắng trứng đã loại lysozym và ovomucin bằng cách thêm vào dung dịch amoni sulfat

và acid citric (nồng độ amoni sulfat và acid citric trong dung dịch tương ứng là 5% (w/v) và 2,5% (w/v)) để thu hồi kết tủa chứa ovotransferrin và phần dịch

13

lỏng chứa ovalbumin Hiệu suất thu hồi ovalbumin và ovomucin là trên 98%, của ovotransferrin và lysozym là trên 82%, độ tinh khiết của các protein đều trên 90%, ngoại trừ ovomucin (80%) [3]

Tuy nhiên, phải thừa nhận rằng, phân tách và tinh chế ovalbumin từ một phức hợp như lòng trắng trứng là một nghiên cứu khó khăn do sự xuất hiện của rất nhiều protein khác nhau với các đặc tính tương tự nhau từ nguyên liệu thô

12 Coomassie brilliant blue Merck – Đức NSX

13 Trứng gà dưới 3 ngày tuổi Hà Nội An toàn thực

phẩm

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu

Thiết bị nghiên cứu:

- Máy ly tâm EBA 21 (HETTICH – Đức)

- Máy đo độ hấp thụ quang UV-2600 (SHIMADZU – Nhật Bản)

15

- Bể ổn nhiệt WB-5 (MRC – Israel)

- Máy đông khô Benchtop Manifold Freeze Dryers (USA)

- Thiết bị điện di AE-6500Dual ( ATTO – Nhật Bản)

- Hệ thống lọc tiếp tuyến Sartoflow Slice 200 Benchtop (SARTORIUS – Đức)

2.2 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu tinh chế albumin trứng (ovalbumin) với hiệu suất và

độ tinh khiết cao, nghiên cứu tiến hành thực hiện các nội dung sau:

- Nghiên cứu tinh chế ovalbumin từ lòng trắng trứng:

 Khảo sát một số phương pháp tinh chế ovalbumin dựa trên các đặc tính khác nhau của các protein có trong lòng trắng trứng

 Xây dựng quy trình tinh chế ovalbumin

- Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của ovalbumin thu được từ quy trình tinh chế

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp tinh chế albumin trứng

Nguyên lý chung: Các phương pháp sử dụng để tinh chế ovalbumin trong

nghiên cứu này đều liên quan đến tính chất hydrat hóa của protein trong dung dịch Trong quá trình hydrat hóa, protein tương tác với nước qua các nối peptid hoặc các gốc R ở mạch bên nhờ liên kết hydro Nồng độ protein, pH, nhiệt độ, thời gian, lực ion, và sự có mặt của một số thành phần khác (muối, acid ) ảnh hưởng đến các phản ứng protein-protein và protein-nước, do đó làm thay đổi đặc

tính tan hoặc không tan của protein trong dung dịch [1]

16

2.3.1.1 Tách albumin lòng trắng trứng bằng phương pháp thay đổi pH dung

dịch

Cơ chế: Protein là một chất điện ly lưỡng tính vì trong phân tử của protein

có nhiều nhóm phân cực mạnh (gốc R bên) của amino acid Trạng thái tích điện của các nhóm này phụ thuộc vào pH của môi trường, pH thay đổi dẫn đến thay đổi mức độ ion hóa và sự tích điện trên bề mặt các phân tử protein, làm thay đổi lực hút và đẩy giữa các phân tử này và khả năng liên kết với nước Tại pH bằng điểm đẳng điện pI, phản ứng protein-protein là cực đại, các phân tử protein dễ kết tụ lại với nhau và khả năng hydrat hóa và trương nở là cực tiểu Dựa vào tính chất này và sự khác nhau về điểm đẳng điện của các thành phần protein trong lòng trắng trứng để kết tủa một protein mong muốn (ovalbumin) bằng cách đưa

pH dung dịch về điểm đẳng điện pI của ovalbumin [1]

lòng trắng

trứng khỏi

lòng đỏ

Loại bỏ vật liệu màng không tan trong nước

Thu lấy kết tủa Ovalbumin

Đông khô, bảo quản 4oC