Xây dựng qui trình nhân nuôi và tinh chế virút dengue sử dụng trong sản xuất vắc xin sống giảm độc lực : Luận văn ThS. Sinh học: 84201

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HỒNG ĐỨC LỘC XÂY DỰNG QUI TRÌNH NHÂN NUÔI VÀ TINH CHẾ VIRÚT DENGUE SỬ DỤNG TRONG SẢN XUẤT VẮC XIN SỐNG GIẢM ĐỘC LỰC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 8420101.07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HỒNG ĐỨC LỘC XÂY DỰNG QUI TRÌNH NHÂN NI VÀ TINH CHẾ VIRÚT DENGUE SỬ DỤNG TRONG SẢN XUẤT VẮC XIN SỐNG GIẢM ĐỘC LỰC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 8420101.07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Đỗ Tuấn Đạt PGS TS Bùi Thị Việt Hà Hà Nội - 2018 LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Đỗ Tuấn Đạt, người tận tình giúp đỡ, hướng dẫn công việc suốt trình học tập, thực nghiên cứu luận văn thạc sĩ Tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS TS Bùi Thị Việt Hà – Bộ môn Vi sinh – Khoa Sinh học – Trường ĐH Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội, người bảo góp ý nhiệt tình giúp tơi hồn thành luận văn thạc sĩ Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy giáo, cô giáo Khoa Sinh học, đặc biệt thầy cô giáo môn Vi sinh vật học thuộc Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, tận tình giảng dạy, hướng dẫn suốt thời gian học tập Trường Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới anh chị bạn đồng nghiệp giúp đỡ tôi, chia sẻ kinh nghiệm kiến thức suốt thời gian thực nghiên cứu phịng Cơng nghệ Cao, Cơng ty TNHH MTV Vắc xin Sinh phẩm số Cuối cùng, tơi muốn cảm ơn gia đình, bạn bè ln bên khích lệ, động viên tơi suốt thời gian vừa qua Học Viên Hoàng Đức Lộc MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm virút Dengue 1.1.1 Đặc điểm hình thái phân loại 1.1.2 Cấu trúc phân tử protein chức 1.1.3 Quá trình lây nhiễm chép virút 1.1.4 Đáp ứng miễn dịch với virút dengue 1.2 Dịch tễ học bệnh sốt xuất huyết 12 Tình hình dịch tễ bệnh giới 12 Tình hình dịch tễ bệnh Việt Nam 16 Nguồn bệnh tự nhiên 18 Đường lây vector truyền bệnh 19 Đặc điểm lâm sàng cận lâm sàng bệnh sốt xuất huyết dengue 20 Các yếu tố ảnh hưởng 21 Các phương pháp phòng ngừa dịch bệnh 21 1.3 Tình hình nghiên cứu phát triển vắc xin phòng SXHD giới 24 Vắc xin sống, giảm độc lực 24 Vắc xin bất hoạt 27 Vắc xin tiểu đơn vị tái tổ hợp 28 Vắc xin DNA 29 1.4 Đặc điểm chủng vắc xin dengue tái tổ hợp sử dụng VABIOTECH 30 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 34 2.1 Vật liệu 34 2.1.1 Tế bào Vero 34 2.1.2 Các chủng virút dengue tái tổ hợp 34 2.1.3 Môi trường nuôi cấy dung dịch nghiên cứu 34 2.1.4 Các hóa chất sinh phẩm 35 2.1.5 Dụng cụ trang thiết bị 35 2.2 Phương pháp 37 2.2.1 Phương pháp cấy chuyển tế bào Vero từ điều kiện bảo quản nhân số lượng tế bào Vero chai nuôi lớp chai Cell factory 37 2.2.2 Phương pháp gây nhiễm nuôi cấy virút dengue tế bào 39 2.2.3 Phương pháp thu hoạch virút dengue sau gây nhiễm 40 2.2.4 Phương pháp ly tâm 40 2.2.5 Phương pháp lọc loại xác tế bào 41 2.2.6 Phương pháp xử lý DNA tế bào chủ enzyme benzonase 41 2.2.7 Phương pháp thẩm tích 42 2.2.8 Phương pháp chuẩn độ virút dengue tạo đám hoại tử 43 2.2.9 Phương pháp thử vô khuẩn 44 2.2.10 Phương pháp định lượng protein theo phương pháp Lowry 46 2.2.11 Phương pháp định lượng DNA tổng số phương pháp lai phân tử47 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 51 3.1 Xây dựng quy trình nhân ni virút dengue quy mơ phịng thí nghiệm.51 3.1.1 Liều gây nhiễm thời gian hấp phụ virút 51 3.1.2 Thời gian nuôi cấy số lượng mẻ gặt 54 3.1.3 Quy trình nhân ni virút dengue quy mơ phịng thí nghiệm 61 3.2 Xây dựng qui trình tinh chế virút quy mơ phịng thí nghiệm 63 3.2.1 Qui trình tinh hỗn dịch virút 63 3.2.2 Qui trình xử lý loại DNA tế bào enzyme 66 3.2.3 Qui trình thẩm tích hỗn dịch 69 3.2.4 Quy trình lọc vô trùng hỗn dịch virút 71 3.2.5 Qui trình tinh chế virút dengue quy mơ phịng thí nghiệm 74 KẾT LUẬN 78 KIẾN NGHỊ 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO 80 DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1 Ảnh mơ hạt virút dengue hỉnh ảnh virút dengue chụp kính hiển vi điện tử [66] Hình 1.2 Cấu trúc hệ gen protein virút dengue [22] .4 Hình 1.4 Chu trình xâm nhiễm nhân lên virút dengue [25] Hình 1.5 Mơ hình tượng tăng cường phụ thuộc kháng thể dengue [13] 11 Hình 1.6 Bản đồ mức độ phân bố dịch sốt xuất huyết dengue toàn cầu [12] 13 Hình 1.7 Số lượng trung bình trường hợp nhiễm dengue 30 Quốc gia/ vùng lãnh thổ lưu hành dịch cao báo cáo WHO từ năm 2004 – 2010 [62] 14 Hình 1.8 Những vụ dịch dengue lớn xảy toàn cầu từ năm 1990 – 2015 [16] 15 Hình 1.9 Thống kê số ca mắc sốt xuất huyết dengue Việt Nam từ năm 2006 – 2015 [6] 16 Hình 1.10 Số lượng trường hợp mắc dengue Việt Nam báo cáo lên WHO năm 2017 [63] 17 Hình 1.11 Sự lây nhiễm virút dengue tự nhiên [13] .18 Hình 1.12 Sơ đồ cấu trúc chủng vắc xin dự tuyển tái tổ hợp TV003/005 so sánh với vắc xin Denvaxia .32 Hình 2.1 Tế bào Vero sau nuôi cấy .38 Hình 3.1 Hiệu giá virút Dengue thu liều gây nhiễm MOI: 0.005, 0.01 0.05 với thời gian hấp phụ .52 Hình 3.2 Hình ảnh đám hoại tử virus dengue tái tổ hợp nhuộm với kháng thể đặc hiệu .53 Hình 3.3 Hiệu giá virút rDEN theo thời gian nuôi cấy 55 Hình 3.4 Hiệu giá virút rDEN theo thời gian ni cấy 55 Hình 3.5 Hiệu giá virút rDEN theo thời gian nuôi cấy 56 Hình 3.6 Hiệu giá virút rDEN theo thời gian nuôi cấy 57 Hình 3.7 Hình ảnh tế bào thay đổi sau mẻ gặt virút rDEN liên tiếp .60 Hình 3.8 Sơ đồ tóm tắt quy trình nhân ni virút dengue 61 Hình 3.9 Kết kiểm tra DNA tồn dư trước sau xử lý enzyme mẫu rDEN 69 Hình 3.10 Hệ thống lọc tiếp tuyến sử dụng thẩm tích liên tục .71 Hình 3.11 Phiến chuẩn độ hiệu giá rDEN bước sản xuất .73 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.2 Các vắc xin dengue dự tuyển phát triển pha TNLS 25 Bảng 3.1 Kết kiểm tra chất lượng mẻ gặt đơn virút dengue .62 Bảng 3.2 Hiệu giá virút sau tinh 65 Bảng 3.3 Kết kiểm tra DNA tổng số trước sau xử lý enzyme 68 Bảng 3.4 Kết kiểm tra protein tổng số hiệu giá virút trước sau thẩm tích 70 Bảng 3.5 Bảng tổng hợp kết kiểm tra chất lượng mẫu lọc vô trùng virút 72 Bảng 3.6 Kết kiểm tra chất lượng mẫu trước sau tinh chế 76 BẢNG KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Kí hiệu viết tắt Tiếng Anh Diễn giải ADN Acid deoxyribonucleic Axit deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic Axit ribonucleic cDNA Coplementary Acid axit deoxyribonucleic bổ sung deoxyribonucleic DEN Dengue virus Virút dengue HCSD Hội chứng sốc dengue HVĐT Hiển vi điện tử KN Kháng nguyên KT Kháng thể MOI Multiple of infection Liều gây nhiễm 10 NIAID National Institute of Allergy Viện Quốc Gia dị ứng and Infectious Diseases bệnh nhiễm trùng 11 NIH National Institute of Health Viện sức khỏe Hoa Kỳ 12 PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp 13 PFU Plague forming unit Đơn vị tạo đám hủy hoại tế bào 14 SD Sốt dengue 15 SXH Sốt xuất huyết 16 SXHD Sốt xuất huyết dengue 17 TCYTTG Tổ chức Y Tế Thế Giới 18 UTR 19 VABIOTECH Unstranslated region vùng không dịch mã Công ty TNHH MTV Vắc xin Sinh phẩm số MỞ ĐẦU Sốt xuất huyết dengue (SXHD) bệnh truyền nhiễm cấp tính gây virút dengue, bao gồm bốn týp huyết (DEN 1, DEN 2, DEN DEN 4) Theo Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG), SXHD bệnh gia tăng nhanh chóng giới bắt nguồn vector lây truyển bệnh muỗi, khiến gần 400 triệu người nhiễm bệnh năm có 500.000 ca sốt xuất huyết với 25.000 ca tử vong [69] Trong vòng 50 năm qua, SXHD lan rộng từ nhóm nước trở thành dịch 128 quốc gia nhiệt đới cận nhiệt đới, nơi có khoảng tỷ người sinh sống, số ca nhiễm sốt xuất huyết tăng gấp 30 lần giai đoạn Sốt xuất huyết dengue mang tới gánh nặng tài khổng lồ (lên tới tỉ USD/ năm) hệ thống chăm sóc y tế quốc gia có dịch lưu hành, đặc biệt nước phát triển [69, 12] Nằm khu vực lưu hành dịch, Việt Nam nước chịu ảnh hưởng nặng nề dịch SXHD Kể từ năm 1994 trở lại số lượng ca mắc tử vong SXHD có xu hướng tăng mạnh Bệnh có diễn biến phức tạp, trở thành vấn đề y tế nghiêm trọng, đặc biệt khu vực miền nam Việt Nam [2,6] Theo thống kê TCYTTG, năm 2017 Việt Nam có 183.287 trường hợp mắc (154.552 trường hợp nhập viện), 30 trường hợp tử vong Dịch bùng phát 61/63 tỉnh thành đặc biệt tăng cao miền Bắc Hà Nội Hàng năm, Chính Phủ Việt Nam chi nhiều kinh phí cho hoạt động nghiên cứu, tuyên truyền kiểm soát phòng chống dịch bệnh virút dengue gây ra, nhiên kết thu nhiều hạn chế Các biện pháp phịng ngừa dịch bệnh thơng qua kiểm sốt vector phun hóa chất diệt muỗi trưởng thành, diệt bọ gậy, vệ sinh mơi trường tốn nhiều kinh phí cần tiến hành đồng thời gian lâu dài Sử dụng vắc xin phòng bệnh SXHD cho biện pháp phòng chống dịch bệnh người chủ động triệt để nhất, giúp khống chế lây lan dịch bệnh toàn cộng đồng Với mong muốn làm chủ công nghệ sản xuất vắc xin dengue đại, Công ty TNHH MTV Vắc xin Sinh phẩm số (VABIOTECH) hợp tác với Viện Quốc Gia dị ứng bệnh nhiễm trùng, Viện Sức Khỏe Hoa Kỳ (NIAID, NIH) tiếp nhận giải pháp công nghệ hệ thống chủng giống tái tổ hợp để tiến hành Hình ảnh đám hoại tử 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 Mẫu thu hoạch Mẫu sau xử lý enzyme Mẫu sau thẩm tích Mẫu sau lọc cuối Hình 3.11 Phiến chuẩn độ hiệu giá rDEN bước sản xuất 73 10-6 3.2.5 Qui trình tinh chế virút dengue quy mơ phịng thí nghiệm Từ kết nghiên cứu trên, chúng tơi đưa qui trình tinh chế virút vắc xin dengue sau: Hỗn dịch nước virus sau thu hoạch Tinh loại xác tế bào Cột lọc Millipore XL600, 0.5/0.2 μm Xử lý enzyme benzonase Nồng độ 10 IU/ml, thời gian nhiệt độ phòng Thẩm tích hỗn dịch Màng Pellicon 300 kDa, 0.1 m2 Thẩm tích liên tục với lần thể tích đệm M199 + SPG Lọc bán thành phẩm bảo quản Sử dụng màng Millipak 20 0.22 μm Và bảo quản -80oC Đối với vắc xin dengue phát triển Việt Nam, VABIOTECH hướng tới vắc xin dạng đông khô, tứ giá phối trộn theo công thức TV005 với thành phần rDEN 1, rDEN 3, rDEN có hiệu giá 10 PFU/ liều tiêm, rDEN có hiệu giá 104 PFU/ liều tiêm Do tiêu chuẩn bán thành phẩm đơn giá hiệu giá virút phải cao 105 PFU/ml chủng rDEN 1; rDEN 3; rDEN cao 106 PFU/ml chủng rDEN để thuận lợi cho việc phối 74 trộn đảm bảo hiệu giá q trình đơng khô đạt yêu cầu hiệu giá thành phần vắc xin Tương tự vậy, thành phần DNA tế bào chủ tồn dư để đạt yêu cầu hàm lượng DNA tế bào chủ thấp 10 ng/ liều tiêm, thành phần DNA tồn dư bán thành phẩm đơn giá phải thấp 25 ng/ml Khác với thành phần DNA tồn dư, TCYTG khuyến cáo cụ thể hàm lượng protein tế bào chủ tồn dư thành phần vắc xin thành phẩm Do đa dạng dòng tế bào chủ mức độ phức tạp việc phát triển phương pháp ELISA nhằm xác định xác hàm lượng protein tế bào chủ Tuy nhiên hầu hết sản phẩm sinh học chấp thuận FDA có chứa hàm lượng protein tế bào chủ giới hạn – 100 ppm [32] Đối với tế bào Vero, thị trường có kit thương mại xác định hàm lượng protein tế bào chủ, nhiên khuôn khổ nội dung đề tài tiến hành kiểm tra hàm lượng protein tổng số theo phương pháp Lowery nhằm khảo sát hiệu loại protein trình tinh chế Phương pháp không xác định hàm lượng protein tế bào Vero tồn dư thành phần bán thành phẩm Việc đánh giá chất lượng bán thành phẩm vắc xin chuyên sâu bao gồm test kiểm tra protein tế bào Vero tồn dư, hàm lượng enzyme benzonase tồn dư tiến hành nghiên cứu Thành phần protein tế bào chủ tồn dư vắc xin cho có tiềm gây phản ứng phụ, dị ứng khơng mong muốn, tính an tồn vắc xin tiếp tục xem xét thử nghiệm tiền lâm sàng động vật, lâm sàng người 75 Kết kiểm tra chất lượng mẫu bán thành phẩm trước sau tinh chế tiêu chuẩn sở tổng hợp bảng sau: Bảng 3.6 Kết kiểm tra chất lượng mẫu trước sau tinh chế Mẫu Hiệu giá virút (log Protein tổng DNA tồn dư (ng/ml) Thử số (μg/ml) PFU/ml) Kết luận nghiệm vô khuẩn Đầu Sau vào tinh TCCS Đầu Sau Đầu Sau vào tinh vào tinh chế chế TCCS chế rDEN1 6.98 6.28 5.0 60.95 28.51 400 0.1 25 Đạt Đạt rDEN2 7.01 6.4 6.0 66.56 22.34 200 0.5 25 Đạt Đạt rDEN3 6.65 6.02 5.0 81.12 26.67 400 0.5 25 Đạt Đạt rDEN4 7.6 6.75 5.0 56.64 13.22 320 1.6 25 Đạt Đạt Từ kết kiểm tra chất lượng bán thành phẩm trước sau tinh chế (Bảng 3.6) cho thấy, mẫu bán thành phẩm sau tinh chế 04 chủng đạt yêu cầu tiêu chuẩn sở đề Hiệu giá virút trình tinh chế chủng nhỏ 101 PFU/ml Qui trình tinh chế đơn giản, dễ thực có khả nâng qui mơ Tổng thời gian tinh chế kéo dài – giúp giảm thiểu 76 khả hiệu giá virút trình tinh chế bảo quản virút dạng lỏng Từ khảo sát trình sản xuất cho thấy, việc làm đông – tan hỗn dịch virút làm giảm mạnh hiệu giá, trình sản xuất vắc xin sau này, nên tiến hành tinh chế virút sau gặt nhằm trì hiệu giá virút cao làm tăng hiệu xuất chung cho qui trình 77 KẾT LUẬN Từ nghiên cứu khảo sát kết thu rút số kết luận sau: ✓ Đề tài xây dựng thành cơng qui trình nhân nuôi virút dengue cho sản xuất vắc xin qui mơ phịng thí nghiệm - Liều gây nhiễm thích hợp cho tất chủng MOI = 0,01 - Thời gian hấp phụ virút điều kiện 37 ± 0,5 oC, ± 0,5% CO2 - Virút nuôi cấy sử dụng môi trường LH3E, điều kiện 37 ± 0,5 oC, ± 0,5% CO2, thời gian nuôi cấy virút đạt đỉnh vào ngày thứ sau gây nhiễm Trong hiệu giá virút đạt cao chủng rDEN (108,09±0,17 PFU/ml), thấp chủng rDEN (106,65±0,15 PFU/ml) - Số lượng mẻ gặt chủng rDEN 1; rDEN rDEN 03 mẻ, mẻ cách ngày Riêng chủng rDEN tiến hành mẻ gặt, cách ngày - Tiêu chuẩn chất lượng mẻ gặt đơn đạt yêu cầu thử nghiệm vô khuẩn, hiệu giá virút chủng đạt 106 PFU/ml ✓ Xây dựng thành công qui trình tinh chế virút dengue để sản xuất vắc xin quy mơ phịng thí nghiệm - Tinh loại xác tế bào sử dụng cột lọc Millipore XL 600, bao gồm lớp màng 0.5/ 0.2 μm; tổng diện tích màng lọc 590 cm2 - Hỗn dịch virút xử lý DNA tồn dư tế bào chủ enzyme benzonase nồng độ 10 U/ml, thời gian xử lý nhiệt độ phòng (18 – 25 oC) - Sau xử lý enzyme, hỗn dịch virút thẩm tích liên tục sử dụng màng siêu lọc Millipore Pellicon Mini 300 kDa, diện tích 0.1 m2 Sử dụng đệm thẩm tích M199 + SPG, thể tích đệm 05 lần thể tích mẫu - Sau thẩm tích, hỗn dịch virút lọc sử dụng màng lọc Millipak 20, 0.22 μm bảo quản nhiệt độ - 80oC - Tiêu chuẩn sở cho loạt bán thành phẩm đơn giá phải đạt yêu cầu thử nghiệm vô khuẩn, hiệu giá virút chủng rDEN 1; rDEN 3; rDEN 78 105 PFU/ml, với chủng rDEN 106 PFU/ml Hàm lượng DNA tồn dư 25 ng/ml KIẾN NGHỊ ➢ Tiếp tục tiến hành nghiên cứu khảo sát môi trường nuôi cấy, nhiệt độ chủng rDEN nhằm nâng cao hiệu giá virút ➢ Tiến hành nghiên cứu đánh giá chất lượng bán thành phẩm sau tinh chế Bao gồm: o Đánh giá tính ổn định hệ gen virút dengue mẫu bán thành phẩm so sánh với trình tự hệ gen chủng giống sản xuất o Xác định hàm lượng protein tế bào Vero mẫu bán thành phẩm Xây dựng tiêu chuẩn sở cho thành phần protein tế bào chủ mẫu bán thành phẩm o Kiểm tra tác nhân ngoại lai mẫu bán thành phẩm o Kiểm tra tính an tồn độc tính thần kinh động vật thí nghiệm 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đặng Đức Anh, Nguyễn Thị Hồng Hạnh, Phan Thị Ngà (2010), “Virut Yhọc”, Nhà xuất Y học Hà Nội: 90-114 Đỗ Quang Hà, Vũ Thị Quế Hương, Huỳnh Thị Kim Loan cs (1998), “Dịch sốt xuất huyết dengue miền Nam Việt Nam từ 1985 đến 1996”, Thời Y Dược học, (1), tr 30-35 Đỗ Quang Hà, Vũ Thị Quế Hương, Huỳnh Thị Kim Loan cs (1998), “Dịch sốt xuất huyết dengue tỉnh phía Nam từ 1995-1997”, Thời Y Dược học, 3(Số đặc biệt), tr 259-263 Nguyễn Hữu Hồng, Lê Huy Chính, Nguyễn Văn Dịp, Đinh Hữu Dung, Bùi Khắc Hậu, Lê Hồng Hinh (1993), Bài giảng vi sinh Y học, Nhà xuất Y học, Hà Nội Nguyễn Thanh Long, Trần Thanh Dương, Phan Trọng Lân cs (2012), “Phân tích đặc điểm bệnh sốt xuất huyết Dengue giai đoạn 2009-2011 Việt Nam”, Tạp chí Y học dự phòng, Tập XXII, số 8(135): 106-113 Nguyễn Trần Hiển (2012), Tình hình số dịch bệnh truyền nhiễm trội Việt Nam, Hội nghị biện pháp ứng phó bệnh truyền nhiễm châu Á lần thứ 8, Hà nội Niên giám thống kê (2007-2016), “Niên giám thống kê bệnh sốt xuất huyết Dengue” Trương Uyên Ninh, Huỳnh Phương Liên (1995), “Giám sát huyết học bệnh sốt xuất huyết dengue việc sử dụng Olyset”, Tạp chí Vệ sinh phòng dịch, 5(4), tr 66-70 Vũ Sinh Nam (1995), Một số đặc điểm sinh học, sinh thái biện pháp phòng chống véc-tơ truyền bệnh sốt xuất huyết dengue số địa phương miền Bắc Việt Nam Luận án phó tiến sĩ khoa học Y Dược, Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương, tr 1-27 80 Tiếng Anh 10 Acosta EG, Castilla V, Damonte EB (2009), “Alternative infectious entry pathways for dengue virus serotypes into mammalian cells”, Cell Microbiol 11:1533–1549 11 Anne Tuiskunen, Ke Lundkvist, (2013), “Dengue viruses - an overview”, Infection Ecology and Epidemiology, dx.doi.org/10.3402/iee.v3i0.19839 12 Bhatt S, Gething PW, Brady OJ, et al, (2013), “The global distribution and burden of dengue”, Nature, 496:504–507 13 Blaney Jr JE, Hanson CT, Hanley KA, Murphy BR, Whitehead SS (2004), “Vaccine candidates derived from a novel infectious cDNA clone of an American genotype dengue virus type 2”, BMC Infectious Diseases, 4, pp.39 14 Blaney J.E., Sathe N.S., Goddard L et al (2008), “Dengue virus type vaccine candidate generated by introduction of deletion in the 3’ untranslated regieon (3’-UTR) of by exchange of the DENV-3 3’-UTR with that of DENV-4” Vaccine, 26, pp 817-828 15 Brian R Murphy and Stephen S Whitehead, (2011), “Immune Response to Dengue Virus and Prospects for a Vaccine”, Annual Review of Immunology, 29:587–619 16 Castro JE, Vado-Solis I, Perez-Osorio C, Fredeking TM, (2011), “Modulation of cytokine and cytokine receptor/antagonist by treatment with doxycycline and tetracycline in patients with dengue fever”, Clin Dev Immunol; 2011: 370872 17 Chareonsirisuthigul T, Kalayanarooj S, Ubol S, (2007), “Dengue virus (DENV) antibody-dependent enhancement of infection upregulates the production of anti-inflammatory cytokines, but suppresses anti-DENV free radical and pro-inflammatory cytokine production, in THP-1 cells”, J Gen Virol 88:365–375 81 18 Congcong Guo, Zixing Zhou, Zihao Wen, et al (2017), “Outbreaks in 1990 – 2015: A systematic Review and Meta- Analysis”, Cell Infect Microbiol, doi: 10.3389/fcimb.2017.00317 19 Daryl E Kleina, Jason L Choia and Stephen C Harrisona (2012), “Structure of a Dengue Virus Envelope Protein Late-Stage Fusion Intermediate”, J Virol vol 87 no 2287-2293 20 Duane J Gubler, (2006), “Dengue/dengue haemorrhagic fever: history and current status”, New Treatment Strategies for Dengue and Other Flaviviral Diseases, Novartis Foundation Symposium 277, Volume 277 21 Durbin A.P., Whitehead S.S., McArthur J et al (2005), “rDEN4∆30, a live attenuated dengue virus type vaccine candidates, is safe, immunogenic, and highly infectious in healthy adult volunteers”, Journal of Infectious Diseases, 191, pp 710-718 22 Ee LeenPang, Hwei-SanLoh, (2017), “Towards development of a universal dengue vaccine – How close are we”, Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, Volume 10, Issue 3, Pages 220-228 23 Gamarnik A, (2010), “Role of the dengue virus 5’ and 3’ untranslated regions in viral replication”, Frontiers in dengue virus research, Norfolk, UK: Caister Academic Press; 2010 pp 55–78 24 Gubler DJ, Rosen L (1976), “A simple technique for demonstrating transmission of dengue viruses by mosquitoes without the use of vertebrate hosts” Am J Trop Med Hyg 25:146–150 25 Guy B, Barrere B, Malinowski C, Saville M, Teyssou R, Lang J (2011), “Preclinical, industrial and clinical development of the Sanofi Pasteur tetravalent dengue vaccine”, Vaccine; 29:7229–41 26 Halstead SB, O’Rourke EJ, (1977), “Dengue viruses and mononuclear phagocytes I Infection enhancement by nonneutralizing antibody”, J Exp Med 146:201–217 82 27 Izabela A Rodenhuis-Zybert, Jan Wilschut, Jolanda M Smit, (2010), “Dengue virus life cycle: viral and host factors modulating infectivity”; Cellular and Molecular Life Sciences 67:2773–2786 28 Jane P Messina, Oliver J Brady, Thomas W Scott, Chenting Zou, David M Pigott, (2014), “Global spread of dengue virus types: mapping the 70 years history”, Trends in Microbiology, Vol 22, No 29 Janine R Danko, Tadeusz Kochel, (2018), “Safety and Immunogenicity of a Tetravalent Dengue DNA Vaccine Administered with a Cationic Lipid-Based Adjuvant in a Phase Clinical Trial”, Am J Trop Med Hyg, 98(3): 849–856 30 Jason A L Jeffery, Nguyen Thi Yen, Vu Sinh Nam, Le Trung Nghia, Ary A Hoffmann, Brian H Kay, Peter A Ryan, (2009), “Characterizing the Aedes aegypti Population in a Vietnamese Village in Preparation for a WolbachiaBased Mosquito Control Strategy to Eliminate Dengue”, PLOS Neglected Tropical Diseases, doi.org/10.1371/journal.pntd.0000552 31 Jessie K, Fong MY, Devi S, Lam SK, Wong KT (2004), “Localization of dengue virus in naturally infected human tissues, by immunohistochemistry and in situ hybridization”, The Journal of Infectious Diseases 189:1411–1418 32 Kathleen Champion, Helena Madden, John Dougherty, and Emily Shacter, (2004), Challenges of Monitoring Host Cell Protein Impurities, Defining Your Product Profile and Maintaining Control Over It, Part 33 Kirkpatrick BD, Durbin AP, Pierce KK, Carmolli MP, Tibery CM, Grier PL, et al, (2015), “Robust and balanced immune responses to all dengue virus serotypes following administration of a single dose of a live attenuated tetravalentdengue vaccine to healthy, flavivirus-naïve adults”, J Infect Dis, DOI: 10.1093/infdis/jiv082 34 Kirsten K Langfield, Henry J Walker, Linda C Gregory, and Mark J Federspiel, (2011), “Manufacture of Measles Viruses”, Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, DOI 10.1007/978-1-61779-095-9_14 35 Kuhn RJ, Zhang W, Rossmann MG, Pletnev SV, Corver J, Lenches E, Jones CT, Mukhopadhyay S, Chipman PR, Strauss EG, Baker TS, Strauss JH, (2002) 83 “Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion” Cell 108:717–725 36 Kuhn RJ, Zhang W, Rossmann MG, Pletnev SV, Corver J, Lenches E, Jones CT, Mukhopadhyay S, Chipman PR, Strauss EG, Baker TS, Strauss JH, (2002), “Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion”, Cell 108:717–725 37 Lai CY, Tsai WY, Lin SR, Kao CL, Hu HP, King CC, Wu HC, Chang GJ, Wang WK, (2008), “Antibodies to envelope glycoprotein of dengue virus during the natural course of infection are predominantly cross-reactive and recognize epitopes containing highly conserved residues at the fusion loop of domain II”, J Virol 82:6631–6643 38 M Alvarez, R Rodriguez-Roche, L Bernardo et al (2006), “Dengue hemorrhagic fever caused by sequential dengue 1–3 virus infections over a long time interval: Havana epidemic, 2001- 2002,” American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, vol 75, no 6, pp 1113–1117 39 M Bonet, J M Spiegel, A M Ibarra, G Kouri, A Pintre Lic, and A Yassi, (2007), “An integrated ecosystem approach for sustainable prevention and control of dengue in Central Havana”, International Journal of Occupational and Environmental Health, vol 13, no 2, pp 188–194 40 Mathew A, Rothman AL, (2008), “Understanding the contribution of cellular immunity to dengue disease pathogenesis”, Immunol Rev 225:300–313 41 Millipore, (1999), Filter integrity test methods, Technical brief, Lit No TB039 Rev A 42 Millipore, (2013), Benzonase endonuclease Balancing efficiency and regulatory compliance – the smart solution for DNA removal in biopharmaceutical production, Technical brief, 43 Millipore, Protein Concentration and Diafiltration by Tangential Flow Filtration, (2003), Technical brief, Lit No TB032 Rev C 06/03 03-117 84 44 Modis, Y; Ogata, S; Clements, D; Harrison, SC (2003) “A ligand-binding pocket in the dengue virus envelope glycoprotein”, Proc Natl Acad Sci USA 100 (12): 6986–6991 doi:10.1073/pnas.0832193100 45 NIH (2010), NIH news: Human clinical trial of NIH-developed dengue vaccine begins Bethesda MD, USA 46 Osorio JE, Huang CY-H, Kinney RM, (2011), “Development of DEN-Vax: a chimeric dengue-2 PDK-53-based tetravalent vaccine for protectionagainst dengue fever”, Vaccine ;29:7251–60, 47 P Lu, G Bian, X Pan, and Z Xi, (2012), “Wolbachia induces densitydependent inhibition to dengue virus in mosquito cells”, PLOS Neglected Tropical Diseases, vol 6, no 7, Article ID e1754 48 Pall Life Sciences, (2003), “Diafiltration: A Fast, Efficient Method for Desalting, or Buffer Exchange of Biological Samples”, Scientific & Technical Report, PN33289 49 Pietro Scaturro, Mirko Cortese, Laurent Chatel-Chaix, Wolfgang Fischl, Ralf Bartenschlager (2015), “Dengue Virus Non-structural Protein Modulates Infectious Particle Production via Interaction with the Structural Proteins”, PLoS Pathog 11(11): e1005277 50 R Aruna, (2014), “Review on Dengue viral Replication, assembly and entry into the host cells”, Int.J.Curr Microbiol, Sci (2014) 3(11): 1025-1039 51 Rosmari Rodriguez-Roche, Ernest A Gould, (2013), “Understanding the Dengue Viruses and Progress towards Their Control”, BioMed research international, DOI: 10.1155/2013/690835 52 Rushika Perera and Richard J Kuhn, (2008), “Structural Proteomics of Dengue Virus”, Curr Opin Microbiol Aug; 11(4): 369–377 53 Schmidt, Lin, Martinez, Ruck RC, Eckels KH, Collard A, De La Barrera R, (2017), “Phase Randomized Study of a Tetravalent Dengue Purified Inactivated Vaccine in Healthy Adults in the United States”, Am J Trop Med Hyg, doi: 10.4269/ajtmh.16-0634 85 54 Shresta S, Kyle JL, Snider HM, Basavapatna M, Beatty PR, Harris E, (2004), “Interferon-dependent immunity is essential for resistance to primary dengue virus infection in mice, whereas T- and B-cell-dependent immunity are less critical”, J Virol 78:2701–2710 55 Shresta S, Sharar KL, Prigozhin DM, Beatty PR, Harris E, (2006), “Murine model for dengue virus-induced lethal disease with increased vascular permeability”, J Virol; 80: 10208–17 56 Si-Ming Li, Fu-Liang Bai, Wen-Juan Xu, Yong-Bi Yang, Ying An, Tian-He Li, (2014), “Removing residual DNA from Vero-cell culture-derived human rabies vaccine by using nuclease”, Biologicals, volume 42- issue 5, pages 271276 57 Simmons, C P., Farrar, J J., Nguyen v, V., and Wills, B (2012) “Dengue”, J Med, 366, 1423–1432 doi: 10.1056/NEJMra1110265 58 Sirivichayaku, Barranco-Santana, Esquilin-Rivera, Oh HM, (2015), “Study to investigate the safety and immunogenicity of atetravalent chimeric dengue vaccine in healthy volunteers between the agesof 1.5–45 years”, ClinicalTrials.gov, NCT01511250 59 Standish K, Kuan G, Avilés W, Balmaseda A, Harris E, (2010), “High dengue case capture rate in four years of a cohort study in Nicaragua compared to national surveillance data”, PLoS Negl Trop Dis; 4: e633 60 Suaya JA, Shepard DS, Siqueira JB, et al, (2009), “Cost of dengue cases in eight countries in the Americas and Asia: a prospective study”, Am J Trop Med Hyg, 80:846–855 61 Van der Schaar HM, Rust MJ, Chen C, van dE-M, Wilschut J, Zhuang X, Smit JM (2008), “Dissecting the cell entry pathway of dengue virus by singleparticle tracking in living cells”, PLoS Pathogen 4e1000244 62 Vaughn DW, Green S, Kalayanarooj S, Innis BL, Nimmannitya S, et al (2000), “Dengue viremia titer, antibody response pattern, and virus serotype correlate with disease severity”, J Infect Dis.181:2–9 86 63 Villar L, Dayan GH, Arredondo-García JL, Rivera DM, Cunha R, Deseda C, et al, (2014), “Efficacy of a tetravalent dengue vaccine in children in Latin America”, Eng JMed 64 Weiskopf D, Angelo MA, Bangs DJ, et al, “The human CD8 + T cell responses induced by a live attenuated tetrava- lent dengue vaccine are directed against highly con- served epitopes” J Virol 2015;89(1):120–128 65 Whitehead S.S., Blaney J.E., Durbin A.P., Murphy B.R (2007), “Prospect for dengue virus vaccine”, Nature Reviews Microbiology, 5, pp 518-528 66 WHO (2012), “Guidelines on the quality, safety and efficacy of dengue tetravalent vaccines (live, attenuated)”, WHO Expert Committee on Biological Standardization, sixty-second report, pp.53-110 67 WHO, (1997), Dengue haemorrhagic fever Diagnosis, treatment, prevention and control Geneva: WHO, pp 12-23 68 WHO, (2009), Dengue: guidelines for diagnosis, treatment, prevention, and control WHO/HTM/NTD/DEN/2009.1 69 WHO, (2012) Global strategy for dengue prevention and control Geneva: World Health Organization 70 WHO, (2017), Update on the Dengue situation in the Western Pacific Region, Dengue Situation Update Number 532 71 WHO, (2018), Revised SAGE recommendation on use of dengue vaccine, Immunization, Vaccines and Biologicals 72 Yu IM, Zhang W, Holdaway HA, Li L, Kostyuchenko VA, Chipman PR, Kuhn RJ, Rossmann MG, Chen J (2008), “Structure of the immature dengue virus at low pH primes proteolytic maturation”, Science 319:1834–1837 73 Zybert IA, van dE-M, Wilschut J, Smit JM, (2008), “Functional importance of dengue virus maturation: infectious properties of immature virions”, J Gen Virol 89:3047–305 87 ... virút dengue sử dụng sản xuất vắc xin sống giảm độc lực? ?? với mục tiêu: • Xây dựng quy trình nhân ni virút dengue để sản xuất vắc xin qui mơ phịng thí nghiệm • Xây dựng qui trình tinh chế virút dengue. .. NHIÊN HỒNG ĐỨC LỘC XÂY DỰNG QUI TRÌNH NHÂN NUÔI VÀ TINH CHẾ VIRÚT DENGUE SỬ DỤNG TRONG SẢN XUẤT VẮC XIN SỐNG GIẢM ĐỘC LỰC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã s? ?: 842010 1.07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC... mắc sốt xuất huyết dengue hoàn toàn khả thi [69] 1.3 Tình hình nghiên cứu phát triển vắc xin phòng SXHD giới Vắc xin sống, giảm độc lực Trong dạng vắc xin dự tuyển, vắc xin sống giảm độc lực tiến