Nghiên cứu ứng dụng enzyme để thu nhận sản phẩm giàu axit amin và peptid từ phế thải công nghiệp chế biến cá

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI -o0o - TRẦN THỊ QUY NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME ĐỂ THU NHẬN SẢN PHẨM GIÀU AXIT AMIN VÀ PEPID TỪ PHẾ THẢI CÔNG NGHIỆP CHẾ BIẾN CÁ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS QUẢN LÊ HÀ HÀ NỘI - 2011 Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH VẼ .4 DANH MỤC BẢNG LỜI MỞ ĐẦU .7 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 9  1.1.Tổng quan nguồn nguyên liệu .9  1.1.1 Giới thiệu cá tra cá basa 9  1.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh thái 10  1.1.3 Đặc điểm sinh trưởng 10  1.1.4 Đặc điểm sinh dưỡng 10  1.1.5 Tình hình nuôi trồng xuất cá tra basa Việt Nam 11  1.1.6 Phế phẩm từ sản xuất cá tra .13  1.1.7 Thành phần da cá tra 13  1.2 Tổng quan collagen 15  1.2.1 Giới thiệu collagen 15  1.2.2 Định nghĩa collagen 16  1.2.3 Cấu trúc collagen .17  1.2.4.Phân loại collagen 21  1.2.5 Tính chất collagen .23  1.2.6 Collagen từ cá động vật thân mềm .24  1.2.6.1 Từ cá .24  1.2.6.2 Từ động vật thân mềm 24  1.2.7 Ý nghĩa collagen sinh vật sống thể người 25  1.2.8 Ứng dụng collagen 26  1.2.8.1 Trong công nghiệp 26  1.2.8.2 Ứng dụng y học dược phẩm 27  Trần Thị Quy Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học 1.2.8.3 Ứng dụng mỹ phẩm 28  1.3 Tổng quan protease khả thuỷ phân protease .28  1.3.1 Đại cương protease 28  1.3.2 Phân loại protease 29  1.3.3 Nguồn enzyme protease 30  1.3.3.1 Protease vi sinh vật .30  1.3.3.2 Protease thực vật 31  1.3.3.3 Protease từ động vật .32  1.3.4 Một số protease sử dụng nghiên cứu 32  CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34  2.1 Vật liệu nghiên cứu 34  2.1.1 Nguyên liệu .34  2.1.2 Hóa chất sử dụng 34  2.1.3 Thiết bị 34  2.2 Phương pháp nghiên cứu 35  2.2.1 Xử lý nguyên liệu 35  2.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng protein 36  2.2.4 Phương pháp xác định hoạt độ protease 36  2.2.5 Phương pháp xác định hàm lượng axit amin phản ứng màu với ninhydrin 39  2.2.6 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy quy hoạch thực nghiệm 42  2.2.7 Xác định hàm lượng axit amin theo phương pháp HPLC .43  2.2.8 Phương pháp điện di 44  CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46  3.1 Kết ảnh hưởng nồng độ axit axetic đến hiệu thủy phân da cá 46  3.2 Xác định thành phần da cá 47  Trần Thị Quy Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học 3.3 Kết xác định hoạt lực enzyme neutrase flavozyme sử dụng trình nghiên cứu 48  3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ enzyme neutrase, flavouzyme đến hiệu suất thủy phân .48  3.4.1 Ảnh hưởng nồng độ enzyme neutrase đến hiệu suất thuỷ phân .49  3.4.2 Ảnh hưởng nồng độ enzyme flavourzyme đến hiệu suất thuỷ phân 50  3.4.3 Ảnh hưởng nồng độ hỗn hợp enzyme neutrase+ flavourzyme đến hiệu suất thuỷ phân .51  3.5 Lựa chọn điều kiện để hỗn hợp enzyme neutrase + flavourzyme thuỷ phân da cá đạt hiệu tốt .53  3.5.1 Lựa chọn nhiệt độ tối ưu thuỷ phân protein da cá 54  3.5.2 Lựa chọn pH tối ưu thuỷ phân protein da cá 55  3.5.3.Lựa chọn thời gian tối ưu thuỷ phân protein da cá 56  3.6 Tối ưu hóa điều kiện thuỷ phân protein từ da cá theo chương trình phần mềm Design Expert 8.0.1.4 (DX) Stat – Ease (Minneapolis, Minesota, 2001) 58  3.6.1 Xây dựng mô hình thực nghiệm 58  3.6.2 Tối ưu hóa điều kiện thuỷ phân protein da cá 63  3.6.3 Kiểm tra tính xác phương trình tối ưu 63  3.7 Khảo sát thành phần axit amin sản phẩm thủy phân .64  3.8 Kết điện di .66  TÀI LIỆU THAM KHẢO 70 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69 PHỤ LỤC 74 Trần Thị Quy Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Sản lượng cá tra, basa Việt Nam xuất sang thị trường năm 2008 10 Bảng 1.2 Bảng số doanh nghiệp phép chế biến thuỷ sản xuất theo thị trường .11 Bảng 1.3 Bảng thành phần da cá 13 Bảng 1.4 Bảng thành phần protein hợp chất phi protein da, % w/w 13 Bảng 1.5 Sự phân loại collagen 19 Bảng 2.1 Bảng biến số khoảng chạy chúng 43 Bảng 2.2 Ma trận thực nghiệm 44 Bảng 3.1 Bảng kết xử lý da cá axit 45 Bảng 3.2 Bảng kết phân tích thành phần da cá 46 Bảng 3.3 Bảng kết phân tích hoạt độ enzyme chế phẩm .47 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nồng độ enzyme neutrase đến hiệu suất thuỷ phân .48 Bảng 3.5 Ảnh hưởng nồng độ enzyme flavouzyme đến hiệu suất thuỷ phân .49 Bảng 3.6 Ảnh hưởng nồng độ hỗn hợp enzyme neutrase flavouzyme đến hiệu suất thuỷ phân 50 Bảng 3.7 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất thuỷ phân da cá tra 53 Bảng 3.8 Ảnh hưởng pH đến hiệu suất thuỷ phân da cá tra 54 Bảng 3.9 Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất thuỷ phân da cá tra 56 Bảng 3.10 Bảng yếu tố ảnh hưởng nghiên cứu .57 Bảng 3.11 Ma trận thực nghiệm kết chương trình Design Expert 57 Bảng 3.12 Phân tích phương sai ANOVA mô hình .59 Bảng 3.13 Kết kiểm chứng 63 Bảng 3.14 Bảng phân tích thành phần axit amin dich thuỷ phân da cá phương pháp HPLC .58 Trần Thị Quy Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1 Hình ảnh cá tra basa Hình 1.2 Phế phẩm từ nhà máy chế biến cá tra 12 Hình 1.3 Cấu trúc mạng lưới dày đặc collagen 14 Hình 1.4 Cấu trúc dạng sợi collagen 15 Hình 1.5 Cấu trúc vi sợi collagen 16 Hình 1.6 Cấu trúc bó sợi collagen 19 Hình 2.1 Mô hình điện di SDS- PAGE .42 Hình 3.1 Sự gia tăng hàm lượng axit amin sử dụng axit xử lý da cá 45 Hình 3.2 Sự thay đổi hiệu suất thuỷ phân sử dụng enzyme neutrase 48 Hình 3.3 Sự thay đổi hiệu suất thuỷ phân sử dụng enzyme flavouzyme .49 Hình 3.4 Sự thay đổi hiệu suất thuỷ phân sử dụng hỗn hợp enzyme neutrase flavouzyme 51 Hình 3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất thuỷ phân da cá tra 53 Hình 3.6 Ảnh hưởng pH đến hiệu suất thuỷ phân da cá tra 55 Hình 3.7 Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất thuỷ phân da cá tra 56 Hình 3.8 Hàm kỳ vọng điều kiện tối ưu để biểu hiện hiệu suất thuỷ phân da cá 57 Hình 3.9 Kết sắc ký đồ phân tích thành phần axit amin dịch thủy phân 58 Hình 3.10 Kết điện di SDS-PAGE 62 Hình 3.11 Xây dựng quy trình tách chiết collagen từ da cá tra 67 Trần Thị Quy Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học DANH CÁC KÝ HIỆU MỤC Da dalton kDa kilo dalton h g gam OD Optical Density (mật độ quang) SDS PAGE Sodium dode cyl sulfate polyacrylamide gel electron ( kỹ thuật điện di gel polyacrylamide) Trần Thị Quy Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học LỜI MỞ ĐẦU Ở Việt Nam, năm gần đây, thủy sản trở thành ngành kinh tế mũi nhọn Cần Thơ, An Giang, Vĩnh Long, Đồng Tháp nhiều tỉnh thuộc đồng sông Cửu Long thực làm giàu nhờ nuôi trồng chế biến thủy sản, đặc biệt mặt hàng phi lê cá tra cá basa đông lạnh Theo Hiệp hội chế biến xuất thủy sản Việt Nam (VASEP), quý I năm 2011, xuất cá tra cá basa Việt Nam đạt 153.062 tấn, kim ngạch 376,430 triệu USD, tăng 21,6% giá trị, 5,2% sản lượng so với kỳ năm 2010, chiếm khoảng 34,22% tổng kim ngạch xuất thủy sản Phần thịt cá sử dụng sản phẩm cá tra phi lê chiếm khoảng 30% trọng lượng thân cá Vì mà bên cạnh giá trị mà cá tra mang lại nhà máy chế biến phải đối mặt với việc giải lượng chế phẩm lên đến 70% gồm chủ yếu da, xương nội tạng cá Da cá chiếm khoảng – 6% bán xô phế phẩm khác với giá rẻ để sản xuất bột cá Như vậy, năm riêng vùng ĐBSCL sản xuất khoảng 600.000 cá tra phi lê có khoảng 85-100.000 da cá thải Trên giới nay, collagen mua với giá từ 25 - 30USD/kg (collagen thô) 170 – 180USD/kg (collagen tinh sạch) cá tra philê đông lạnh bán cao khoảng 3,5 - 4USD/kg, mặt hàng cá tra khác xuất với giá - 2,5USD/kg Tính ra, giá phụ phẩm cá tra cao gấp 8-10 lần giá phẩm Một số nghiên cứu bước đầu cho thấy da cá tra có hàm lượng collagen cao, chiếm khoảng 53% hàm lượng chất khô da Việc nghiên cứu tách chiết collagen từ da cá tra góp phần giải vấn đề ô nhiễm môi trường, làm tăng giá trị phụ phẩm, mà biến phế phẩm ngành sản xuất phi lê cá tra thành sản phẩm có giá trị kinh tế cao, làm tăng giá trị phụ phẩm Trần Thị Quy Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học Xuất phát từ thực tế tiến hành đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng enzyme để thu nhận sản phẩm giàu axit amin peptid từ phế thải công nghiệp chế biến cá” Mục đích đề tài: + Đưa quy trình công nghệ thuỷ phân nguồn collagen từ phế thải da cá tra Nội dung đề tài: + Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện xử lý da cá trước thủy phân +Nghiên cứu điều kiện thích hợp để thuỷ phân da cá: nồng độ enzyme, nhiệt độ thời gian đến hiệu suất thuỷ phân + Tối ưu điều kiện thuỷ phân da cá + Xây dựng quy trình công nghệ thu nhận collagen từ da cá tra Trần Thị Quy Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Tổng quan nguồn nguyên liệu 1.1.1 Giới thiệu cá tra cá basa Hình 1.1 Hình ảnh cá tra, cá ba sa Trong thực tế, lẫn lộn tên gọi hai loài cá basa cá tra Vì vậy, để khảo sát cách xác nguồn nguyên liệu da cá, cần phải phân biệt rõ đặc điểm sinh học hai loài cá để nhận dạng ảnh hưởng môi trường nuôi trồng Cá basa (tên tiếng Anh: Yellowtail catfish) loài nuôi truyền thống bè sông Mekong Việt Nam, Lào, Thái Lan Campuchia Cá tra (tên tiếng Anh: Shutchi catfish) trước nuôi nhiều ao, đồng Nam Việt Nam Về mặt phân loại, loài thuộc cá nheo (Siluriformes), họ cá tra (Pangasidae), loài Pangasius Cá tra (Pangasius hypophthalmus) cá basa (Pangasius bocourti) cá da trơn (không vẩy) Cá sống chủ yếu nước ngọt, chịu nước lợ nhẹ (độ muối 10%) nước phèn (pH>4) Cá tra có quan hô hấp phụ, hô hấp bóng khí da, nên chịu đựng môi trường nước thiếu oxy hòa tan Ngược lại, cá basa gọi cá bụng có mỡ lớn, quan hô hấp phụ, chịu đựng môi trường nước có hàm lượng oxy hòa tan thấp Ngoài ra, cá tra có khả thích nghi với nhiều loại thức ăn mùn bã hữu cơ, cám, rau, động vật đáy, thức ăn hỗn hợp Thức ăn cho cá basa thường hỗn hợp tấm, cám, rau cá vụn (nấu chín) nên phù hợp với nuôi dưỡng bè sông nước chảy mạnh Cá tra Trần Thị Quy Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học vạch đậm sau đến mẫu 2, mẫu 3.Kết phù hợp với thực tế ta bổ sung lượng enzyme vào thí nghiệm Kết cho thấy dịch thu chứa chuỗi α1, α2 với kích thước khoảng 100 – 130 kDa, hai chuỗi peptit cấu tạo nên collagen loại I Ngoài loại chuỗi α, dung dịch thấy xuất chuỗi β dime α Vậy kết luận, quy trình đưa tách collagen từ da cá tra Trần Thị Quy 67 Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học 3.9 Xây dựng quy trình thu nhận collagen từ da cá tra Da cá, rửa Loại lipit chất béo Gia nhiệt Nghiền Xử lý axít Ngâm cồn tỉ lệ 1:5 (g/ml) -100 ºC -Trong 10 phút Bổ sung nước:da cá tỷ lệ 2:1 - Bổ sung CH3C00H 2N Thuỷ phân - Nhiệt độ 500C - Thời gian 2h - Chỉnh pH -7,5 - Bổ sung neutrase +flavourzyme 200U Ly tâm - 8000 vòng/phút -Trong 10 phút Dịch Hình 3.11 Quy trình tách chiết collagen từ da cá tra Trần Thị Quy 68 Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Nghiên cứu điều kiện xử lý da cá trước thủy phân phương pháp gia nhiệt axit cho thấy nồng độ axit CH3COOH 2N thích hợp 1000C 15 phút cho kết tốt Bằng phương pháp quy hoach thực nghiệm bậc hai Box-Behnken chương trình phần mềm Design Expert, tìm điều kiện tối ưu thủy phân protein da cá tra: Nhiệt độ 500C, pH 7.0-7.5, thời gian 2h Thành phần axit amin dịch thủy phân chiếm nhiều là: glycine - 26,8%, histidine - 17,8%, glutamic - 9,3%, proline - 9,2% Đã xây dựng quy trình thu nhận collagen từ da cá tra KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu để hoàn thiện quy trình thu nhận collagen thuỷ phân từ da cá thu sản phẩm dạng bột - Đưa quy trình vào sản xuất collagen quy mô lớn Trần Thị Quy 69 Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO B TIẾNG VIỆT Nguyễn Quỳnh Anh (1985), Thu nhận ứng dụng pepsin protease axit cua A.niger y học chăn nuôi Luận án tiến tiến sĩ Khoa học, Trường đại học Bách Khoa Hà Nội Nguyễn Liêu Ba, Nghiên cứu công nghệ thu nhận protease kiềm từ vi khuẩn Bacillus, Luận án tiến sĩ khoa học Kỹ thuật, Đại học Bách Khoa Hà nội, Hà nội Phạm Văn Biên, Hà Hữu Tiến, Phạm Ngọc Quý, Trần Minh Tâm, Bùi Việt Nữ (1996), Cây Đậu nành Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (1998), Công nghệ enzym, Nhà xuất nông nghiệp TPHCM Phạm Thị Trân Châu, Đinh Thương Vân (1981), Proteinaza dứa Một số tính chất chế phẩm enzyme chưa tinh chế Tạp chí sinh vật học 4, 11 Phạm Thị Trân Châu (1983), Những hiểu biết enzyme, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn hữu Chấn (1983), Enzyme xúc tác sinh học, Nhà xuất Y học, Hà nội Nguyễn Văn Đạt, Ngô Văn Tám (1974), Phân tích lương thực thực phẩm, Bộ lương thực thực phẩm, Quản Lê Hà (1990), Nghiên cứu số đặc tính ứng dụng hệ enzyme thuỷ phân tinh bột protein sản xuất đồ uống, Luận văn Tiến sĩ khoa học, Đại học Bách Khoa Hà nội 10 Nguyễn Đức Lượng, O Cường, Nguyễn Ánh Tuyết, Lê Thị Thuỷ Tiên, Tạ Thu Hằng, Huỳnh Ngọc Oanh, Nguyễn Thúy Hường, Phan Thị Huyền (2004) Công nghệ enzyme, Nhà xuất Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh 11 Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành hóa sinh học, Nhà xuất KHKT Trần Thị Quy 70 Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học 12 Lê Đức Ngọc, Trịnh Lê Hùng, Võ Sĩ Hùng, Phạm Quý Hải, Vũ Anh Phương (1996), Nghiên cứu proteaza bí đao I- Khảo sát nguồn proteaza bí đao Việt Nam, Tạp chí Hoá học, T.34 số ĐB, tr 63-67 13 Quản Văn Thịnh (1979), Sinh tổng hợp enzyme proteaza chủng nấm mốc Asp Oryzae VNI ứng dụng sản xuất nước chấm, Luận án phó tiến sĩ khoa học kỹ thuật, Đại học Bách Khoa Hà Nội, Hà Nội 14 Đặng Thị Thu, Nguyễn Thị Xuân Sâm, Tô Kim Anh (1997), Thí nghiệm hóa sinh công nghiệp, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội 15 Trần Đình Toại, Đỗ Ngọc Lanh, Nguyễn Văn Thiết, Nguyễn Thu Hoài (1994), Nghiên cứu khả thuỷ phân số loại protein papain, Tạp chí hoá học, T.32, số 4, tr 33-36 A TIẾNG ANH 16 Amonrat Thanonkaew, Thavom Juntachote, Pussadee Tangwatcharin, Waraporn Raungrat and Areerat Auksornnieum (2007), Chemical compositions of wild catfish ( Clarias macrocephalus) and farmed catfish ( hybrid, clarias macrocephalus clarias gariepinus), 33rd Congress on Science and Technology of Thailand, page – 17 Anono R and K.Horikoshi (1983), Chemical composition of cellwalls of alkalophitic enzyme J Gen Microbial,129:1083-1087 18 Chin Ying Hsiao, Chiang Hung Chou, Hsi Wen Sun, June Nam Seah (2008), Collagen Production Method, United States Patent, US 7.396.912.B2, Jul.8, 114 19 Chwen-Herng, keelung City, Huey-Jine Chai, Keelung City (2007), Collagen of fish scale and method of making thereof, Patent Application Publication, US 2007/0231878 A1, Otc.4, 1-5 20 Dieter Swatschek et al Alupei, Corneliu Iulian (Neuwied, DE).Ruth, Peter (Melsbach, DE) Rohrer, Christian (Linz, AT) Schatton, Wolfgang (Frankfurt, Trần Thị Quy 71 Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học DE) (2002), “Marine sponge collagen: isolation, characterization and effects on the skin parameters surface – pH, moisture and sebum”, European Joural of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, vol.53, No.1,pp.107-113 21 Din Fu & Chaloupka J (1969), Aminoacid stimulation of proteinase sythesis in sporogenous Bacillus magaterium KM.Bio chem Bio phys Res.Comm 37:2338 22 Hunter- Cereva J.C (1986), The beginning: Seaching for enzyme in naturescreening strategies and isolation of novel enzyme World Biotech Rep 2(3):13-24 23 Kunihiko Kodaka, Fukuoka (2007), Method for producing amino axit components by enzymatic hydrolysis of fish egg skin, United States Patent, US 7.297.512 B2, Nov.20, 1-8 24 Marco P.E.Wenger, Laurent Bozec, Michael A.Horton and Patrick Mesquida Bone and Mineral Centre (2007), Mechanical Properties of Collagen Fibrils, pp.1255 – 1263 25 Marland, F.S and E.L Smith.(1971) Subtilisins: primary structure, chemical and physical properties, p 562-608 In P.D Boyer (ed), the enzymes, vol.3 academic press Inc, 26 Material Safety Data Sheet (2003), Neutrase 0,8L, page 1-5 27 Matsuzawa H Tokugawa K, Hamaoki M., Mizoguchi M, (1988), purification and Characterization of Aqualysin I (A thermophilic Alkaline Serine Protease) Produced by Themus aquaticus YT-1, European J Biochem 171:441-117 28 Matthew D.Shoulder and Ronald T.Raines (2009), “Colalgen structure and stability”, Annual review of Biochemistry, pp.929-951 29 Michael Butzengeiger, Frankenthal, Bernd Eggersgluss, Hirschhorn (2006), Collagen hydrolysate, Patent Application Publication, US 2006/0275345 A1, Dec.7, 1-4, Trần Thị Quy 72 Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học 30 Peter Fratzl (2008), Collagen, Structure and Mechanics Springer, New York 31 Product information, Enzymatic Assay Pepsin, Sigma Quality Control Test Procedure, page 1-3, 32 Product Sheet, Enzyme Business, Flavourzyme novozymes, page 1-3, 2001 33 S.Cliche, J.Amiot, C.Avezard, C.Gariepy.(2003), Extraction and Characterization of Collagen with or without telopeptide from Chicken skin Poultry Science 82, pp 503 – 509 34 Shuai Zhao, Min Zhang, Guoying Li.(2006), Preparation of collagen from the Pigskin Shavings by Alkali Extraction.Leather Chemicals 35 Williams Wilkins.(1989) Bergey’s Manual of DeterminativeBactẻiology,.Vol4, 36 Wolfgang Friess (U.o.E., Erlangen, Germany) Collagen - biomaterial for drug delivery (1997) 37 Z.Deyl, I Miksik, A Eckhardt (2003), preparative procedures and purity assessment of collagen protein, Journal of Chromatography B, 790, 245 – 275 38 http://ivietbao.vn/The-gioi-giai-tri/Su-ky-dieu-cua-collagen/50795340/403/ 39 http://laodong.com.vn/Home/Collagen-them-huong-di-cho-ca-traVN/200912/168703.laodong 40 http://www.khoahocthuysan.org/home/forum/viewtopic.php?f=18&t=108 http://www.khoahocthuysan.org/home/index.php?language=vi&nv=news&op 42 Khoa-Hoc-Cong-Nghe/Ket-qua-khao-sat-buoc-dau-ve-kha-nang-su-dung-daca-tra-lam-nguyen-lieu-san-xuat-collagen-60 43 http://www.customs.gov.vn/lists/tinhoatdong/ViewDetails.aspx?ID=17779 44 http://en.wikipedia.org/wiki/collagen 45 http://agriviet.com/nd/573-%C3%90ac-%C3%90iem-sinh-hoc-ca-tra-va-ca-basa/ PHỤ LỤC Trần Thị Quy 73 Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học Bảng Quan hệ độ hấp phụ quang bước sóng570 nm nồng độ tyrosine Nồng độ Tyrosine (mg/ml) OD 570 nm 0,03 0.299 0,04 0.423 0,05 0.516 0,06 0.643 0,07 0.748 0,008 0.880 0,01 0.124 Đường chuẩn tyrosine – OD 570nm Bảng Quan hệ độ hấp phụ quang bước sóng570 nm nồng độ glutamic Trần Thị Quy 74 Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học Nồng độ glutamic (mg/ml) OD 570 nm 0,003 0,314 0,004 0,453 0,005 0,588 0,006 0,724 0,007 0,821 0,009 0,999 0,01 1,138 Đường chuẩn glutamic – OD 570nm Bảng Bảng phân tích thành phần da cá Trần Thị Quy 75 Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học Thành phần Giá trị (%) Độ ẩm 40,53 ± 0,005 Protein 24,31 ± 0,01 Bảng Ảnh hưởng nồng độ enzyme neutrase đến hiệu thủy phân Nồng độ E Neutrase (U/ml) 0D Hiệu suất thuỷ phân(%) 50 0.411 5.13 150 0.541 6.78 200 0.799 10.08 300 0.831 10.43 400 0.841 10.72 500 0.842 10.81 Bảng Ảnh hưởng nồng độ enzyme flavourzyme đến hiệu suất thuỷ phân protein da cá Nồng độ flavourzyme (U/g) Trần Thị Quy 0D (570nm) Hiệu suất thuỷ phân (%) 50 0.32 3.96 150 0.398 4.95 200 0.599 7.52 300 0.623 7.87 400 0.653 8.29 500 0.667 8.3 76 Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học Bảng Ảnh hưởng nồng độ hỗn hợp enzyme flavourzyme + neutrase đến hiệu thủy phân Nồng độ Neutrase 0D Hiệu suất thuỷ (U/ml)+flavourzyme (U/g) (570nm) phân(%) 50 0.562 7.13 150 0.643 8.19 200 1.045 13.45 300 1.053 13.46 400 1.059 13.51 500 1.064 13.67 Bảng Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất thuỷ phân da cá tra Nhiệt độ (0C) OD (nm) Hiệu suất (%) 40 0.791 9.85 45 0.87 10.88 50 1.1 13.85 55 0.921 10.15 60 0.799 9.81 Trần Thị Quy 77 Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học Bảng Ảnh hưởng pH đến hiệu suất thuỷ phân protein da cá tra pH OD (nm) Hiệu suất (%) 0.76 9.7 6,5 0.84 10.71 0.98 12.61 7,5 1.1 14.61 0.87 11.09 4.3 0.41 5.176 Bảng Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất thuỷ phân protein da cá tra Thời gian (h) OD (nm) Hiệu suất (%) 0.962 12.28 1.098 14.01 1.11 14.29 1.118 14.31 Bảng 10 Ma trận thực nghiệm Box-Behnken yêu tố hiệu suất thuỷ phân điều kiện khác Mẫu TN X1: Nồng độ E X2: Nhiệt độ X3: Thời gian Hiêụ suất ( %) 100 40 10.46 300 40 12.48 100 60 11.13 300 60 12.58 Trần Thị Quy 78 Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học 100 50 11.54 300 50 12.58 100 50 10.29 300 50 12.87 200 40 9.38 10 200 60 10 11 200 40 9.18 12 200 60 9.35 13 200 50 13.95 14 200 50 13.78 15 200 50 14.01 16 200 50 13.82 17 200 50 14.12 Bảng 11 Phân tích phương sai ANOVA mô hình Mức có nghĩa Thông số SS Df MS Chuẩn F Mô hình 52.14 5.79 496.38 < 0.0001 Nồng độ (A) 6.28 6.28 538.40 < 0.0001 Nhiệt độ (B) 0.30 0.30 26.07 0.0014 Thời gian(C) 0.41 0.41 35.09 0.0006 AB 0.081 0.081 6.96 0.0335 AC 0.59 0.59 50.80 0.0002 BC 0.051 0.051 4.34 0.0758 A2 5.012 E-003 5.0212E-003 0.43 0.5332 Trần Thị Quy 79 P Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học B2 22.43 22.43 1921.81 < 0.0001 C2 19.47 19.47 1668.47 < 0.0001 Residual 0.082 0.012 Lack of Fit 4.375E-003 1.458E-003 0.075 0.9700 0.019 Sai số(pure 0.077 error) 5222 SS tổng số 16 Bảng 12 Kết kiểm chứng Nồng độ Nhiệt độ Thời gian Hiệu suất Hiệu suất enzyme (U) (0C) (h) (%) LT (%)TT 200.09 50.09 1.17 14.04 13.56 200.83 50.19 1.17 13.05 13.48 200 50 14,12 14.06 200.08 50.23 1.18 13.5 13.88 200.27 49.83 1.17 14.09 14.08 TN Trần Thị Quy 80 Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học ảng 13 Bảng phân tích thành phần axit amin dịch thủy phân HPLC KLPT Tính theo Tỷ lệ phần axit Glutamic, trămaxit amin, Da mg/100g amin, % Chỉ tiêu Kết quả, phân tích mg/100g Aspartic 110,6 133 122,2 4,9 Serine 65,4 105 91,6 2,9 Glutamic 209,3 147 209,3 9,3 Glycine 605,6 75 1187 26,8 Histidine 400,8 156 377,7 17,8 Arginine 186,5 175 156,7 8,3 Threonine 64,6 119 79,8 2,9 Alanine 150,7 89 248,9 6,7 Proline 208,7 115 266,8 9,2 10 Tyrosine 16,4 181 13,3 0,7 11 Valine 44,9 117 56,4 12,0 149 11,8 0,5 STT 12 Methionin e 13 Lysine 52,7 146 53,1 2,3 14 Isoleucine 32,0 131 35,9 1,4 15 Leucine 55,9 131 62,7 2,5 41,9 165 37,3 1,9 3010,5 100 16 Phenylala nine Tổng số Trần Thị Quy 2258 81 Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội ... phát từ thực tế tiến hành đề tài: Nghiên cứu ứng dụng enzyme để thu nhận sản phẩm giàu axit amin peptid từ phế thải công nghiệp chế biến cá Mục đích đề tài: + Đưa quy trình công nghệ thu phân... nguồn collagen từ phế thải da cá tra Nội dung đề tài: + Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện xử lý da cá trước thủy phân +Nghiên cứu điều kiện thích hợp để thu phân da cá: nồng độ enzyme, nhiệt độ... sản xuất enzyme quy mô công nghiệp nước phát triển tăng trung bình hàng năm từ 5-15%, doanh thu từ sản xuất enzyme hàng năm nước khoảng 1,5 tỷ USD Những nước có công nghiệp sản xuất ứng dụng protease